活性氧对牛乳β-乳球蛋白结构、功能特性和致敏性的影响.pdf

食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.21.003基金项目：山东省自然科学基金青年基金项目（ZR2022QC125）；青岛农业大学高层次人才基金（6651122021）作者简介：杨子滢（2002），女（蒙古），本科在读，研究方向：食品安全。*通信作者:吕良涛（1990），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品营养与安全。活性氧对牛乳-乳球蛋白结构、功能特性和致敏性的影响杨子滢，葛新宇，闫欣，杨永新，于春娣，杨庆利，吕良涛*（青岛农业大学 食品科学与工程学院，山东 青岛 266109）摘要：为分析牛乳加工过程中活性氧氧化对牛乳 茁-乳球蛋白（茁-lactoglobulin，茁-LG）结构、功能特性和致敏性的影响，以牛乳 茁-LG 为研究对象，利用圆二色谱、表面疏水性和内源荧光光谱分析活性氧氧化前后 茁-LG 结构的变化，同时测定其功能特性的变化，通过酶联免疫试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和大鼠嗜碱性细胞白血病细胞（rat basophilic leukemia cells，RBL-2H3）评价其致敏性的变化。结果表明：活性氧氧化后，茁-LG 的 琢-螺旋含量降低，二级结构更无序，表面疏水性升高，内源荧光强度降低，起泡能力和起泡稳定性增加，乳化活性降低，但乳化稳定性升高。茁-LG 的免疫球蛋白 E 结合能力和 RBL-2H3 中 茁-已糖苷酶释放率和组胺的释放量降低。表明加工过程中适当氧化可以改变牛乳 茁-LG 构象结构，从而显著改善功能特性与降低潜在致敏性。该研究为探究食品加工过程中牛乳蛋白功能特性及其致敏性的变化规律提供参考。关键词：牛乳；茁-乳球蛋白；结构；功能特性；致敏性Effects of Reactive Oxygen Species on Structure，Functional Properties andSensitization of Bovine Milk 茁-LactoglobulinYANG Ziying，GE Xinyu，YAN Xin，YANG Yongxin，YU Chundi，YANG Qingli，L譈 Liangtao*（College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）粤遭泽贼则葬糟贼：To analyze the effects of reactive oxygen species oxidation on the structure，functional properties，andsensitization of bovine milk 茁-lactoglobulin（茁-LG）during bovine milk processing，茁-LG was studied，and thechanges in the structure of 茁-LG before and after reactive oxygen species oxidation were analyzed using circulardichroism，surface hydrophobicity，and endogenous fluorescence spectroscopy.In addition，the changes infunctional properties were determined，while the changes in sensitization were evaluated by enzyme linkedimmunosorbentassay（ELISA）andratbasophilicleukemiacells（RBL-2H3）.Theresultsshowedthatafterreactiveoxygenspeciesoxidation，the琢-helixcontentof茁-LGwasreduced；thesecondarystructurewasmore disordered；the surface hydrophobicity was elevated；the intensity of endogenous fluorescence was reduced；the foamingability and stability were increased；the emulsion activity was reduced，but the emulsion stability was elevated.茁-LGs immunoglobulin E-binding ability and the content of 茁-hexosidase and histamine in RBL-2H3 werereduced.It was shown that proper oxidation during processing could alter the conformational structure of bovinemilk 茁-LG，resulting in a significant improvement of functional properties with a reduction of potentialsensitization.This study provided a reference for exploring the changing patterns of functional properties andsensitization ofbovine milkproteins during foodprocessing.运藻赠 憎燥则凿泽：bovine milk；茁-lactoglobulin；structure；functional properties；sensitization引文格式：杨子滢，葛新宇，闫欣，等.活性氧对牛乳 茁-乳球蛋白结构、功能特性和致敏性的影响J.食品研究与开发，2023，44（21）：18-25.YANG Ziying，GE Xinyu，YAN Xin，et al.Effects of Reactive Oxygen Species on Structure，Functional Properties and Sen-sitizationofBovineMilk茁-LactoglobulinJ.Food Research and Development，2023，44（21）：18-25.基础研究18食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期食物过敏已成为全球范围内重要的食品安全问题。牛乳是可能导致人类食物过敏的食品之一，严重影响了部分人群特别是婴幼儿的身体健康，轻度症状表现为腹泻、荨麻疹等，重度或引发休克反应甚至死亡1。随着牛乳及其制品的消费量逐年增加，牛乳过敏的人群也在逐渐增加2，联合国粮食及农业组织（Foodand Agriculture Organization of the United Nations，FAO）认定牛乳及其制品为“八大”致敏性食物之一3。牛乳茁-乳球蛋白（茁-lactoglobulin，茁-LG）是牛乳中的主要蛋白质成分，在牛乳乳清中占蛋白总量的 50%，分子量为 1618 kDa4，具有多方面的营养作用。茁-LG 是一种具有良好功能特性的优质蛋白质，常用其作为功能性配料在食品加工中广泛应用5。天然存在于牛乳中的 茁-LG 被认为是牛乳的主要过敏原6。由于 茁-LG 高度结构化与耐水解特性，在人体肠道内消化后仍存在部分肽段分子，从而引起过敏症状7。近年来，有研究学者探究不同加工技术对牛乳茁-LG 致敏性的影响。Jia 等8发现利用高压脉冲电场技术可导致 茁-LG 致敏性降低。Yang 等9研究表明利用低频超声可促进 茁-LG 的消化，使其致敏性降低。王明礼等10利用辐照技术对 茁-LG 进行处理，结果表明 茁-LG经过辐照加工后，其构象表位破坏，导致其致敏性降低。Fei 等11利用静态高压技术使 茁-LG 的致敏性降低。这些研究在食品产业链中为控制过敏原风险提供技术支持，但由于加工过程中化学反应众多，影响因素复杂，尚不足以阐明牛乳过敏原的变化规律。牛乳在加工过程中影响蛋白质的化学反应多样，其中氧化是非常普遍且重要的化学反应之一12。目前，有关活性氧氧化对牛乳 茁-LG 致敏性影响的研究鲜见。本研究旨在分析活性氧氧化对牛乳 茁-LG 结构、功能特性和致敏性的影响。通过聚十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elec原trophoresis，SDS-PAGE）、圆二色谱、表面疏水性、内源荧光等方法分析牛乳 茁-LG 氧化前后结构的变化；乳化性、起泡性等方法分析牛乳 茁-LG 的功能特性变化；采用酶联免疫试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），大鼠嗜碱性细胞白血病细胞（ratbasophilicleu-kemia cells，RBL-2H3）试验等方法分析牛乳 茁-LG 的致敏性变化。通过上述研究，有助于更好地了解加工过程中氧化对牛乳功能特性和致敏性的影响。1材料与方法1.1材料与试剂H2O2水溶液（3%）：商丘圣邦生物科技有限公司；牛乳 茁-LG（纯度逸90%）、标准蛋白 marker、三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、十二烷基硫酸钠（均为分析纯）：北京 Solarbio 公司；过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白 E（Immunoglobulin E，IgE）抗体：北京中杉金桥生物科技公司；三硝基苯磺酸、四甲基联苯胺、愿-苯胺-员-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、牛血清蛋白、考马斯亮蓝 G250、EMEM 培养基（含厄尔平衡盐、L-谷氨酰胺、D-缬氨酸）：美国 Sigma 公司；牛乳过敏血清（特异性 IgE 水平跃0.5 kU/L）：青岛大学附属医院；ELISA 试剂盒：美国 Minneapolis 公司。1.2仪器与设备荧光分光光度计（F2700）：日本日立公司；分光光度计（Characin V100）：英国应用物理摄影有限公司；DYY-12 电泳仪：北京六一仪器厂；Tanon 4100 凝胶成像仪：上海天能公司；CD 偏光光谱仪（J-815）：日本分光株式会社；原子力显微镜（SPM-9700HT）：日本岛津公司。1.3方法1.3.1样品处理利用超纯水将牛乳 茁-LG 溶液调整为 2 mg/mL，采用芬顿氧化体系13（100滋LFeCl3分别与 0、25、50、100 滋LH2O2混合后加入 5 mL 蒸馏水）对等体积 2 mg/mL 牛乳 茁-LG 进行氧化处理，最终 H2O2浓度分别为 0、2.5、5、10 mmol/L 4 组浓度梯度，在 37益避光环境下反应 12h。1.3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳分析参考 Sharman 等14的方法对氧化后的牛乳 茁-LG进行电泳试验。按照 4 颐 1 的体积比将样品和上样缓冲液混合，混合后的样品沸水浴 7 min 后 3 000 r/min 离心50 s。将样品按顺序装入 12%预制胶孔中，在 120 V电压下进行 SDS-PAGE 试验，待蓝线即将抛出时停止电泳。将凝胶取出后，在染色盒中加入考马斯亮蓝 R-250 染色液没过凝胶，摇床上 50 r/min 轻摇染色 2 h，倒尽染色液后用超纯水漂洗，倒入脱色液，直至凝胶上条带清晰。最后用双蒸水漂洗后，采用 Tanon 4100 凝胶成像仪拍照。1.3.3圆二色谱分析利用 CD 偏光光谱仪检测氧化前后牛乳 茁-LG 二级结构的变化15。以超纯水为空白，将氧化前后的牛乳茁-LG 样品用超纯水稀释至 0.6 mg/mL。测定参数设置为扫描波长 190260 nm，时间间隔 0.25 s，扫描速率100 nm/min。数据以平均摩尔椭圆率表示，利用JASCO 软件分析试验结果。1.3.4内源荧光强度检测根据 Ju 等16的研究方法稍有改动，将氧化的牛乳茁-LG 样品溶解于超纯水中，使得上清液中蛋白浓度调整到 0.5 mg/mL。以超纯水为空白，每个样品取 1 mL到荧光比色皿中，利用荧光分光光度计检测样品的内源荧光强度。设置参数为激发波长 295 nm，发射波长基础研究19食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期300400 nm，扫描速度 1 200 nm/min，狭缝宽度 2.5 nm。1.3.5表面疏水性测定采用 Rodriguez 等17的方法略作修改，用超纯水稀释氧化前后的牛乳 茁-LG 样品，使样品浓度为 0.050.5 mg/mL。取不同浓度的样品 1.5 mL，加入 15 滋LANS 溶液，振荡后静置 3 min，设置荧光分光光度计激发波长与发射波长分别为 370 nm 与 490 nm（狭缝校正均为 5 nm），以荧光强度对蛋白质浓度作图并外推至蛋白浓度为 0，曲线初始阶段斜率即为样品表面疏水性指数。1.3.6微观结构观察根据 Hu 等18的方法分析氧化前后 茁-LG 的微观结构变化。各组样品按体积比 1 颐 1 000 稀释，将蛋白悬浮液（10 滋L，1 滋g/mL）沉积到新鲜裂解的云母上，并在加热灯下干燥。使用 Bioscope（BS3-02）ScanAsyst 模式通过原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）在多个点进行成像。扫描尺寸和扫描频率分别为 10.0 滋m伊10.0 滋m，0.997 Hz。分析每个样品 3伊512 nm 视场下的原子力显微镜（AFM）图像。1.3.7功能特性测定1.3.7.1乳化性与乳化稳定性测定根据梁肖娜19的方法测定乳化性和乳化稳定性。用超纯水配制质量浓度 1 mg/mL 的 茁-LG 溶液，向溶液中加入体积比为 1颐4 的大豆油，15 000 r/min 匀浆 1 min后立即倒入试管中。分别于静置 0、10 min 时，在距离试管底 0.5 cm 处用移液枪吸取 50 滋L 的乳液于 5 mL0.1豫的 SDS 溶液中，充分混匀后于 500 nm 波长处测定吸光值。计算 茁-LG 的乳化活性指数（emulsificationactivity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsificationstability index，ESI）。E=2伊2.303籽伊（1-渍）伊104伊A500nm伊50S=A10A0伊100式中：E 为乳化活性指数，m2/g；S 为乳化稳定性指数，%；籽 为 茁-LG 质量浓度，g/mL；渍 为油相所占体积分数；A500nm为波长 500 nm 处的吸光值；A10为静置 10 min时乳液的吸光值；A0为静置 0 min 时乳液的吸光值。1.3.7.2起泡能力与起泡稳定性测定同样采取 1.3.7.1 中梁肖娜19的方法，取 10 mL 的茁-LG（1 mg/mL）溶液在 10 000 r/min 条件下均质匀质2 min，迅速倒入 50 mL 量筒，读取泡沫体积 V0，静置30min 后读取泡沫体积 V。计算 茁-LG 的起泡能力（foa-mingcapacity，FC）与起泡稳定性（Foamingstability，FS）。C=V0-VV伊100F=V0-VV伊V0伊100式中：C 为起泡能力，%；F为起泡稳定性，%。1.3.8酶联免疫试验参照 Liu 等20的方法，利用间接 ELISA 检测活性氧氧化对牛乳 茁-LG 的 IgE 结合能力。将各组样品在50 mmol/L 碳酸盐缓冲液中稀释至 10 滋g/mL，严格按照 ELISA 试剂盒提供的方案进行相关指标测定。1.3.9RBL-2H3 细胞试验RBL-2H3 细胞试验根据 Yang 等21的方法稍作修改。大鼠肥大细胞 RBL-2H3 接种于 EMEM 培养基中，培养基中加入 10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素与100 g/mL 链霉素，在 37 益下置于 5%CO2/95%空气环境中培养。当细胞达到 2伊106个/mL 的密度时，接种于96 孔培养板中，将细胞用来自牛乳过敏患者的血清（1 颐 10 稀释）致敏 24 h，用台氏液洗涤 3 次，在培养基中加入 100ng/mL茁-LG 进行激发。参考 Kuehn 等22的方法测定 茁-己糖苷酶的释放率。将所有样品 1 000 r/min离心 15 min 后收集上清液，采用 ELISA 试剂盒测定茁-己糖苷酶、组胺、半胱氨酰白三烯、前列腺素 D2、白介素-4 与白介素-13 的释放量。1.4数据处理本研究中所有试验平行操作 3 次，数据用平均值依标准差表示，并采用 Prism 软件作图。SPSS 19.0 软件用于试验中各组数据的单因素方差分析。2结果与分析2.1活性氧氧化牛乳 茁-LG 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析活性氧氧化 茁-LG 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图 1 所示。由图 1 可知，所用蛋白标准分子量为 11180 kDa，活性氧氧化的 茁-LG 经电泳分析后，结果显示随着氧化反应浓度的增加，茁-LG 条带向上发生轻微迁移。未经氧化的 茁-LG 在 16 kDa 处有一条蛋白条带，当芬顿4321M11kDa17kDa48kDa63kDa75kDa100kDa135kDa180kDaM 为蛋白标准分子量；1耀4 表示过氧化氢浓度分别为 0、2.5、5、10 mmol/L。图 1茁-乳球蛋白与不同浓度过氧化氢反应后产物电泳图Fig.1Electrophoresis of the products of 茁-LG after reactionwith different concentrations of hydrogen peroxide基础研究20食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期由图 2A 可知，0 mmol/L 组的牛乳 茁-LG 在 195 nm附近显示 2 个正峰，208 nm 处有一个明显的负峰。195 nm 处的正峰和 208 nm 处的负峰表示牛乳 茁-LG中存在 茁-螺旋结构。随着 H2O2浓度增加，活性氧氧化引起牛乳 茁-LG 二级结构改变，主要表现在 琢-螺旋含量减少。相关研究发现丙烯醛氧化乳球蛋白后，琢-螺旋结构也下降23。利用内源荧光光谱评估蛋白质的构象变化，对活性氧氧化牛乳 茁-LG 的荧光强度进行分析。由图 2B 可知，牛乳 茁-LG 的荧光强度的峰值 姿max 在 346 nm处，随着芬顿氧化体系浓度的增加，氧化修饰的牛乳 茁-LG荧光强度有持续下降趋势。当芬顿氧化体系浓度达到10 mmol/L 时，牛乳 茁-LG 的荧光强度的峰值相较于氧化体系浓度 0 mmol/L 组降低了 48%，姿max 从 346 nm蓝移到 342 nm。氧化后牛乳 茁-LG 引起 姿max 蓝移，推测可能是牛乳 茁-LG 分子外部处于极性环境中，色氨酸和酪氨酸残基被转移到内部非极性环境中24，这是由于活性氧氧化牛乳 茁-LG 发生聚集变化引起的。2.3活性氧氧化牛乳 茁-LG 疏水性的变化蛋白质的表面疏水性也是评估其构象变化的特征指标之一。氧化前后牛乳 茁-LG 的表面疏水性结果如图 3 所示。由图 3 可知，随着 H2O2浓度的增加，牛乳 茁-LG的表面疏水性逐渐增加。当 H2O2浓度达到 10 mmol/L时，牛乳 茁-LG 的表面疏水性是 H2O2浓度为 0 mmol/L时的2.4 倍。根据以上的结果推测芬顿体系氧化修饰的牛乳 茁-LG 产生聚集可能是由于蛋白质通过折叠使疏水基团暴露，暴露的疏水基团可以通过疏水相互作用形成聚集体25。进一步说明，蛋白质表面疏水性与疏水侧链氧化程度的强弱、蛋白质去折叠以及蛋白质聚集程度有关。2.4活性氧氧化牛乳 茁-LG 微观结构的变化使用原子力显微镜确定氧化前后牛乳 茁-LG 颗粒的聚集和表面形貌。用芬顿氧化体系处理牛乳 茁-LG的 AFM 高度图像如图 4 所示。由图 4 可知，未经氧化处理的牛乳 茁-LG 在形状周围显示并堆叠形成较厚的蛋白质层，其顶部几乎没有蛋白质聚集体。然而，当芬顿氧化体系浓度增加到 2.5 mmol/L 时，观察到少量的 茁LG 聚集体，这表明低过氧化氢氧化剂浓度诱导 茁LG 的分段聚集。随着芬顿氧化体系浓度的逐渐增加，蛋白质聚集程度增加。可能是因为蛋白质表面存在静电作用，由于正负电荷排斥放大其暴露的疏水表面，疏水表面形成聚集倾向区域，从而促进了蛋白质颗粒的聚集18。40200-20-40-60190230260波长/nm24025020021022010 mmol/L H2O25 mmol/L H2O22.5 mmol/L H2O20 mmol/L H2O2A1 6001 4001 2001 0008006004002000290370510波长/nm390 410310 330 35010 mmol/L H2O25 mmol/L H2O22.5 mmol/L H2O20 mmol/L H2O2B430 450 470 490A.圆二色谱；B 荧光强度。图 2活性氧氧化对牛乳 茁-LG 构象结构的影响Fig.2Effect of reactive oxygen species oxidation on conformational structure of bovinemilk 茁-LG12010080604020002.510H2O2浓度/（mmol/L）5*与未添加过氧化氢的对照组相比，*表示差异显著，p约0.05；*表示差异极显著，p约0.01。图 3活性氧氧化对牛乳 茁-LG 表面疏水性的影响Fig.3Effect of reactive oxygen species oxidation on surfacehydrophobicity of bovine milk 茁-LG氧化体系中H2O2浓度为 10mmol/L 时，在更高分子量的位置形成了聚合物，即在 17 kDa 左右处形成新的条带。2.2活性氧氧化牛乳 茁-LG 构象结构的变化活性氧氧化牛乳茁-LG构象结构的变化如图2所示。基础研究21食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期0.0070.41nm10.00伊10.00 滋m5.00 滋m0.0080.55nm10.00伊10.00 滋m5.00 滋mDC0.0083.65nm10.00伊10.00 滋m5.00 滋m0.0036.80nm10.00伊10.00 滋m5.00 滋mBAA 为未经氧化处理；B、C、D 分别为过氧化氢浓度 2.5、5、10 mmol/L。图 4牛乳 茁LG 的 AFM 高度图像Fig.4AFM height image of bovine milk 茁LG2.5活性氧氧化牛乳 茁-LG 功能特性的变化活性氧氧化对牛乳 茁-LG 功能特性的影响如图 5所示。由图 5A 可知，与对照组相比，添加 2.5mmol/L 过氧化氢后，牛乳 茁-LG 的 EAI 从 26.12m2/g 降至 23.36m2/g，ESI 升高至 10.11%。随着芬顿氧化体系浓度升高至10 mmol/L，EAI 降低至19.02m2/g，而 ESI 升高至12.52%。乳化活性随着芬顿氧化体系浓度的增加而降低，而乳化稳定性却升高。可能是因为过氧化氢导致 茁-LG 表面疏水性升高，亲水能力下降，吸附在油-水界面蛋白质含量减少，这是影响 茁-LG 乳化活性的关键因素，故导致 EAI 下降26。乳化稳定性提高可能归因于静置后蛋白质在分层处重排乳化形成一层高弹性膜，阻止油滴聚集上浮，从而提高乳化稳定性27。由图 5B 可知，随着过氧化氢浓度增加，牛乳 茁-LG 的 FC 及 FS 都有不同程度增高，过氧化氢浓度从0 mmol/L增加到 10 mmol/L 时，FC 由 21.47%升高至25.38%，FS 由 21.31%升高至 23.46%。可能是因为活性氧氧化使牛乳 茁-LG 的疏水基暴露在蛋白表面，同时增强其分子间相互作用，从而增强表面张力与表面弹性，FC 与 FS 得到提高28。2.6活性氧氧化牛乳 茁-LG 潜在致敏性的变化为进一步评估芬顿氧化体系对牛乳 茁-LG IgE 结合能力的影响，通过间接 ELISA 来测定与牛乳过敏患者血清的结合能力，结果如图 6 所示。由图 6 可知，相比于纯化的牛乳 茁-LG，芬顿氧化体系氧化的牛乳 茁-LG 的 IgE 结合能力降低。当芬顿氧化体系浓度为 10 mmol/L 时，牛乳 茁-LG 的 IgE 结合能力相较于氧化体系浓度为 0 mmol/L 下降了 50%。282624222018161412100H2O2浓度/（mmol/L）2.55.0353025201510507.510.0乳化稳定性乳化活性A302520151050H2O2浓度/（mmol/L）1052.50起泡稳定性起泡能力*BA.乳化活性与乳化稳定性变化；B.起泡能力与起泡稳定性变化。*表示差异显著，p约0.05；*表示差异极显著，p约0.01。图 5活性氧氧化对牛乳 茁-LG 功能特性的影响Fig.5Effect of reactive oxygen species oxidation on functionalcharacteristics of bovine milk 茁-LG1.51.00.5002.510H2O2浓度/（mmol/L）5*与未添加过氧化氢的对照组相比，*表示差异显著，p约0.05；*表示差异极显著，p约0.01。图 6活性氧氧化对牛乳 茁-LG 致敏性的影响Fig.6Effect of reactive oxygen species oxidation on sensitizationof bovine milk 茁-LG基础研究22食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期由图 7 可知，未添加过氧化氢的对照组 RBL-2H3的 茁-己糖苷酶释放率为 64.46%，组胺释放量为166.23 ng/mL，半胱氨酰白三烯释放量为 538.01 pg/mL，前列腺素 D2 释放量为 124.55 pg/mL，白介素-4 释放量为 109.56 pg/mL，白介素-13 释放量为 71.83 pg/mL，随着过氧化氢浓度升高，各细胞因子释放率或释放量逐步下降。在 茁-己糖苷酶释放率的测定中，当过氧化氢浓度为 10 mmol/L 时，茁-己糖苷酶释放率降低至80604020002.510H2O2浓度/（mmol/L）5*A20015010050002.510H2O2浓度/（mmol/L）5*B600400200002.510H2O2浓度/（mmol/L）5*C15010050002.510H2O2浓度/（mmol/L）5*D15010050002.510H2O2浓度/（mmol/L）5*E10080604020002.510H2O2浓度/（mmol/L）5*FA.茁-己糖苷酶释放率；B.组胺释放量；C.半胱氨酰白三烯释放量；D.前列腺素 D2 释放量；E.白介素-4 释放量；F.白介素-13 释放量。与未添加过氧化氢的对照组相比，*表示差异显著，p约0.05；*表示差异极显著，p约0.01。图 7RBL-2H3 细胞模型中各过敏介质对应释放率与释放量变化Fig.7Changes in cytokine release rate and content in RBL-2H3 cell model有研究表明，在氧化过程中，氨基酸侧链被修饰导致某些表位的破坏，或者修饰后产生的蛋白质发生交联，导致牛乳 茁-LG 过敏原 IgE 结合能力降低29。因此，原因可能是随着芬顿氧化体系浓度的增加，牛乳茁-LG 氨基酸侧链发生改变，引起蛋白质交联产生聚集体，破坏了其相应的过敏表位，从而引起其 IgE 结合能力下降。由于过敏原能够和 IgE 高效结合，这其中肥大细胞在IgE 介导的过敏中起到了关键的作用，是过敏反应过程中重要的效应细胞。因此，过敏反应在体外研究中常常运用大鼠嗜碱性细胞白血病细胞（RBL-2H3）作为肥大细胞模型30。采用 RBL-2H3 测定芬顿体系氧化的牛乳 茁-LG 致敏性的变化，结果如图 7 所示。基础研究23食品研究与开发圆园23 年 11 月第 44 卷第 21 期23.36%（图 7A），结果说明芬顿体系氧化的牛乳 茁-LG能够有效地抑制 RBL-2H3 释放 茁-己糖苷酶。在组胺释放量测定中，10 mmol/L 芬顿体系氧化的牛乳 茁-LG刺激细胞组胺释放量下降了 57.2 ng/mL（图 7B）。在半胱氨酰白三烯释放量的测定中，10 mmol/L 芬顿体系氧化的牛乳 茁-LG 刺激细胞后半胱氨酰白三烯释放量下降到 386.73pg/mL（图 7C），抑制率为 28.12%。在前列腺素 D2 释放量的测定中，芬顿体系氧化修饰的牛乳 茁-LG 刺激细胞后前列腺素 D2 释放量下降，尤以10 mmol/L 组最为显著，其释放量降低至 63.89 pg/mL（图 7D），抑制率达为 48.70%。白介素-4 释放量与白介素-13 释放量相较于未添加过氧化氢组均表现出显著抑制，抑制率分别为 46.54%与 32.72%（图 7E、图 7F）。上述试验结果表明芬顿体系氧化的牛乳 茁-LG 能够有效的抑制 RBL-2H3 释放活性介质和细胞因子。3结论通过活性氧氧化牛乳 茁-乳球蛋白，探究其对牛乳茁-乳球蛋白结构、功能特性和致敏性的影响。结果表明，加工过程中适当氧化可以改变牛乳 茁-LG 构象结构，从而影响其功能特性和致敏性。茁-LG 的二级结构发生显著变化，当过氧化氢浓度达到 10 mmol/L 时，表面疏水性升高至原来的 2.4 倍，内源荧光强度降低了48%，起泡能力由 21.47%升高至 25.38%，起泡稳定性由 21.31%升高至 23.46%，乳化活性由 26.12 m2/g降低至 19.02 m2/g，但乳化稳定性由 21.31%升高至23.46%。茁-LG 的 IgE 结合能力升高，RBL-2H3 中各过敏介质释放率及释放量发生显著变化。本研究为探究食品加工过程中牛乳 茁-LG 功能特性及致敏性的变化规律提供参考。参考文献：1ZHAO X L,THIJSSEN S,CHEN H B,et 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