基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷A的抗阿尔茨海默病活性和作用机制.pdf

山 东 科 学 第 卷 第 期 年 月出版.:./.【药理与毒理】收稿日期:基金项目:济南市“新高校 条”项目()齐鲁工业大学(山东省科学院)科教产融合试点工程项目()作者简介:时瑞碟()女硕士研究生研究方向为神经药理学:.通信作者靳梦()女博士研究员硕士生导师研究方向为神经系统疾病模型建立和神经药理学:.张秀军()男博士教授博士生导师研究方向为药理学、毒理学:.基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷 的抗阿尔茨海默病活性和作用机制时瑞碟高鑫王宝堃高代丽靳梦张秀军(.华北理工大学 心理与精神卫生学院河北 唐山.齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所 山东省科学院药物筛选技术重点实验室山东 济南)摘要:基于六水合氯化铝诱导的斑马鱼阿尔茨海默病模型探究木蝴蝶苷 的抗阿尔茨海默病活性及作用机制 将受精后 的野生型 品系斑马鱼随机分为阴性对照组/六水合氯化铝模型对照组/六水合氯化铝与/多奈哌齐阳性对照组/六水合氯化铝与不同浓度(、/)木蝴蝶苷 受试物组 斑马鱼受精后 利用明暗交替行为学实验观察不同处理组斑马鱼行为差异并分析其变化通过硫黄素 染色测定各组斑马鱼头部 斑块沉积数采用酶活测定试剂盒检测各组斑马鱼乙酰胆碱酯酶活性以实时荧光定量 检测自噬相关基因(、和)的表达变化借助分子对接技术验证木蝴蝶苷 与自噬相关蛋白(、和)结合的可靠性 结果表明木蝴蝶苷 缓解了六水合氯化铝造成的斑马鱼运动障碍降低了 斑块沉积数和乙酰胆碱酯酶活性水平使自噬相关基因的异常表达趋于正常 该研究初步揭示了木蝴蝶苷 能够缓解六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍其机制可能与激活细胞自噬有关这为木蝴蝶苷 的临床应用及其治疗阿尔茨海默病的相关研究提供了理论依据关键词:阿尔茨海默病六水合氯化铝自噬斑马鱼木蝴蝶苷 中图分类号:文献标志码:文章编号:()开放科学(资源服务)标志码():(.()第 期时瑞碟等:基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷 的抗阿尔茨海默病活性和作用机制 ()().()(/)(/)(/)(/)(/).().(、).(、).阿尔茨海默病()是一种常见的神经退行性疾病主要病理特征是细胞外 淀粉样蛋白()斑块的沉积和细胞内神经原纤维缠结的形成 的发病机制复杂多样目前广为认可的发病机制假说包括淀粉样蛋白级联假说、蛋白异常磷酸化假说、胆碱能假说等 目前针对 的治疗主要是胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐、加兰他敏和卡巴拉汀)和 甲基天冬氨酸受体拮抗剂(美金刚)这些药物虽然能在一定程度上改善 患者的行为和认知障碍但并不能治愈或者预防该疾病自噬是细胞自我降解的过程在去除错误折叠或聚集的蛋白质、清除受损细胞器等方面起着重要作用 研究表明自噬的增强能够降低人神经元细胞中 蛋白的过度磷酸化缓解 小鼠模型的记忆障碍 杜仲雄花通过调节自噬基因异常表达来改善 样症状 自噬与 病理之间存在复杂的联系这表明自噬相关蛋白(、和)可能是 治疗的重要靶点中药木蝴蝶来源于紫葳科植物木蝴蝶的干燥成熟种子具有清肺利咽、疏肝和胃等作用 木蝴蝶苷 是木蝴蝶提取而得到的一种黄酮类物质 研究表明木蝴蝶苷 具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等特性但目前还缺乏关于木蝴蝶苷 对神经系统疾病作用的研究 斑马鱼是人类疾病和药物开发的理想模型系统常用于研究、帕金森病、精神分裂症等神经退行性疾病 六水合氯化铝诱导的斑马鱼 模型是一种比较成熟的能够反映 主要特征性病理变化的体内动物模型本研究中我们使用六水合氯化铝诱导的斑马鱼 模型通过观察并记录斑马鱼的行为表现检测乙酰胆碱酯酶()的活性和 斑块沉积以及测定自噬相关基因的表达变化从而分析木蝴蝶苷 对六水合氯化铝诱导的斑马鱼 症状是否具有缓解作用并对其机制进行探究 仪器与材料.实验仪器 斑马鱼养殖系统(上海海圣公司).斑马鱼行为分析仪(法国 公司)光照培养箱(东联电子技术开发有限公司)实时荧光定量 仪器(瑞士 诊断产品有限公司)梯度 仪(美国 公司)激光扫描共聚焦显微镜(日本 公司)超微量分光光度计(上海基因生物技术国际贸易有限公司)全波长酶标仪(美国 公司).实验材料木蝴蝶苷(批号 纯度成都乐美天医药科技有限公司)六水合氯化铝(批号 山 东 科 学 年纯度.上海阿拉丁生化科技股份有限公司)盐酸多奈哌齐(批号 纯度上海阿拉丁生化科技股份有限公司)快速提取试剂盒(批号 北京艾德莱生物科技有限公司)逆转录试剂盒(批号 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)蛋白浓度测定试剂盒(批号 上海碧云天生物技术有限公司)实时荧光定量 试剂盒(批号 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)硫磺素(批号 美国 公司)活性检测试剂盒(批号南京建成生物工程研究所)苯基硫脲(批号 美国 公司).(批号上海生工生物工程有限公司)柠檬酸钠抗原修复液()(批号 北京索莱宝科技有限公司)多聚甲醛(批号 北京兰杰柯科技有限公司).斑马鱼品系野生型 品系斑马鱼由山东省科学院生物研究所提供 将成年斑马鱼饲养在恒温 的养殖系统中每天同一时间段给与 /的光照循环定点喂食两次丰年虾 将成年斑马鱼按照:的雌雄比例于前一天分别放置于鱼缸中用挡板将雌雄鱼分开并于第二天早上:抽取挡板大概 后将鱼缸中的鱼卵转移到玻璃缸中并加入 /的亚甲基蓝之后放置在恒温 的光照培养箱中培养 方法.实验分组及处理将受精后 的斑马鱼随机转移到 孔细胞培养板中之后将斑马鱼随机分为 个组:阴性对照组六水合氯化铝(/)模型对照组六水合氯化铝和不同浓度(、和 /)木蝴蝶苷 受试物共处理组六水合氯化铝和多奈哌齐(/)阳性对照组 每天给药一次之后放置在光照培养箱中培养在斑马鱼受精后 进行明暗交替行为学观察 活性检测斑马鱼头部 斑块数检测和实时荧光定量 分析自噬相关基因的表达.明暗交替行为学观察将受精后 的斑马鱼()分别吸入到 孔板中每孔加入 的养鱼水 将斑马鱼置于行为学观测箱中在 光照环境中适应 之后进行 包括 组明暗交替循环(黑暗 光照)的行为学测试 实验结束后利用 斑马鱼行为分析仪对斑马鱼的游动轨迹、游动速度和游动距离进行分析.活性检测将药物处理结束的受精后 的斑马鱼()收集在.的离心管中每管加入 的生理盐水之后用破碎机进行破碎匀浆 以 /的转速在 离心 后取上清液之后按照 蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作用全波长酶标仪测定 处的光密度值()并计算样品的蛋白浓度 之后根据 活性检测试剂盒的说明书稍作修改后进行实验 具体操作为分别吸取双蒸水、底物缓冲液和显色应用液各、配置空白管所需溶液分别吸取标准液、底物缓冲液和显色应用液各、配置标准管所需溶液分别吸取各组斑马鱼样品蛋白上清液、底物缓冲液和显色应用液各、配置不同处理组的测定溶液 之后将各组配置好的溶液振荡混匀后加入到 孔板中每个处理组 次重复 在 恒温培养箱中孵育 后每孔加入 的透明剂和 的抑制剂 在室温下放置 后使用酶标仪在 波长和.光径处测定 值之后根据各样品组的 值和浓度计算得出各处理组的 活力.斑马鱼头部 斑块数检测将受精后的斑马鱼卵收到养鱼缸之后加入 /的 苯基硫脲以抑制黑色素的形成 每天同一时间换一次液其他药物处理方法同.节所述 将 多聚甲醛处理后的受精后 的斑马鱼放入 冰箱中第 期时瑞碟等:基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷 的抗阿尔茨海默病活性和作用机制过夜 第二天使用磷酸缓冲盐缓冲液()将斑马鱼清洗 次每次 将清洗完的斑马鱼使用 的琼脂凝胶固定后进行酒精梯度脱水二甲苯透明石蜡浸润 之后将处理完的蜡块以 间距进行横切切片 脱蜡之后在室温下用 洗涤切片 重复 次 吸干水分用免疫组化笔将载玻片上的组织框起来 然后按照 :比例配制.和柠檬酸钠抗原修复液()混匀后加到框起来的组织上在 冰箱孵育 后用 清洗 次每次 用滤纸将载玻片上的 完全吸干后在免疫组化笔圈住的部分加入.硫黄素 并放入 冰箱避光过夜 第二天用 在避光环境下洗涤切片 重复 次之后用激光扫描共聚焦显微镜观察斑马鱼头部 斑块沉积状况并进行拍照 使用 .分析图像并计数斑马鱼头部 斑块沉积数.实时荧光定量 分析自噬相关基因的表达将药物处理结束的受精后 的斑马鱼()收集在.的离心管中每管加入 的裂解液之后用破碎机进行破碎匀浆 按照 快速提取试剂盒的说明书进行 提取后利用超微量分光光度计检测不同组别斑马鱼的 浓度 之后立即使用 梯度 仪将 进行逆转录将逆转录得到的 进行稀释之后根据实时荧光定量 试剂盒说明书加入相应的引物 用实时荧光定量 仪对基因进行扩增扩增结束后用 值计算各组样品基因的差异表达选用 为内参目的基因与内参基因的 差值用 表示 值为各样品的 值与 组 值平均数的差值 的相对表达量根据 相对定量法计算每组设置 个重复组 引物序列见表 表 实时荧光定量 所需引物序列信息 基因名称引物序列上游:下游:上游:下游:上游:下游:上游:下游:上游:下游:.分子对接的准备过程木蝴蝶苷 的 结构从(:/./)数据库中下载自噬相关蛋白(、和)的 结构从 (:/./)数据库下载 使用薛定谔分子对接软件对自噬相关蛋白进行加氢、去水等处理之后将自噬相关蛋白和木蝴蝶苷 进行对接以对接分数作为分子对接的结果最后借助 进行可视化分析.统计分析使用 .通过单向方差分析和双向方差分析进行统计分析结果用 表示.表示差异有统计学意义山 东 科 学 年 结果.木蝴蝶苷 具有缓解六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍作用如图()和()所示与空白对照组的斑马鱼相比六水合氯化铝模型对照组中斑马鱼的游动总距离明显变短(.)游动速度减缓 与六水合氯化铝模型对照组相比不同浓度的木蝴蝶苷 受试物(、/)与六水合氯化铝共同处理时斑马鱼的游动总距离(.)和速度均显著增加 与六水合氯化铝模型对照组相比六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组的速度和总距离有所增加其结果(.)不具有统计学意义 如图()所示在黑暗环境下不同药物处理组斑马鱼的游动距离变化与总游动距离变化具有一致性 以上结果表明木蝴蝶苷 对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍具有一定的缓解作用注:.空白对照组.空白对照组.模型对照组.模型对照组红色线为快速游动轨迹绿色线为中速游动轨迹黑色线为慢速游动轨迹图 木蝴蝶苷 对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍的影响.木蝴蝶苷 对斑马鱼头部 斑块沉积的抑制作用如图()和()所示与空白对照组相比六水合氯化铝模型对照组的斑马鱼大脑中 斑块的数明显增多(.)与六水合氯化铝模型对照组相比六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组中 斑块沉积数减少(.)六水合氯化铝和木蝴蝶苷 受试物组的 斑块沉积数显著降低(.)第 期时瑞碟等:基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷 的抗阿尔茨海默病活性和作用机制注:.空白对照组.模型对照组.模型对照组图 木蝴蝶苷 对斑马鱼头部 斑块沉积的抑制.木蝴蝶苷 对 活性的抑制作用抑制 活性可以提高脑中的乙酰胆碱水平从而改善 患者的学习记忆障碍 在本实验中研究探讨了木蝴蝶苷 对六水合氯化铝处理的斑马鱼 活性的影响 如图 所示与空白对照组相比六水合氯化铝模型对照组斑马鱼的 活性显著增加(.)与六水合氯化铝模型对照组相比六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组中斑马鱼的 活性显著降低(.)在六水合氯化铝和木蝴蝶苷 受试物组中斑马鱼的 活性也显著降低(.)且剂量与效应呈正相关注:.空白对照组.模型对照组.模型对照组图 木蝴蝶苷 对斑马鱼 活性的抑制.山 东 科 学 年.木蝴蝶苷 对自噬相关基因表达的影响如图 所示与空白对照组相比六水合氯化铝模型对照组中、和 的表达明显下调(.)如图()所示与六水合氯化铝模型对照组相比六水合氯化铝与、/木蝴蝶苷 受试物组 表达明显上调(.)如图()所示六水合氯化铝与不同浓度木蝴蝶苷(、/)受试物组中 的表达明显上调(.)如图()所示六水合氯化铝与、/木蝴蝶苷 受试物组 表达明显上调(.)如图()所示六水合氯化铝与不同浓度木蝴蝶苷(、/)受试物 的表达也明显上调(.)注:.空白对照组.空白对照组.六水合氯化铝.六水合氯化铝.六水合氯化铝图 木蝴蝶苷 对自噬相关基因表达的影响.分子对接结果通过.方法对木蝴蝶苷 与自噬相关蛋白(、和)进行分子对接得出图即(:)与木蝴蝶苷 的对接、(:)与木蝴蝶苷 的对接、(:)与木蝴蝶苷 的对接、(:)与木蝴蝶苷 的对接 木蝴蝶苷 与、和 的对接分数分别为.、.、.、.这说明木蝴蝶苷 对自噬相关蛋白发挥调控作用第 期时瑞碟等:基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷 的抗阿尔茨海默病活性和作用机制图 木蝴蝶苷 与自噬相关蛋白的对接结果.讨论与结论 是一种进行性神经退行性疾病可导致神经元丧失、脑萎缩和死亡 研究表明木蝴蝶能够改善 小鼠的学习记忆能力但具体哪些化学成分起作用还未见报道所以我们利用六水合氯化铝诱导的斑马鱼 模型去探讨木蝴蝶苷 的抗 活性 正常斑马鱼在面对突然的刺激时会表现出快速的保护反应 研究表明斑马鱼幼鱼在受精后 后暴露于明暗交替的刺激时在光亮中运动活动会突然增加 斑马鱼明暗交替行为学测试常被用来识别测定药物的神经保护活性通过评估斑马鱼的游动轨迹、游动距离和速度可以了解其神经行为效应 在本研究中明暗交替行为学测试表明与空白对照组相比六水合氯化铝模型组的斑马鱼游动速度减慢游动距离变短表明斑马鱼的认知能力受损反应迟缓不能对外界刺激做出及时的反应 而经过木蝴蝶苷 的处理这种表现有所改变这提示木蝴蝶苷 对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍具有缓解作用 的特征在于海马和新皮层中 活性升高使 患者脑内乙酰胆碱水平降低影响神经信号的传递从而损伤学习记忆能力 抑制 活性可以提高脑中的乙酰胆碱水平改善 患者的学习记忆障碍 有研究表明暴露于六水合氯化铝的斑马鱼在 /的浓度范围内显示出 活性增加运动活性缺乏 我们的研究结果表明六水合氯化铝和木蝴蝶苷 受试物组的斑马鱼 的活性水平降低这说明木蝴蝶苷 能够抑制 活性减少乙酰胆碱的水解 的细胞毒性已在众多体内和体外研究中得到证实脑实质中 斑块的沉积在 发病机制中起着核心作用 沉积会引发一系列相关反应导致 蛋白的错误折叠和组装进而将病变扩散到整个神经回路和皮层最终损害神经系统导致认知能力下降 我们的研究表明木蝴蝶苷 明显降低了 模型中斑马鱼头部的 斑块计数 以上表明木蝴蝶苷 能够缓解六水合氯化铝诱导的 样症状 为了进一步探究木蝴蝶苷 是如何发挥抗 活性的我们进行了机制探究自噬在 的生成和代谢中起重要作用与 发病进展密切相关 是酵母自噬蛋白 和 的同系物被认为是自噬体形成的标记蛋白 研究表明抑制 的表达会增加 中 的聚集从而加速神经病变 还有研究表明 患者神经元 表达明显下降 在本研究中六水合氯化铝模型组 的基因表达量明显下调六水合氯化铝和木蝴蝶苷 受试物组 的表达量上调说明木蝴蝶苷 能够促进 在细胞内部降解 具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性 和 在自噬的起始阶段发挥着重要的调控作用 六水合氯化铝模型组 和 的表达明显下调而六水合氯化铝和木蝴蝶苷 受试物组 和 的表达明显上调说明木蝴蝶苷 能够激活自噬的表达 是与自噬相关的细胞降解和再循环的必需蛋白质主要参与自噬小体的形成是调节自噬偶联系统的关键基因 研究发现 小鼠模型大脑皮层和海马体中 蛋白水平降低 六水合氯化铝模型组 的表达明显降低抑制了自噬的过程而六水合氯化铝和木蝴蝶苷 受试物组 的表达明显上调说明 激活了自山 东 科 学 年噬可能促进自噬性溶酶体的形成恢复细胞内稳态 基于分子对接初步模拟木蝴蝶苷 与自噬相关蛋白(、和)之间的分子作用机制对接分数的大小直接反应预测结果的可靠性对接分数越小表示结合活性越高 其对接分数均为负数表明木蝴蝶苷 与自噬相关蛋白(、和)具有良好的结合能力 这进一步验证了木蝴蝶苷 能对自噬相关蛋白发挥调控作用但后续仍需进一步的生物实验验证本研究通过对六水合氯化铝诱导的斑马鱼行为的观察、活性的检测以及 斑块的沉积情况预测了木蝴蝶苷 对 的潜在治疗作用 实时荧光定量 以及分子对接的结果提示木蝴蝶苷 可能通过激活自噬 从而发挥抗 活性 本研究为治疗 药物研发拓展了新思路但还需要采取哺乳动物实验及临床试验等方法做进一步的验证参考文献:.():.:./.():.:./.():.:./.():.:./.:.:./.国家药典委员会.中华人民共和国药典 年版二部.北京:中国医药科技出版社./.:.:./.鲁冰冰.木蝴蝶苷 对食管鳞癌增殖的抑制作用及其机制的研究.郑州:郑州大学.任擎宇 靳梦 商学良 等.基于网络药理学和斑马鱼模型的金盏菊缓解阿尔茨海默病症状及作用机制.中国药理学通报 ():.:./.():.:./.:.:.:./.:.():.:./.:.():.:./.().():.:./.:.:.:./.第 期时瑞碟等:基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷 的抗阿尔茨海默病活性和作用机制 .():.:./.:.():.:./.():.:./.():.:./.():.:./.任李梅 杨松 卢姝言 等.人参总皂苷在巨噬细胞.中降低脂多糖诱导的炎症和氧化应激.中国医院药学杂志 ():.:./.()():.:./.