寒地水稻芽期耐冷性鉴定及转录组研究进展.pdf

2023 年 20 期智慧农业智慧农业导刊Journal of Smart Agriculture寒地水稻芽期耐冷性鉴定及转录组研究进展于鑫鑫，孙明阳，张宏亮，李修平*（佳木斯大学 生物与农业学院，黑龙江 佳木斯 154007）水稻的产量约占我国粮食总产量的一半，因此也被认为是我国最主要的粮食作物之一。寒地水稻具有的优质特性广受消费者喜爱。在寒地水稻生产过程中，冷害是寒地水稻在生产中重要的危害之一。在水稻的生长过程中，水稻的芽期生长发育状况也会对水稻的生长情况产生一定的影响，进而影响后期水稻的产量，所以开展对水稻芽期耐冷性的研究，对于筛选和培育出耐冷性较强的水稻种类有着很重要的经济意义。传统的耐冷性水稻品种选育有育种效率低、育种年限长的缺点。随着分子生物学技术的发展，采用分子辅助方法可以提高育种品质，缩短了育种年限，但同时也需要深入研究和掌握更为紧密连锁标记。近年来，转录组测序技术（RNA-sequencing）的发展极为迅速，该方法既揭示特定的分子机制和生理过程，也是一个深度发现并分析与相关性状关联基因的一项有效检测方法，可准确掌握关联基因的表达程度。对水稻芽期耐冷进行转录组分析，探明其分子机理，根据其多态性开发与水稻芽期耐冷性相关的 SNP 特异性引物，将其运用于水稻芽期耐冷的分子辅助育种中，可有利于耐冷品种的选育。1水稻芽期耐冷性资源鉴定1.1水稻冷害1.1.1水稻冷害概况水稻冷害是指水稻生育临界温度遇到 10益以上1低温影响，致使作物减产。低温冷害对作物生长与发育的影响是一个复杂的生物学过程，因此低温冷害不但受作物自身的遗传基因制约，同时还会受到环境影响2。水稻从播种萌发到成熟期的整个生长发育过程中，都可能会遭遇到低温冷害3。摘要：在中国，水稻是全国第一大经济作物，由于我国 60%以上的居民均以稻米为主食，因此水稻在我国粮食作物的生产规模上也具有重要作用。全世界每年有 1 500 万 hm2左右的水稻受低温威胁，然而水稻的芽期生长状况影响水稻的生长发育，所以了解寒地水稻芽期的耐冷性特征，进行水稻芽期耐冷性鉴定，是耐冷品种选育过程中亲本选择的首要任务。通过转录组分析探明水稻芽期耐冷的分子机制，根据其单核苷酸多态性特征开发水稻耐冷相关功能性 SNP 标记，将其应用于水稻芽期耐冷品种选育的分子辅助育种中，是高效选育耐冷品种的重要手段和途径。关键词：冷害；芽期；鉴定；转录组；SNP 分子标记中图分类号院S511文献标志码院A文章编号院2096-9902渊2023冤20-0010-04Abstract:In China,rice is the largest economic crop in the country.Because more than 60%of the residents in China takerice as the staple food,rice also plays an important role in the production scale of food crops in our country.About 15 millionsquare hectares of rice are threatened by low temperature every year in the world,but the growth status of rice at bud stage affectsthe growth and development of rice,so understanding the characteristics of cold tolerance of rice at bud stage and identifying coldtolerance at bud stage is the primary task of parent selection in the process of cold tolerant variety breeding.The molecularmechanism of cold tolerance in rice at bud stage was identified by transcriptome analysis,and a functional SNP marker related tocold tolerance was developed according to its single nucleotide polymorphism,and applied to the molecular-assisted breeding ofcold-tolerant varieties at bud stage,which is an important means and way for efficient breeding of cold-tolerant varieties.Keywords:chilling injury;budding stage;identification;transcriptome;SNP molecular marker第一作者简介：于鑫鑫（1998-），女，硕士研究生。研究方向为作物遗传育种与生物技术。*通信作者：李修平（1981-），女，博士，副教授。研究方向为作物遗传育种与生物技术。DOI：10.20028/j.zhnydk.2023.20.00310-2023 年 20 期智慧农业导刊Journal of Smart Agriculture智慧农业1.1.2水稻芽期冷害通过观察低温对水稻的影响，发现其会在 4 个阶段造成损伤：芽期、苗期、孕穗期和开花期4。水稻的芽期低温冷害是一种严重的气候灾害，会导致水稻的幼苗在播种后的第一片叶子上出现严重的寒冷，甚至会导致植株的死亡和腐烂5。水稻的芽期冷害通常会被分为发芽期冷害和芽期冷害，水稻发芽期的耐冷性鉴定标准一般是水稻种子在低温条件下发芽的能力，水稻芽期的耐冷性鉴定的标准一般为水稻种子萌发后在低温条件下生长发育成绿色幼苗的能力。水稻的芽期是水稻生长发育的初期，是水稻产量的基期，所以筛选芽期耐冷的水稻品种对于培育耐冷的水稻品种具有重要的意义。1.2水稻芽期耐冷性鉴定1.2.1水稻发芽期耐冷性鉴定水稻是否能进入生活史的第一步是水稻是否能萌发，温度变化对水稻发育的影响是非常显著的6，所以针对水稻发芽期的耐冷性鉴定就变得尤为重要。水稻发芽期耐冷性又称为低温发芽能力，从播种到发芽过程中受到的冷害。张坤等7认为水稻芽期耐冷性的鉴定指标是第一叶长。姚晓云等8以发芽率为评价指标，研究得出日最低温度和平均气温分别在 10益和 15益左右时，形成了较严重的发芽期低温冷害，观察双亲发芽率均存在极显著差异9。1.2.2水稻芽期耐冷性鉴定水稻芽期耐冷鉴定常用的指标为成苗率，鉴定方法参考韩龙植等10的方法，耐冷性评价为一级时，标准为所有幼苗全部诱发成绿苗。肖宇龙等11发现尽管有1耀2 个重复的成苗率达到 100%，其余也接近 100%，并且 3 个重复间出苗率并没有显著差异，所以将耐冷性极强标准改为 90%以上幼苗全部诱发成绿苗，改良后的方法可以减小实验误差。唐双勤等12在江西地区进行了一项实验，研究了 33 份早籼杂交稻品种和 8 份常规稻，并将死苗率作为主要的鉴定标准，探索出适宜早籼稻芽期耐冷性的主要鉴定方法。此外，还将材料放置在 8益的低温环境中，持续处理 10 d，并根据恢复生长的实验结果，对这些指标进行了评估，结果表明，这些指标都可以显著提升芽期耐冷性的鉴定精度。张艳梅等13通过对 140 份东北地区主栽粳稻品种的死苗率进行鉴定，发现其芽期耐冷性存在显著的差异，死苗率的变化范围在 2%98%，而且变异系数高达 78.83%。2转录组测序技术研究进展2.1转录组测序技术原理RNA-sequencing 测序（RNA-seq）是一种研究方法，可以检测特定时期细胞内所有 RNA 的序列，其中包括 mRNA 序列14。目前，RNA-seq 技术可以对生物体整个转录组进行直接分析，也能够对未知的基因体序列进行分析，该技术也成为了一种强大的工具而被植物科研界广泛应用，被用来研究植物耐冷性品种以及生物个体和病原体之间相互作用的分子差异。通过使用软件，我们可以对检测到的数据进行拼接处理，从而筛选出可靠的碱基序列，并进行基因表达、功能解析、序列结构分析以及其他信息学分析。基因研究包括统计表达、比较表达差异和聚类分析。通过 GO、KEGG、COG 等技术，功能注释可以更好地探索基因的功能，而序列结构分析则可以更加精确地检测 mRNA 的可变剪切、基因融合以及对基因结构的优化。此外，生物信息学分析也可以更加准确地揭示基因的功能，并且可以更好地理解基因体所组成的生物学信号通路的活动15。2.2转录组测序技术在水稻研究中的运用RNA-seq 技术可以用来检测特定生物学条件下的细胞或植物组织内的转录产物组成，不仅可以帮助我们更好地理解生物学中的重要功能基因组结构，而且还可以用来比较不同生物基因组之间的表达差异。其强大功能使得能够检测到任何生物的所有基因组表达，从而提供更精确的分子信号，更高效的检测能力，并且检测范围更加广泛。随着生物学检测技术的迅速发展，包括高通量 RNA 检测技术的迅速发展，使 RNA-seq 成为基因组表达和转录组分析新的重要手段16。基因组检测是一种新兴的方法，可以帮助我们更好地了解水稻对冷的响应。例如，Byun 等17科学家使用了表达 DaCBF7 基因的水稻作为样本，并使用这种方法成功地从 2 种水稻样本中提取了 9 个和 15 个冷响应基因。此外，Sperotto 等18还使用了籼稻作为样本，并使用了这种方法来探索水稻对冷的响应的机理。研究发现，耐冷材料的基因表达非常丰富，特别是那些与纤维合成、脂代谢相关的基因。此外，这种材料还拥有较强的钙离子信号传输、光合作用以及抗氧化性。Shen 等19通过 3 种不同的基因类型以及 1 种冷敏基因的转录组11-2023 年 20 期智慧农业智慧农业导刊Journal of Smart Agriculture分析，研究了材料的冷胁迫特性。研究结果显示，总计2 242 个基因类别，其中 318 个基因类别与冷胁迫相关。通过 GO 富集分析还发现，钙离子的信号传输是影响水稻耐冷性的关键因素。研究表明，RNA 解旋酶具有重要的作用，不仅有助于提高水稻的抗寒性，而且具有潜在的功效。利用 RNA-seq 完成水稻耐冷性基因和不耐冷性基因的鉴定工作，并对筛选出来的耐冷性基因进行 SNP 分子标记。3水稻SNP分子标记开发与应用3.1水稻 SNP 分子标记的特点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）是一种重要的生物学现象，可以通过染色体单个核苷酸的变异来表征，这种现象可以通过多种植物分析软件，如 Polybayes 和 SNP pipeline 来检测。然而，当没有进行基因体测序的动植物种类或测序品种数量较少时，通常可以使用电子 SNP 技术来进行测序20。3.2SNP 分子标记在水稻中的应用目前已经研究出多种 DNA 分子标记法，SSR 标记更具有优势。不过基于趋同性，进行相关的关联分析时不适用 SSRs。SNP 不仅不需要精确的 DNA 片段尺寸，还可以利用先进的自动化微阵列技术实现快速、准确的单拷贝区定位，这使得其优势远远超过 SSR。此外，由于使用双等位标记，其杂交率也会显著降低21。经分析，籼-粳杂交群体的 SNPs 分布表明，其中26.6%的 SNPs 可见，这意味着，当使用 2 个标记来分析1 个关键的基因的 QTL 标记时，仅仅使用 8 个 SNP，便可完成整个群体的分子分析，这一方法的效率比目前普遍采用的 SSR 标记更加优越22。SNP 作为一种基因表征技术，不仅能够被应用于分子标记，还能够被用来构建基因表征的遗传图谱，从而更好地识别出单核苷酸多肽的基因表征。郑向华等23的研究表明，4k-SNP 和40-SNP 能够有效地检测出 49 份品种的粳型指数，其相关系数甚至超过了 0.98，而且，当这 2 种指数相关时，之间的正相关关系非常明确，P臆0.001，相关系数达0.86。经过 SNP 技术的应用，籼粳的基因型和表型数据的结果十分一致，这也证实了该技术的可靠性。因此，使用 SNP 技术来筛选水稻的耐寒性基因，将会带来巨大的好处。3.3SNP 标记在水稻芽期耐冷中的应用唐江红5在水稻芽期耐冷性的研究中，以吉冷 1 号粳稻和密阳 23 号籼稻为亲本自交，在 F10 代中检测到了 3 个 QTL，并利用 ICIMapping4.0 构建出了 118 个SNP 标记和 177 个 SSR 标记的遗传连锁图谱，并分析出在低温环境和正常环境下所有性状出现不同程度的双向超亲分离。宋佳3对 295 份粳稻品种的萌发期进行了耐冷性的鉴定研究，对 396 个高质量 SNP 进行GWAS 分析，培育适宜低温地区直播水稻新品种，对选择和利用分子育种改进粳稻萌发期耐冷性提供理论依据。在刘友发24的研究中，使用 Y58S 与 2 号杂交，创造出“Y 两优 2 号”的高级重组自交系，并使 F14 作为模型，SNP 作为分子标记，从而创造出一个具有较强抗寒性的遗传图谱，从而可以更准确地识别出与抗寒性相关的 QTL 或基因，从而大大增强了该品种的抗寒性。张斌25通过对 550 份种质资源的分析，发现 20 000 个SNPs 标记，这些分析成果可以应用于群体的遗传学研究以及基因组关联分析，并且通过连续的回交，大大增强了籼稻不育系的苗期抗寒能力，从而大幅度地提升了杂交稻的抗寒能力。4结论就目前来看，RNA-seq 已经大量用于水稻的研究中。利用转录组测序技术结合水稻低温胁迫下耐冷性品种（系）的转录组差异进行分析，寻找关键候选基因相关基因网络和代谢途径，进而对水稻芽期耐冷性差异基因筛选和富集分析，明确水稻芽期耐冷的分子机制，挖掘与水稻耐冷相关的基因，并进行 SNP 功能标记开发，利用引起变异的 SNP 位点设计功能标记，在分子辅助育种中可以提高育种效率，加速育种技术的革新，培育出耐冷性的水稻品种，进而节省水稻的育种成本。参考文献：1 花顶，徐洪文，杨阳，等.低温胁迫下丛枝菌根对玉米根部渗透调节物质含量的影响J.黑龙江畜牧兽医，2016（17）：140-142.2 巩迎军.水稻生长早期耐冷性的 QTL 定位研究D.上海：上海师范大学，2009.3 宋佳.粳稻萌发期耐冷性鉴定及全基因组关联分析D.哈尔滨：东北农业大学，2020.4 荆豪争.云南水稻地方品种昆明小白谷重组近交系孕穗期耐冷性 QTL 定位D.武汉：华中农业大学，2014.5 唐江红.利用重组自交系检测水稻芽期和孕穗开花期耐冷性QTLD.重庆：重庆师范大学，2019.6 陈静.稻种资源耐冷性鉴定及水稻逆境反应基因 OsNADPH1 的12-2023 年 20 期智慧农业导刊Journal of Smart Agriculture智慧农业克隆D.成都：四川农业大学，2006.7 张坤，王海媛，段里成，等.持续低温对水稻芽期出苗状况的影响J.江苏农业科学，2018，46（4）：56-60.8 姚晓云，熊运华，黄永萍，等.低温环境下水稻种子活力 QTL 鉴定J.江西农业大学学报，2020，42（4）：633-640.9 金铭路，杨春刚，余腾琼，等.中国水稻微核心种质不同生育时期耐冷性鉴定及其相关分析J.植物遗传资源学报，2009，10（4）：540-546.10 韩龙植，张三元.水稻耐冷性鉴定评价方法J.植物遗传资源学报，2004（1）：75-80.11 肖宇龙，王智权，雷建国，等.一种精确鉴定和评估水稻芽期耐冷性的方法J.江西农业学报，2014，26（11）：1-5.12 唐双勤，吴自明，谭雪明，等.直播早籼稻品种芽期耐冷性鉴定研究J.作物杂志，2019（1）：159-167.13 张艳梅，王敬国，刘化龙，等.东北粳稻不同生育期耐冷性分析J.东北农业大学学报，2012，43（4）：43-49.14 LI M N，LONG R C，FENG Z R，et al.Transcriptome analy原sis of salt-responsive genes and SSR marker exploration inCarex rigescens using 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