SC∕T 7231-2019 贝类折光马尔太虫病诊断规程.pdf

ICS 65.020.30 50:才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7231-2019 贝类折光马尔太虫病诊断规程Code of diagnosis for marteiliosis of mol1usks 2019-08-01发布2019-11-01实施中华人民共和国农业农村部发布SC/T 7231-2019 日U昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业农村部植业随政管理局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳海关。本标准主要起草人:白昌明、杨冰、温智清、王崇明、黄倍、李清、万晓援、史成银、李晨、辛鲁生、余卫忠。SC/T 7231-2019 贝类折光马尔太虫病诊断规程1 范围本标准给出了贝类折光马尔太虫病(marteiliosis)诊断所需试剂和材料、器材和设备，规定了采样、PCR检测和l综合判定的要求c本标准适用于贝类样品中折光马尔太虫(Mrleiliar旷rl1lgel1:、)感染的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SC/T 7205.1 牡蜘包纳米虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法SC/T 7207.1 牡蜗马尔太虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法SC/T 7207.2 牡师马尔太虫病诊断规程第2部分:组织病理学珍断法SC/T 7207.3 牡师马尔太虫病诊断规程第3部分:透射电镜险断法3 缩略语下列缩略i吾适用于本文件。bp:碱基对(basepair)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTP曰:脱氧核糖核背三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EB:澳化乙I!走(ethidiumbromide)EDTA:乙二脏四乙酸Cetl巾nediaminetetraaceticacid)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechain reaction)SDS:十二烧基硫酸(sodiumdodecyl sufate)Taq:水生栖热菌(Thermusqual icus)TE:Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTATris HC)Tris:三控甲基氨基甲皖(trishydroxymethyl aminomethane)4 试剂和材料4.1 除非另有说明，标准rl=1使用的水为蒸饱水、去离子水或相当纯度的水。4.2 元水乙醇:分析纯。4.3 TE缓冲液的配制按附录A1二l:tA.1的规定执行。4.4 抽提缓冲液的配制按附录A.2的规定执行。4.5 蛋白酶K的配1lilJ按附录A.3的规定执行。4.6 10 mol/L乙酸锁的配制按附录A.4的规定执行。4.7 Tirs饱和酣(pH注7.8):分析纯。4.8 酣/氯仿/异戊醇(25:24:1):分析纯。4.9 氯仿/异戊醇(24:1):分析纯。4.10 1 X电泳缓冲液的配制l按附录A.5的规定执行。4.11 70%乙醉的配制按附录A.6的规定执行。SC/T 7231-2019 4.12 dNTP(各2.5 mmol/L):生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的棍合物，一200C保存，用于PCR。4.13 10XPCR缓冲液:生化试剂，无Mg2-离子，1植TqDNA聚合酶提供.-200C保存。4.14 MgC12(25 mmol/U:生化试剂，-200C保存。4.15 Tq DNA聚合酶(5U/L):生化试剂，-20oC保存。4.16 正向引物Pr4C10)lmol/U:5-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3,-20oC保存。4.17 反向引物Pr5(10mol/U:5仁CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-扩，200C保存。4.18 阳性对照:己知|受折光马尔太虫感毕陶最强蝇辑样品也70oC保存。4.19 阴性对照:己知未受折光旦尔爱虫感挚的贝樊组凯样品，三保存。4.20 PCR检测空白对4.21 琼脂糖。4.22 DNA分4.23 10 mg/mL nu 咱|叫/古JA4Fhu户。7nOQdl民dFhdphdphdhdFhdhdEUEJRUFhJ6 采样6.1 采样对象牡师等易感双壳6.2 采样数量、方法和保应符合SC/T7205.1 6.3 样品的采集稚贝(附着后至2mm)和幼贝(2mm3 cm)取内脏团;成贝(3cm)取胃、肠道、消化腺幸1闭壳肌。样品采集后分别置于1.5 mL离心管中，立即进行DNA提取操作或暂时保存于一200C的冰箱中。7 PCR检测7.1 DNA的提取7.1.1 取30mg50 mg组织样品，加人抽提缓冲液500L.充分研靡，3 7C温浴1h。提取过程同时设置阳性对照、阴性对照。7.1.2 加人2.5L 20 mg/mL蛋白酶K，至终被度100g/mL.棍匀后置于500C水浴3h，不时旋动。7.1.3 将济被冷却至室温，加入等体积平衡盼，颠倒泪合10min.于10000 r/min离心3min分离两相。7.1.4 水相移至新的1.5 mL离心管中，加入等体积酣/氯仿/异戊醉(25:24:1)，颠倒混合10min，于SC/T 7231-2019 10000 r/min离心1min分离两相。7.1.5 水相移至一新的1.5 mL离心管中，加人等体积氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒棍合10min，于10000r/min离心1min分离两相。7.1.6 水相移至一新的1.5 mL离心管中，加入100L 10 mol/L乙酸锁，由匀后，再加人2倍体积预冷元水乙醇(-200C)泪匀，一200C放置2ho 10 000 r/min离心10min.弃上清液。7.1.7 用70%乙醇洗深沉淀2次，每次10000 r/min离心5min，倾去上清液，沉淀于室温晾干。7.1.8 加入100L灭菌双蒸水济解DNA。7.1.9 若DNA样品需要保存，可熔解于100LTE缓冲液中并保存于一200C的冰箱中。7.1.10 可以采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA抽提试剂盒。7.2 PCR扩增7.2.1 PCR反应体系:按照表l的要求，加入除了qDNA聚合酶以外的各项试剂，配制成大体积的预混物，分装保存于一200C的冰箱中。11伍用前，加入相应体积的T叫DNA聚合酶，棍匀，按l个反应体系/支分装到0.2mL PCR管中。分别加入各样品的模板DNA(浓度:50 ng;.tl，100 ng/U1L，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。表1PCR反应预混物所需试剂和组成i式弃。2 5L1本系试剂终浓度10X PCR缓rl夜2.5L 1 X PCR缓冲液MgCIz(25 mmol/U 2.5L 2.5 mmol/L dNTPs(各2.5mmol/U 2.0 L 200mol汀，引物Pr4(10mol/Ll 1.0 L O.lmol/L 引物Pr5(10mol/U 1.0 L O.4mol/L 灭菌双蒸水14.7L 7丁qDNA聚合酶(5U/L)0.3L 1.5 U 洼:25L体系模板盐1L7.2.2 将上述110有DNA模板的PCR管按以下程序进行扩增:940C预变性5min;940C变性305，550C退火30日，720C延伸305，35个循环;720C延伸7min.40C保温。7.3 琼脂糖凝胶电泳及测序7.3.1 配制1.5%的琼脂糖凝胶，加入10mg/mL EB至终浓度O.5g/mL，:j;岳匀。制备琼脂糖凝胶。7.3.2 将5LPCR反应产物与lL6X载样缓冲液混匀后加人力Il样孔中。同时设立DNA分子量标准对照。7.3.3 在1V/cm5 V/cm的电压下电泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲破中的澳酣蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2 2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。7.3.4 如果观察到结果阳性，对PCR扩增产物进行测序。7.4 结果判定7.4.1 阳性对照在4 13bp处有特定条带、阴性对照在413bp处无条带且空白对照不出现任何条带，实验有效。7.4.2 检测样品在413bp处有条带，测序结果同参考序列(参见附录。进行比较，若序列符合可判断待测样品为折光马尔太虫PCR阳性。8 综合判定8.1 对已知贝类折光马尔太虫病流行区域的易感宿主(参见附录)样本，按SC/T7207.1 中组织印片的细胞学方法或SC/T7207.2中组织病理学方法规定检测结果呈阳性，且PCR检测结果阳性，贝IJ确诊为贝SC/T 7231-2019 类折光马尔太虫病。8.2 对己知贝类折光马尔太虫病流行区域和易感宿主以外的样本，按SC/T7207.1组织印片的细胞学方法或SC/T7207.2组织病理学方法规定检测结果呈阳性，且PCR和SC/T7207.3透射电镜检;911J结果均为阳性，则确险为贝类折光马尔太虫病。附录A(规范性附录)试剂配方A.1 丁E缓冲液(pH8.0)1 mol/L Tris HCl(pH 8.0)0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)加水定容至高压蒸气灭菌，40C储存。A.2 抽提缓冲液1 mol/L Tris HCl CpH 8.0)0.5 mol/L EDTA CpH 8.0)1 mg/mL JJ亮RNA酶10%SDS 加水定容至混匀.室i目储存。A.3 20 mg/mL蛋白酶K蛋白酶K水悔自于后分装于无菌离心管中(0.25mL/管)，一200(下保存。A.4 10 mol/L Z，酸银乙酸锁水加水定容至100mL，经0.45m滤膜过滤除菌。40C储存。A.5 1 x电泳缓冲液Tris 冰乙酸0.5 mol/L EDTA(p日8.0)1Jf17j(定容至室温储存。A.6 70%乙醇无水乙醉力n水30mL，也匀.定容至分装后.室混储存。10 mL 2 mL 1 000 mL 1 mL 20 mL 2 mL 5 mL 100 mL 20 mg mL HbyL 7m IAU nU48 g 1.1 mL 20 mL 1 000 mL 70 mL 100 mL SC/T 7231-2019 严d SC/T 7231-2019 A.7 10 mg/mL滇化Z链(EB)储存液6?臭化乙链(EB)10 mg 水1mL 磁力搅拌数小时以:rif保其完全溶解。室温保存于棕色瓶或用铝馅包裹的瓶中oSC/T 7231一2019附录B(资料性附录)贝类折光马尔太虫病及其病原简介8.1 贝类折光马尔太虫病也称Aber病，该病是由丝足虫门(Cercozoa)、无孔目(Paramyxida)、马尔太虫属(MrleiLia)的折光马尔太虫(MarteiLiar旷ringens)感染易感双壳贝类引起的病害。马尔太虫早期感染发生在胃、消化管和跑的上皮细胞(图B.1)，病变也主要发生在双壳贝类的消化系统.可引起生理功能紊乱。发病个体表现出体征不健康、瘦弱、能量(糖原)耗竭、消化腺变色、生长停滞和死亡等一系列症状.死亡与寄生虫子包子形成相关。i亥病全年都可能会发生，给贝类养殖业造成较大经济损失。世界动物卫生组织(OIE)(水生动物卫生法典)(2016版)将折光马尔太虫列为需通报的贝类动物病原。4.抱子体进入宿主胃肠道上皮细胞，生长为滋养细胞(nurseceU,NC)3.复制增殖初期的袍子可随血淋巴系h统抵达宿主各组革织器官运5.滋养细胞及其子细胞(daughter cell,DC)沿消化道上皮基底脱扩散侵染范围、?1.马尔太虫袍子体侵染易感宿主7.次生细胞不断分裂增殖，次生细胞中开始形成新的袍子(spoTonls,51汀，战后抱子发育成熟释放图B.1 马尔太虫不同发育阶段及其在牡蜘体内分布模式图8.2 折光马尔太虫分为()型和M型，其易感宿主种类广泛，包括欧洲牛十且lIJ1(Q.、treaedulis)、普罗旺斯牡蜘(0.ste、叮叫巾;tenti川F阳/(/)、紫贻贝CMy川11Jgll阳1阳Jus仆)和黑贻贝(XellrJ巾0bse阳盯cu.r门川.I川耳仆)。其他马尔太虫(Marleiliaspp.)还可感染智利牡蜘(0.chiLen-sis)、阿根廷牡蜘CO.ueLcluwa)矛fJ密鳞牡蜗(0.dellseLall1eLLosa)，但感染这些牡!腑的马尔太虫未被鉴定到种。在欧洲鸟尾蛤(Cerastodermaedule)、沟纹帘蛤(Rudita创decu.、salu:;)、菲律宾蛤仔(R.hiLiillarum)和l美洲牡蜗(Crassuslrea Urgl1l1c)等双壳贝类中，曾观察到包括成熟期在内不同发育阶段的类马尔太虫寄生虫。此外，一种梳足类小型节n支动物(Pracrliagrani)也显示出对折光马尔太虫的易感SC/T 7231-2019 性，且被认为在i亥寄生虫的水平传播过程中起作用。B.3 目前已知的折光马尔太虫地理分布主要集中在地中海和北大西洋沿岸，包括阿尔巴尼亚、克罗地亚、法国、希腊、意大利、摩洛哥、葡萄牙、西班牙、突尼斯和英国。受季节、养殖方式等因素的影响，折光马尔太虫在不同宿主、不同地区和不同季节的感染率变化很大，在欧洲牡师群体中可高达98%。生1:颇感染该寄生虫后，在夏季和秋季温度较高的季节，死亡率较高，一般在50%90%，死亡发生和寄生虫于包子形成过程密切相关。贻贝对寄生虫的敏感性比牡蜘低，死亡率达40%。有研究报道初次接触i亥病原的贻贝，在疫区养殖6个月后，死亡率达100%。目前我国仅有一例有关折光马尔太虫感染养殖贝类的报道，且仅为PCR扩增的阳性结果，并未引起贝类死亡。使用组织病理和lPCR检测方法，已在我国养殖紫贻贝中检测到马尔太虫样寄生虫，其18SrRNA基因与折光马尔太虫的基因相似度为88%。虽然目前我国尚无折光马尔太虫感染导致贝类死亡的报道，但随着近年来我国从折光马尔太虫病疫区国家进口鲜活贝类贸易活动的日益增多，眩类寄生虫对我国贝类养殖业构成潜在威胁。8 SC/T 7231-2019 附录C(资料性附录)折光马尔太虫PCR产物序列1 CCGCACACGT TCTICACTCC GACAGTAGCC GGTCGAAGGC TICGAAGCTA GCAGTGGTGT Pr4 61 GGCGTICGTC G1寸CGCTACGCTGTCGGAGA GTACllAGCG GG1TTCGCTA CTCGTl寸寸TA121 CGCGCCCGG CGCTCTCTGC GGGCTCGGCG ACGATCGCGC GTGCCTCCCG AGGCTGCAGA 181 CTACGCGCGA ACACACTACT CTICGC丁寸CCGATCGTCGCA AACAGGAAGC GGCTCTCATG 241 TCCGGCACGG ATAGTCGCAA TCCGTGACGC TCGTIAGAAC CGGCAACATC A丁CGTGTCGT301 CGTAGACGAT AGCACGGTAC AGTCAGGCGA GTGCTCTCGT TGCCC1TTCC CCAACGGGCG 361 TGCTGTGTIC AACAAGCGAA TAATArCAGA TCACGTCTGT CGAAACTCGC GAG Pr5 注:下划线标应为PCR引物结合位点。9