红景天苷通过激活Nrf2_HO-1通路减轻KOA大鼠软骨退变的作用机制研究.pdf

2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 红景天苷通过激活Nrf2/HO-1通路减轻KOA大鼠软骨退变的作用机制研究杨科1，周祖山1，何彦春1，代亮1，唐超1，卫杰2（1.洪湖市中医医院 洪湖 433200；2.黄石市中医医院 黄石 435000）摘要：目的探索红景天苷（Sal）在体内外骨关节炎（OA）中的潜在作用和机制。方法将雌性雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为5组（n=10）：Sham组、KOA组，各Sal给药组。Sham组为仅接受皮肤和关节囊切口的健康大鼠，其余4组大鼠采用双侧膝关节前交叉韧带横断联合内侧半月板切除法建立膝关节OA（KOA）模型。各Sal给药组大鼠每天分别关节内注射12.5 mgkg-1、25.0 mgkg-1、50.0 mgkg-1 Sal。Sham组和KOA组以等量生理盐水代替。术后6周，通过X射线、病理染色、ELISA和免疫印迹检测Sal在KOA模型中的作用。然后通过基因敲除技术确定核因子E2相关因子2（Nrf2）在Sal作用于白细胞介素-1（IL-1）刺激的体外软骨细胞中的关键作用。结果与Sham组相比，KOA组软骨X射线骨赘病评分、国际骨关节炎研究会评分增加，关节腔积液中肿瘤坏死因子、IL-1、丙二醛水平升高和总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平降低，软骨组织Nrf2、血红素加氧酶1（HO-1）蛋白表达下调，而炎症小体NLRP3表达上调（P0.05）。而Sal治疗可逆转上述变化，尤其是Sal 50.0mgkg-1组上述指标与KOA组比较存在统计学差异（P0.05）。在IL-1刺激的原代大鼠软骨细胞实验中，Sal可以激活Nrf2/HO-1通路，抑制NLRP3和4HNE蛋白表达（P98%）和 IL-1（95%）从美国 Sigma Aldrich公司（#43866）订购。Sal剂量是根据Gao等7和Wu等6文献中提供的红景天苷在体内和体外实验中的抗损伤作用，并结合大鼠体内的药代动力学特征确定的9。在本研究中，将 12.5 mgkg-1、25 mgkg-1、50 mgkg-1剂量的Sal溶解在无菌盐水溶液中，并在使用前通过0.22 m过滤器过滤。1.2主要试剂与仪器总 抗 氧 化 能 力（T-AOC）、超 氧 化 物 歧 化 酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）试剂盒均购自中国南京建成生物工程研究所；型胶原C端交联端肽（CTX-）试剂盒、软骨寡聚基质蛋白（COMP）试剂盒购自中国上海西塘公司；肿瘤坏死因子-（TNF-）试剂盒、IL-1 试剂盒、TRIzol 试剂、SuperScript III 第一链合成试剂盒购自美国Invitrogen公司。兔抗大鼠初级抗体：NLRP3（1:100，#13158）、NAD（P）H醌氧化还原酶-1（NQO1）（1:100，#78977）购自美国 Cell Signaling Technology 公司，Nrf2（1:100，#ab62352）、,不饱和羟基烯醛（4HNE）（1:100，#ab46545）购自美国 Abcam公司，HO-1（1:100，#ADI-SPA-895）购自美国 ENZO公司；数字X光机（NKX-500）购自中国华瑞影像科技有限公司；Western blot 垂直电泳系统购自美国 Bio-Rad公司。2 方法 2.1模型的建立及分组采用双侧膝关节前交叉韧带横断（ACLT）联合内侧半月板切除（MMT）法建立膝关节OA（KOA）大鼠模型7。术前，大鼠用戊巴比妥钠（0.1 mL100 g-1，腹腔注射40 mgkg-1）麻醉。充分消毒后，切开髌韧带内侧皮肤，打开关节囊，使髌骨脱臼。弯曲膝关节暴露前交叉韧带并切断，另切断内侧半月板与胫骨平台的前部连接，以引起左膝关节不稳定。此外仅通过切开膝盖的皮肤和肌肉组织进行假手术。所有的外科手术都涉及动物的无菌技术。Lachman试验用于确认建模是否成功。用无菌生理盐水冲洗后，将伤口层层封闭消毒，肌肉注射青霉素以防止感染。造模成功后，将大鼠分为5组（n=10）：Sham组（仅接受皮肤和关节囊切口的健康大鼠）；KOA组（按上述方法建立的KOA模型大鼠）；各Sal给药组：KOA 大鼠每天分别关节内（30 L）注射 12.5 mgkg-1、25.0 mgkg-1、50.0 mgkg-1的Sal。Sham组和KOA组每天通过关节内注射（30 L）0.9%生理盐水。2.2大鼠软骨细胞的分离、培养和腺病毒感染将 Sprague-Dawley 大鼠的关节组织切成小于1 mm3的小块，用0.25 mgmL-1胰蛋白酶消化，然后用2 mgmL-1胶原酶孵育8 h。用180 m细胞过滤器过滤掉未消化的组织。悬浮液以1500 rmin-1离心10 min。台盼蓝染色细胞以评估活性（85%）。在含10%FBS（100 UmL-1青霉素和 0.1 mgmL-1链霉素）的 DMEM（37和5%CO2）中培养软骨细胞。将原代大鼠软骨细胞接种于6孔板中。在无血清DMEM中用miNrf2腺病毒（Ad-miNrf2）和错配腺病毒（Ad-Scramble）感染细胞8 h，然后改为添加10%FBS的DMEM。之后，使用IL-1（5 ngmL-1）诱导软骨细胞OA模型，加入或不加入Sal（100 molL-1）额外培养24 h。2.3检测指标及方法2.3.1微X射线成像术后6周对膝关节进行微X射线检查，以评估OA的严重程度。麻醉后，将大鼠置于数字X光机上获得X射线图像。根据影像学骨赘生物学分级系统10评估关节软骨退变：根据关节间隙、软骨表面钙化和骨赘形成，评分为0、1、2和3分别代表正常、轻度、中度和重度损伤。2.3.2病理检查术后6周，用戊巴比妥钠麻醉大鼠并处死，立即取1409 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 出关节软骨，用 4%多聚甲醛固定 48 h 以上，脱钙30天，脱水石蜡包埋。将样本切成5 m切片，脱蜡，然后进行苏木精-伊红（HE）和番红O-固绿（SO）染色，用光学显微镜观察形态学变化。采用国际骨关节炎研究会（OARSI）评分系统7评估软骨退变，总分为0-24分。其中胫骨平台内侧软骨损伤的深度和程度分为6个和4个级别，分数是通过乘以系列得出的，取平均值。2.3.3ELISA法术后6周，在全身麻醉下，用1 mL注射器收集大鼠关节腔积液，并以2000 rmin-1离心10 min。利用试剂盒检测 CTX-、COMP、TNF-、IL-1、T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px、MDA 水平。用微孔板读取器在450 nm处读取吸光度。2.3.4Western Blot法取软骨组织（10 mg）在无核糖核酸酶（含液氮）研钵中研磨，或软骨细胞（1107个），用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解。蛋白浓度通过BCA 法分析定量。取 10 g 胞核蛋白或胞质蛋白用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并将其电转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂乳将膜封闭2 h，然后在4下与一级抗体孵育过夜。用TBST洗涤3次后，在室温下将膜与HRP结合的抗兔或抗鼠抗体共孵育1 h。最后，使用ChampChemi 500系统通过增强化学发光试剂检测条带信号。2.4统计学方法数据显示为平均值标准偏差（SD）。使用 SPSS 26.0统计软件对统计学差异进行配对双尾t检验或单因素方差分析，然后进行 Bonferroni检验进行多重比较。在P0.05时，差异被认为是显著的。3 结果 3.1各组膝骨关节影像学改变软骨结构的破坏有助于骨性关节炎的进展。KOA组大鼠骨关节发生退行性改变，微X射线成像上可识别软骨丢失、关节间隙变窄、软骨下硬化、软骨下囊肿和骨刺（骨赘）。与Sham组相比，KOA组大鼠术后6周膝关节间隙明显变宽，而各Sal给药组这种形态学变化较 KOA 组减轻，关节面相对光滑，尤其是 Sal 50 mgkg-1组的关节面保存得更好（图1）。通过X射线骨赘病分级系统评估，Sal 25.0 mgkg-1组（2.500.71）、25.0 mgkg-1组（2.000.82）和 50.0 mgkg-1组（1.300.67）量化评分均低于KOA组（2.800.42），尤其是Sal 图1微X射线评估膝关节骨性关节炎的严重程度1410 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究50.0 mgkg-1组显示出显著的保护作用（P0.05）。3.2各组软骨组织病理学改变HE染色显示，Sham组正常软骨细胞排列整齐，潮线清晰，基质完整。而KOA组软骨细胞严重受损并脱落。Sal 25.0 mgkg-1组、25.0 mgkg-1组和50.0 mgkg-1组可剂量依赖性地改善软骨损伤（图2A）。此外，SO染色结果（图2B）显示，KOA组软骨组织损伤严重，红色区域（软骨组织）几乎消失。然而，与KOA组相比，各Sal组关节软骨具有更强的蛋白多糖染色和更完整的表面。与SO染色结果一致，KOA组OARSI评分（15.702.50）显著高于Sham组（0.600.52）（P0.01）。相比之下，Sal 25.0 mgkg-1组（12.703.06）、25.0m gkg-1组（8.903.04）和 50.0 mgkg-1组（3.702.79）量化评分均低于 KOA组，尤其是Sal 25.0 mgkg-1组和50.0 mgkg-1组显示出显著的保护作用（P0.05）。3.3各组关节腔积液炎症因子和CTX-II、COMP水平改变ELISA法检测结果显示，TNF-、IL-1在KOA组大鼠关节腔积液中显著升高（P0.05）。而各 Sal 组TNF-、IL-1水平均以剂量依赖性方式降低（P0.05，表 1）。此外 KOA 组大鼠关节腔积液中 CTX-及COMP水平显著升高（P0.05），但是Sal 25.0 mgkg-1组和 50.0 mgkg-1组 CTX-水平低于 KOA 组，尤其是Sal 50.0 mgkg-1组 COMP 水平与 Sham 组相比已显著表2各组关节腔积液T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px、MDA水平比较（x s，n=10，Umg prot-1）GroupShamKOASal 12.5 mgkg-1Sal 25.0 mgkg-1Sal 50.0 mgkg-1T-AOC3.430.291.070.22*1.740.29*2.110.35*#2.850.40*#SOD47.4211.2624.0412.21*30.409.85*34.8312.0142.557.83#CAT26.549.3322.0510.0223.7111.0523.809.4525.867.25GSH-Px38.4012.3316.456.17*18.957.82*26.7010.4133.7412.0#MDA4.770.257.150.78*6.581.13*6.021.07*#5.140.67#注：与Sham组比较，*P0.05；与KOA组比较，#P0.05；与Sal 12.5 mgkg-1组比较，P0.05；与Sal 25.0 mgkg-1组比较，P0.05。图2软骨组织病理学改变注：A：HE染色；B：SO染色。表1各组关节腔积液TNF-、IL-1、CTX-II、COMP水平比较（x s，n=10，ngmL-1）GroupShamKOASal 12.5 mgkg-1Sal 25.0 mgkg-1Sal 50.0 mgkg-1TNF-1.561.2632.9811.78*29.3211.20*19.038.19*#11.546.25*#IL-12.731.7541.9213.67*35.269.42*21.459.14*#14.107.86*#CTX-II0.400.222.070.44*1.750.32*1.550.31*#1.340.29*#COMP1.170.402.670.59*2.240.61*2.110.47*1.610.47#注：与Sham组比较，*P0.05；与KOA组比较，#P0.05；与Sal 12.5 mgkg-1组比较，P0.05；与Sal 25.0 mgkg-1组比较，P0.05，表1）。3.4各组关节腔积液氧化应激因子水平改变OA 大鼠关节腔积液中 T-AOC、SOD、GSH-Px 水平均下调，同时MDA水平上调（P0.05），但Sal治疗以剂量依赖性方式缓解了关节的氧化应激状态，尤其是Sal 50.0 mgkg-1组T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA水平与KOA组相比，均存在统计学差异（P0.05，表2）。3.5各组关节软骨组织 Nrf2/HO-1/NLRP3通路相关蛋白表达改变Western blot法显示，KOA组软骨组织中Nrf2蛋白表达低于Sham组，而NLRP3蛋白表达则高于Sham组（P0.05）。而Sal 25.0 mgkg-1组和Sal 50.0 mgkg-1组则逆转上述蛋白的表达变化（P0.05）。此外，Sal 50.0 mgkg-1在KOA大鼠中亦上调了一些与Nrf2相关的下游抗氧化酶，如HO-1（P0.05），但是NQO1蛋白变化不明显（图3A）。3.6Sal对软骨细胞Nrf2/HO-1/NLRP3通路相关蛋白表达的影响与 Ad-Scramble 组相比，Ad-miNrf2 组软骨细胞Nrf2 蛋白表达显著下调（P0.05，图 3B）。对于 Ad-Scramble 组细胞，IL-1 可刺激 Nrf2 及其下游基因HO-1的激活，对抗细胞氧化应激，而Sal可增强抗氧化活性（P0.05，图3C）；然而对于Ad-miNrf2组细胞，Nrf2功能的丧失导致HO-1蛋白表达下调，炎症小体NLRP3表达和脂质过氧化副产物（4HNE）表达明显增加，但是Sal的抗氧化活性则丧失（P0.05，图3B）。4 讨论 OA是一种关节退行性疾病，其病理过程伴随着促炎细胞因子、趋化因子和降解酶的表达增加1,3。此外，氧化应激会导致过度过氧化，从而加剧降解过程11。而目前治疗OA的药物有限2，在本研究中，我们证实Sal对延缓KOA大鼠模型关节软骨退变模型有显著的治疗作用，并进一步在体内和体外探讨了 Nrf2/HO-1/NLRP3信号通路在OA进展中的关键作用。ACLT+MMT法是目前最成熟的建立KOA动物模型的方法之一7,12，该手术方法可导致关节失稳，软骨快速退行性病变和严重的软骨组织炎症反应。在本研究中，我们通过ACLT+MMT建立大鼠KOA模型，X射线图像显示KOA组大鼠关节软骨结构退化，关节间隙变窄，关节表面模糊，软骨细胞严重受损并脱落。但在各Sal治疗组，上述病变得到了一定程度的修复。红景天苷是玫瑰红景天的主要生物活性成分之一，对人体健康有多种有益作用6-9。许多研究都提到，Sal参与了多种疾病的治疗，如非酒精性脂肪肝13和糖尿病性骨质疏松14。此外，体外实验研究表明，Sal能促进软骨细胞增殖，抑制IL-1诱导的细胞凋亡，并清除软骨细胞中的活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）6。同样地，本研究也发现，Sal可剂量依赖性地阻止了KOA大鼠关节面软骨和骨质破坏，并且在改善受损软骨的软骨细胞形态、软骨层结构、潮线和软骨下骨变化方面有积极作用。OA进展的主要因素是慢性炎症和关节组织中进图3Western blot检测各组关节软骨组织或大鼠原代软骨细胞Nrf2、HO-1、NLRP3蛋白表达1412 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究行性结构改变。既往已有研究证实，Sal能够抑制IL-1诱导的人OA软骨细胞基质金属蛋白酶的产生，并对 LPS 诱导的 ATDC5 细胞损伤具有保护作用15。在KOA中，Col II首先在关节表面软骨细胞周围开始裂解；随着疾病进展，基质降解发生在中部和更深的区域。基质变性主要导致蛋白多糖和Col 的丢失16。本研究检测了关节腔液中Col 降解产物CTX-和COMP的水平，以反映型胶原纤维的代谢。结果显示KOA组大鼠上述这些基质变性产物表达显著上调，而Sal治疗后且呈剂量依赖性降低。这些结果支持Sal有助于稳定软骨基质的完整性，延缓OA进展。炎性细胞因子TNF-、IL-1有助于软骨基质的氧化应激和降解17。炎症小体NLRP3在人类OA关节软骨中呈高度表达，已被确定为导致软骨降解和滑膜炎症的关键物质18。而且炎症小体可促进促炎细胞因子的表达和成熟，包括TNF-和IL-111。在这项研究中，我们观察到Sal可以剂量依赖性地降低OA诱导的NLRP3升高。Nrf2是细胞氧化还原稳态和炎症途径的关键调节因子，已被证明在OA病理生理学中发挥关键作用11,19。生理学上，Nrf2 以非活性状态与Keap1结合。在与Keap1分离后，Nrf2进入细胞核并与抗氧化反应元件结合，导致几个下游基因的表达，包括细胞保护和抗氧化基因，如 NQO1、HO-1、GSH 和SOD2，及期解毒酶，如谷胱甘肽转移酶和醛酮还原酶20。我们的数据显示，Sal可激活Nrf2和HO-1，它们可能在OA诱导过程中承受氧化应激，从而保护关节软骨免受炎症反应的损伤。同时，通过测定T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px来确定氧化还原状态；以及脂质氧化副产物MDA，所有这些数据都显示了Sal的抗氧化作用。为了进一步验证Nrf2在Sal保护作用中的关键作用，我们使用腺病毒在IL-1诱导的大鼠软骨细胞骨关节炎模型中抑制Nrf2的表达。在相同的Sal处理条件下，Nrf2基因功能丧失不能拯救炎症介质诱导的氧化应激；脂质过氧化被进一步激活，形成更多脂质过氧化代谢产物，如 4HNE 可通过上调炎症进而加重KOA21。随着氧化程度的加重，Nrf2基因敲除的OA软骨细胞中NLRP3表达显著升高。尽管SAMC在IL-1处理的软骨细胞中表现出明显的抗氧化活性，但这种作用在Nrf2基因敲除的软骨细胞中几乎被抑制。此外，在Nrf2基因敲除后，HO-1/NLRP3信号通路持续激活。总之，这些研究表明，Nrf2的激活与Sal抑制IL-1诱导的软骨细胞炎症反应表达有关。综上，本研究表明Sal在体内和体外OA模型中都具有保护作用，其作用是通过减少炎性细胞因子（TNF-、IL-1）的产生和炎症小体NLRP3的表达，从而在一定程度上防止OA过程中的软骨破坏。其分子机制之一可能是通过靶向 Nrf2/HO-1 信号通路抑制OA软骨退变和炎症反应。因此，Sal有望成为治疗OA的新型天然药物，并为治疗方案提供新线索。参考文献 21Kolasinski S L,Neogi T,Hochberg M C,et al.2019 American college of rheumatology/arthritis foundation guideline for the management of osteoarthritis of the hand,hip,and knee.Arthritis Care Res,2020,72(2):149-162.2中华医学会骨科学分会关节外科学组.骨关节炎诊疗指南(2018年版).中华骨科杂志,2018,38(12):705-715.3宋超,谢育,王冶,等.玫瑰树碱对骨关节炎及滑膜组织SIRT1-Nrf2信号活化的作用研究.实用药物与临床,2021,24(10):876-880.4Hou M Z,Zhang Y J,Zhou X F,et al.Kartogenin prevents cartilage degradation and alleviates osteoarthritis progression in mice via the miR-146a/NRF2 axis.Cell Death Dis,2021,12:483.5Peng Y J,Lu J W,Lee C H,et al.Cardamonin attenuates inflammation and oxidative stress in interleukin-1-stimulated osteoarthritis chondrocyte through the Nrf2 pathway.Antioxidants(Basel),2021,10(6):862.6Wu M Z,Hu R,Wang J W,et al.Salidroside suppresses IL-1-induced apoptosis in chondrocytes via phosphatidylinositol 3-kinases(PI3K)/Akt signaling inhibition.Med Sci Monit,2019,25:5833-5840.7Gao H,Peng L,Li C,et al.Salidroside alleviates cartilage degeneration through NF-B pathway in osteoarthritis rats.Drug Des Devel Ther,2020,14:1445-1454.8周继刚,陈茂华,李小妹,等.红景天苷通过激活3T3-L1前脂肪细胞Nrf2/HO-1信号通路及下调脂肪生成转录因子表达来抑制脂肪生成.中药药理与临床,2019,35(1):33-38.9周宇,刘延平,武丽南,等.红景天苷在大鼠体内的代谢途径研究.中草药,2018,49(7):1603-1611.10 Hau M Y T,Menon D K,Chan R J N,et al.Two-dimensional/three-dimensional EOS imaging is reliable and comparable to traditional X-ray imaging assessment of knee osteoarthritis aiding surgical management.Knee,2020,27(3):970-979.11 Chen Z M,Zhong H,Wei J S,et al.Inhibition of Nrf2/HO-1 signaling leads to increased activation of the NLRP3 inflammasome in osteoarthritis.1413 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 Arthritis Res Ther,2019,21(1):300-312.12 Luo Y Y,Li J,Wang B,et al.Protective effect of glycyrrhizin on osteoarthritis cartilage degeneration and inflammation response in a rat model.J Bioenerg Biomembr,2021,53(3):285-293.13 Hu M L,Zhang D R,Xu H Y,et al.Salidroside activates the AMP-activated protein kinase pathway to suppress nonalcoholic steatohepatitis in mice.Hepatology,2021,74(6):3056-3073.14 王泽凤,高强,朱煜,等.红景天苷调控FoxO1/-catenin通路对2型糖尿病骨质疏松大鼠的保护作用研究.中国比较医学杂志,2021,31(3):55-60.15 Liu M H,Zhang J Z,Liu W G,et al.Salidroside protects ATDC5 cells against lipopolysaccharide-induced injury through up-regulation of microRNA-145 in osteoarthritis.Int Immunopharmacol,2019,67:441-448.16 史晓伟,王东峰,邓晓丰,等.不同针刺方式对早期膝骨关节炎兔模型软骨细胞及型胶原蛋白代谢的影响.针灸临床杂志,2022,38(1):59-64.17 Wang Y,Zhang T,Yang Q,et al.Galangin attenuates IL-1-induced catabolism in mouse chondrocytes and ameliorates murine osteoarthritis.Am J Transl Res,2021,13(8):8742-8753.18 Chao-Yang G,Peng C,Hai-Hong Z.Roles of NLRP3 inflammasome in intervertebral disc degeneration.Osteoarthritis Cartilage,2021,29(6):793-801.19 Zhang Q C,Bai X H,Wang R R,et al.4-octyl Itaconate inhibits lipopolysaccharide(LPS)-induced osteoarthritis via activating Nrf2 signalling pathway.J Cell Mol Med,2022,26(5):1515-1529.20 Kubo Y,Beckmann R,Fragoulis A,et al.Nrf2/ARE signaling directly regulates SOX9 to potentially alter age-dependent cartilage degeneration.Antioxidants(Basel),2022,11(2):263.21 Basu A,Kurien B T,Tran H,et al.Strawberries decrease circulating levels of tumor necrosis factor and lipid peroxides in obese adults with knee osteoarthritis.Food Funct,2018,9(12):6218-6226.Mechanism of Salidroside in Alleviating Cartilage Degeneration in KOA Rats by Activating Nrf2/HO-1 PathwayYang Ke1，Zhou Zushan1，He Yanchun1，Dai Liang1，Tang Chao1，Wei Jie2(1.Honghu Hospital of Traditional Chinese Medicine,Honghu 433200,China；2.Huangshi Traditional Chinese Medicine Hospital,Huangshi 435000,China)Abstract:ObjectiveTo explore the potential role and mechanism of Salidroside(Sal)in osteoarthritis(OA)in vivo and in vitro.MethodsFemale Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups(n=10):Sham group,KOA group and Sal administration group.Sham group was healthy rats who only received skin and joint capsule incision.The other four groups established knee OA(KOA)model by bilateral anterior cruciate ligament transection combined with medial meniscectomy.Rats in each Sal administration group were injected with 12.5 mgkg-1,25.0 mgkg-1 and 50.0 mgkg-1 Sal every day.Sham group and KOA group were replaced by the same amount of normal saline.Six weeks after operation,the role of Sal in KOA model was detected by X-ray,pathological staining,ELISA and Western blot.Then,the effect of nuclear factor E2 related factor 2(Nrf2)by Sal treatment in interleukin-1(IL-1)stimulated chondrocytes in vitro was determined by gene-knockdown technique.ResultsCompared with Sham group,the score of cartilage X-ray osteophyte and the score of Osteoarthritis Research Society International in KOA group increased,and the levels of tumor necrosis factor,IL-1,malondialdehyde in the joint cavity fluid increased and the levels of total antioxidant capacity,superoxide dismutase and glutathione peroxidase decreased.The expression of Nrf2 and heme oxygenase 1(HO-1)protein in cartilage decreased,while the expressions of inflammasome NLRP3 increased(P0.05).Sal treatment could reverse the above changes,especially the above indexes in Sal 50.0mgkg-1 group were significantly different from those in KOA group(P0.05).In IL-1-stimulated primary rat chondrocytes in vitro,Sal could activate Nrf2/HO-1 pathway and inhibit the expressions of NLRP3 and 4HNE protein(P0.05).However,after adenovirus knockout Nrf2 gene,the effect of Sal on Nrf2/HO-1 pathway disappeared,which also had little effect on the up regulation of NLRP3 stimulated by IL-1.ConclusionSal can alleviate the cartilage degeneration in KOA rats by targeting Nrf2/HO-1 1414 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究pathway,which may become a new drug candidate for OA treatment.Keywords:Knee osteoarthritis,Salidroside,Nuclear factor E2 related factor 2,Oxidative stress,Inflammatory（责任编辑：刘玥辰）1415