黄芪甲苷抑制TLR4_MyD88_NF-κB信号通路对牙周炎正畸大鼠牙周组织重塑的影响.pdf

作者单位：，赤峰学院附属医院口腔科通信作者：马稔秋 ：黄芪甲苷抑制 信号通路对牙周炎正畸大鼠牙周组织重塑的影响王丹刘雨笛邵丽萍马稔秋【摘要】目的：探讨黄芪甲苷（）对牙周炎（）大鼠正畸牙齿移动（）过程中炎症反应和牙周组织重塑的影响及分子机制。方法：只 雄性大鼠纳入正常对照（）组，只用于结扎法诱导建立 模型，建模后分为 组、组、组、组，每组 只。持续喂养 周，检测牙周组织 、水平，、和 表达，分析牙周组织 通路相关蛋白表达。结果：与 组相比，组大鼠 距离、牙周组织损伤评分、多核破骨细胞数量、阳性表达、水平、和 水平以及 比值、和核 蛋白水平增加，骨组织骨体积百分比（）、骨小梁数（）和骨小梁厚度（）降低（均 ）；进一步加剧了 大鼠上述指标的变化，加重了牙周炎症反应和牙槽骨丢失。组上述指标变化向 组接近，组上述指标向 组接近。结论：可抑制炎症反应，减少 大鼠 期间的牙槽骨丢失，改善牙周组织重塑，其作用机制可能与抑制 信号通路有关。【关键词】黄芪甲苷；牙周炎；正畸牙齿移动；样受体 ；核因子 【中图分类号】【文献标志码】【】，【】：（）（）（）：（），（），：，（），（）（）（）；，：，【】；牙周炎（，）相关的骨丢失引起的牙齿移动导致的咬合改变通常通过正畸治疗得到纠正 。正 畸 牙 齿 移 动（，实用口腔医学杂志（），（）可增强细菌引起的 症并导致骨吸收增加从而破坏牙周 。样受体 （，）髓样分化因子 （，）核因子 （，）通路是主要的炎症通路，在 中可被牙周病原菌激活，控制促炎因子的产生，诱导炎症反应 。据报道，在正畸力施加过程中，水平升高，可促进 早期炎症反应 。此外，激活导致基质金属蛋白酶（，）分泌增加参与牙周重塑和牙齿移动 。黄芪甲苷（，）可通过阻断 信号通路，抑制炎症反应 。研究显示，可以减轻实验性 大鼠的炎症反应并增强免疫 。然而，迄今为止，尚未有关于 对 正畸过程中牙周重塑的影响报道。因此，本研究通过构建大鼠 模型，观察 对 大鼠牙齿移动过程中炎症反应的影响，探讨 对牙周组织重塑的影响和机制。材料与方法 动物 只 级 周龄雄性 大鼠 北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号 （京），体重（），所有动物实验均经实验动物伦理委员会批准（批准号：），符合动物伦理治疗指南。动物自由进食和饮水，饲养条件为室温（）、湿度（），光照 黑暗 。所有大鼠在实验前适应环境 。主要试剂与仪器 （纯度 ，）、抗酒石酸酸性磷酸酶（）染色液（）（北京 ）；（纯度 ，抑制剂，美国）；牙龈卟啉单胞菌（）、脂多糖（）、激活剂（）（，美国）；肿瘤坏死因子 （，）（）、白细胞介素 （，）（）、（）检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；苏木精 伊红（）染色试剂盒（，上海碧云天）；兔源一抗 （）、（）、（）、肌动蛋白（）（）、分光光度计（，美国）；荧光定量 仪（，美国）。方法 大鼠模型的建立大鼠腹腔注射 戊巴比妥钠（，）麻醉。剥开牙龈，用 不锈钢丝结扎左侧上颌第一磨牙 。另取 只大鼠为正常对照（）组，只进行麻醉，不做任何处理。大鼠持续喂养 周，观察到牙龈红肿、探诊出血和牙周袋；经 （，美国）和病理切片观察牙槽骨丢失和牙龈炎症，证实 只大鼠 模型成功建立 。模型的建立将 大鼠随机分为 组（组、组、组、组；组）。测力计将 螺旋弹簧校准到 ，正畸不锈钢丝将上颌第一磨牙结扎 。戊巴比妥钠麻醉 大鼠，去掉左上颌后牙区的结扎丝，在大鼠上颌切牙唇侧和第一磨牙的近内侧表面制作深约 的保留槽。螺旋弹簧在上颌切牙和第一磨牙之间用正畸不锈钢丝结扎。实验干预 组大鼠灌胃 的 混悬液 ，组和 组、组大鼠灌胃等量 羧甲基纤维素钠，次 ，持续 周；组大鼠在灌胃 的 混悬液的同时，每 将 （）注射到牙龈内 ，其余各组大鼠注射生理盐水。取材与指标检测 扫描和分析牙槽骨的变化每组随机选 只大鼠收集上颌骨，创建牙槽骨的三维（）图像。用 图像测量上颌第一磨牙颊侧釉牙骨质界（，）和牙槽骨嵴顶（，）之间的距离（距离），监测牙槽骨的吸收；并采用 分析软件计算缺损区（感兴趣区域，）骨体积密度（）、骨小梁数（）和骨小梁厚度（）。组织学分析上颌骨样品乙醇脱水包埋。获得连续的 厚的横切片，和 染色。在 染色中，参考文献方法 对病理损伤进行分级评分，以量化牙槽骨组织学损伤。在 染色中，染色将破骨细胞染成红色，对附着在牙槽骨表面的 阳性多核（个核）细胞进行计数。免疫组织化学染色检测牙周组织 表达组织切片脱蜡、水化后，洗涤组织切片，过氧化氢孵育后，切片与二抗（）一起孵育，显色，苏木精复染。软件（版）分析平均光密度（，），并检测 核定位。实用口腔医学杂志（），（）检测牙周组织炎症因子水平每组随机选取 只大鼠，处死后收集牙周组织，在预冷的生理盐水中匀浆，下以 离心 ；收集上清液，测量 、和 水平。检测牙周组织 、核因子 受体活化因子配体（，）和骨保护素（，）表达取剩余 只大鼠的牙周组织，保存备用。逆转录试剂盒将总 合成为 。以 为模板进行 扩增。条件：预变性 ，变性 、退火 、延伸 的 个循环。用作内参基因，评估目标基因表达（表 ）。蛋白质印迹（）分析牙周组织 通路相关蛋白表达大鼠牙周组织在 裂解液中研磨，离心收集上清液为总蛋白溶液，提取胞核蛋白。用 分离蛋白质并转移到 膜上。室温下用含有 脱脂牛奶的 （含有 ）封闭膜 后，将膜在下与如下一抗孵育过夜：（）、（）、（）、（）、（）。之后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的 二抗（）在室温下孵育 。使用 试剂盒对蛋白质条带进行可视化，软件量化条带的灰度值。结果标准化为 或 。表 用于 的引物序列 基因正向引物（）反向引物（）统计学分析所有数据分析均使用 软件。数据表示为珋 。多组间比较采用单因素方差分析（），后成对比较采用 检验。表示差异有统计学意义。结果 抑制 大鼠牙槽骨丢失与 组相比，组和 组 距离增加，、和 降低（均 ）；与 组相比，组 距离增加，、和 降低（均 ）；与 组相比，组 距离降低，、和 升高（均 ）；与 组相比，组 距离增加，、和 降低（均 ）（图 、表 ）。减轻 大鼠牙槽骨组织损伤 染色结果显示，组大鼠未发现组织病理学改变；与 组相比，组可见炎症细胞浸润遍及牙龈，轻微的牙槽突吸收，牙骨质未见损伤，组织损伤评分增加（）；与 组相比，组可观察到牙龈和牙周韧带均存在炎症细胞浸润，且伴随严重的牙骨质和牙槽突破坏，组织损伤评分增加（）；与 组相比，组炎症细胞浸润减少，牙骨质和牙槽突破坏程度减轻，组织损伤评分降低（）；与 组相比，组炎症细胞浸润加重，组织损伤评分增加（）（图 、表 ）。图 重建的上颌骨 图像 实用口腔医学杂志（），（）表 各组大鼠 距离、和 比较（珋 ，），（珋 ，）组别 距离（）（）（）注：与 组比，；与 组比，；与 组比，；与 组相比，图 各组大鼠牙周组织病理变化（，比例尺 ）（，）表 各组大鼠牙周组织损伤评分、破骨细胞数量比较（珋 ，）（珋 ，）组别组织损伤评分多核破骨细胞数量（）注：与 组比，；与 组比，；与 组比，；与 组相比，降低 大鼠牙周组织多核破骨细胞数量牙周组织 染色显示 组仅存在少量破骨细胞；与 组相比，组和 组观察到大量 阳性破骨细胞，多核破骨细胞数量增加（）；与 组相比，组多核破骨细胞数量增加（）；与 组相比，组 阳性细胞明显减少，多核破骨细胞数量降低（）；与 组相比，组 阳性细胞增多，多核破骨细胞数量增加（）（图 、表 ）。降低 大鼠牙周组织 核转位与 组相比，组和 组 阳性表达升高（），且主要表达在细胞核；与 组相比，组 阳性表达升高（），核 阳性细胞进一步增多；与 组相比，组 阳性表达降低（），核 阳性细胞明显减少；与 组相比，组 阳性表达升高（），核 阳性细胞增多（图 、表 ）。降低 大鼠牙周组织炎症因子 、和 水平与 组相比，组和 组 、和 水平升高（）；与 组相比，组 、和 水平升高（）；与 组相比，组 、和 水平降低（）；与 组相比，组上述炎症因子水平升高（）（表 ）。实用口腔医学杂志（），（）图 各组大鼠牙周组织 染色图像（，比例尺 ）（，）图 各组大鼠牙周组织 表达（，比例尺 ）（，）表 各组大鼠牙周组织 表达比较（珋 ，）（珋 ，）组别 （）抑制 大鼠牙周组织 、和 表达与 组相比，组和 组 、和 水平以及 比值升高（）；与 组相比，组 、和 水平以及 比值升高（）；与 组相比，组 、和 水平以及 比值降低（）；与 组相比，组 、和 水平以及 比值升高（）（表 ）。表 各组大鼠牙周组织 、和 水平比较（珋 ，），（珋 ，）组别 （）（）（）实用口腔医学杂志（），（）表 各组大鼠牙周组织 、和 水平比较（珋 ，），（珋 ，）组别 抑制 大鼠牙周组织 通路激活与 组相比，组和 组 、和核 蛋白水平升高（）；与 组相比，组 、和核 蛋白水平升高（）；与 组相比，组 、和核 蛋白水平降低（）；与 组相比，组 、和核 蛋白水平升高（）（表 ，图 ）。表 各组大鼠牙周组织 、蛋白水平比较（珋 ，），（珋 ，）组别 图 各组大鼠牙周组织 、蛋白表达 ，讨论 患者的咬合不正，采用的正畸治疗所涉及的机械力可能会放大牙周组织的炎症，增加骨吸收的风险 。结扎法诱导的实验性 模型是一种可靠且广泛使用的动物模型。本研究使用结扎法诱导 ，结果显示，大鼠在结扎后出现牙龈红肿、探诊出血和牙周袋，经 和病理切片观察到 距离增加，牙槽骨丢失和牙龈大面积炎症，表明成功建立了实验性 大鼠模型。进一步增强了炎症反应，加剧了 诱导的牙槽骨丢失，距离增加、炎症因子（、）水平升高和骨小梁更加疏松证明了这一点。因此，控制炎症是 正畸治疗中的重要步骤。是黄芪中的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抗心血管疾病作用。据报道，可减轻 大鼠的炎症反应 ，并且可抑制破骨细胞生成，是治疗破骨细胞相关疾病的潜在天然药物 。本研究进一步调查了 对实验性 大鼠炎症和牙周组织重塑的影响，结果表明 可减轻 大鼠的炎症反应，对具有活动性炎症的牙槽骨丢失具有保护作用。在牙周组织中，促炎细胞因子（如 、和 ）的激活会刺激结缔组织基质的降解、破骨细胞的激活和骨的再吸收 。和 染色进一步证实，可减少牙周组织炎症实用口腔医学杂志（），（）细胞浸润，减轻牙骨质和牙槽突破坏，抑制破骨细胞生成；提示，可抑制炎症反应，减少 大鼠 期间的牙槽骨丢失。细胞因子 、和 可以通过增强 的表达诱导破骨细胞活化。为了了解破骨细胞分化和形成的机制，通过 评估了牙周组织中破骨细胞生成相关基因（、）表达。在 中，与健康牙周组织相比，上调，而 下调，导致 比值增加 。在本研究中，进一步上调了 大鼠 比值；而 可降低 比值，减少破骨细胞生成，抑制骨吸收。因此，对 表达的抑制可能是 大鼠 期间破骨细胞分化、形成和骨丢失减少的重要机制。系统的失衡与 激活有关。在实验性牙齿移动期间，骨细胞中 信号传导的激活了诱导 表达来增强破骨细胞生成，从而加速正畸牙齿的移动 。在 中高表达，介导 信号传导参与 的发病机制 。主要在破骨细胞中迅速产生，响应正畸力 。激活后，可通过 快速激活在细胞质中处于静息状态的 ，促进 与其抑制蛋白 分离并转移到细胞核中，促进促炎细胞因子的释放。在本研究中，在 大鼠牙周组织中观察到 表达增加，正畸力可进一步增加 的核移位，表明在 大鼠 期间 信号通路被进一步激活。给予 干预后，大鼠牙周细胞中 的核移位大部分被阻断，同时 、和核 蛋白水平均降低；表明 可抑制 信号通路的激活。另一 个 重 要 发 现 是 牙 周 组 织 中 细 胞 外 基 质（）紊乱，大鼠牙周组织中 和 表达增加。和 的过量产生会导致在 等病理条件下加速基质降解 ，与 过程中牙周组织的炎症水平、胶原 重塑的速率和程度有关 。而 降低了 大鼠牙周组织 、表达水平。在慢性 期间，会引起单核细胞积累和分化为巨噬细胞，并通过与 相互作用诱导促炎细胞因子释放，增加 分泌 。在本 研 究 中，干 预 导 致 对 信号通路的抑制作用降低，增加了细胞核 表达，减弱了 对 大鼠 期间牙周炎症反应和 、表达的抑制作用以及对牙槽骨丢失的改善作用。研究结果提示，可能通过抑制 信号通路，减少了 大鼠 期间的牙槽骨丢失。综上所述，可抑制炎症反应，减少 大鼠 期间的牙槽骨丢失，改善牙周组织重塑，其作用机制可能与抑制 信号通路有关。本研究表明，可能是牙周组织工程和 正畸治疗中的一种新型药物。然而，本研究主要关注了破骨细胞的变化以及 信号通路，在减轻骨吸收和促进成骨方面的具体调控机制仍需进一步探索。此外，关于 用于体内实验的安全性问题，在未来的研究中将考虑采用 染色评估其对体内主要脏器的影响。参 考 文 献 ，（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，实用口腔医学杂志（），（），：，：，（）：，（）：，（）：杨伟红，黄生高，于乐蓉牙周炎大鼠正畸性牙根吸收中 、在牙周膜压力侧的表达 实用口腔医学杂志，（）：，（）：，（）：，（）：黄璐，吴燕岷环戊烯酮类前列腺素 在牙周炎微环境下对成骨 破骨的作用及可能机制 实用口腔医学杂志，（）：，（）：，（）：，（），（）：，；，；，（）：，（）：，（），（）：（收稿：修回：）实用口腔医学杂志（），（）