红景天苷通过上调端粒酶表达延缓小鼠脑衰老的作用机制.pdf

世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，实验研究 ：基金项目：国家自然科学基金项目（）作者单位：青岛市第六人民医院医学影像科，山东 青岛 ；青岛大学医学部中西医结合中心，山东青岛 ；青岛市第六人民医院肝脏肿瘤科，山东 青岛 通信作者：乔兵，：红景天苷通过上调端粒酶表达延缓小鼠脑衰老的作用机制杨光文倪钦帅朱琳乔兵郭云良【摘要】目的研究红景天苷对衰老小鼠海马组织的影响及作用机制。方法将 个月龄 小鼠 只自然衰老鼠，按随机数字表法分为老年组、环黄芪醇组（，阳性药物）、红景天苷低剂量组（）、红景天苷高剂量组（），每组各 只。另取个月龄 小鼠 只作为青年组。老年组和青年组小鼠给予等体积生理盐水灌胃，其他组给予对应药物灌胃。采用 水迷宫试验评价小鼠的学习和记忆能力，染色和 染色观察小鼠海马神经元损伤情况，检测端粒酶逆转录酶（，）及其激活因子 的表达水平，法检测端粒酶活性。结果水迷宫实验，老年组小鼠的逃逸潜伏期明显高于青年组小鼠，差异有统计学意义（），而在目标象限停留时间和跨过平台次数则明显少于青年组小鼠，差异有统计学意义（）。与老年组比较，红景天苷组和环黄芪醇治疗组小鼠可有效降低逃逸潜伏期，差异有统计学意义（），在目标象限停留时间和跨过平台次数明显增加，差异有统计学意义（）。老年组小鼠海马神经元数量较青年组小鼠显著减少，结构不清，排列紊乱，细胞核固缩深染，小体分布不均；给予红景天苷和环黄芪醇后，小鼠海马神经元的形态结构均有不同程度的改善。与青年组小鼠比较，衰老小鼠海马组织的端粒酶活性明显降低，差异有统计学意义（）；红景天苷和环黄芪醇治疗后，衰老小鼠海马组织的端粒酶活性明显提高，差异有统计学意义（）。与青年小鼠比较，衰老小鼠海马组织中的 和 的表达明显下降，差异有统计学意义（），经红景天苷和环黄芪醇处理的小鼠海马组织中 和 的表达较衰老小鼠明显升高，差异有统计学意义（）。结论红景天苷可以通过提高端粒酶活性而延缓小鼠海马组织衰老。【关键词】红景天苷；衰老；端粒酶；端粒酶逆转录酶；小鼠【中图分类号】【文献标识码】，（，；，；，）【】（），（，），（）（）（），（），（）（），（），（），世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，（），（），（），（）【】；随着社会人口老龄化的进展，老年人群的认知功能备受关注 。端粒长度与衰老密切相关，衰老的标志之一是端粒逐渐缩短，缩短到一定长度就会引发持续的 损伤反应，导致细胞衰老和死亡 。端粒酶可以在染色体末端添加端粒重复序列来重新延长端粒，以补偿端粒磨损 。研究表明，端粒酶缺陷的小鼠伴随衰老表现出更明显的神经退行性变 。重新激活端粒酶可以改善与年龄相关的神经元损伤和认知能力 。端粒酶逆转录酶（，）是端粒酶的关键调节组分，的上调又受多种调节因子作用 ，其启动子含有多种转录因子结合位点 ，激活因子主要有原癌基因 （，）、核 因 子 （，）和雌激素受体等 ，其中 是 转录的重要调节因子。王雪睿等 报道，氯化锂能够通过调控 抑制老年痴呆模型大鼠脑细胞的凋亡。曹 艳 玲 等 发 现，环 黄 芪 醇（，）是益气类中药黄芪的苷元，可通过提高衰老小鼠体内过氧化物气化酶的活性而发挥抗衰老作用，是神经元中一种有效的端粒酶激活剂 。红景天被称为“东方神草”和“高原人参”，与刺五加、人参等同属于补益中药 ，具有补气养血、清热润肺、益智养心等功效，广泛用于抗疲劳、抗氧化、抗炎和心脑血管疾病治疗，同时具有抗衰老的功效 ，千金翼方言之“久服通神不老 。”红景天苷（，）由红景天全草或根茎中分离，是红景天实现其效用的主要成分 。实验 证 明，红 景 天 苷 可 以 改 善 学 习 和 认 知 能力 ，在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中具有重要作用 ，因而受到广泛关注。但红景天苷在神经系统衰老中的作用及其可能的机制尚不明确。本研究拟通过建立自然衰老小鼠模型，使用红景天苷进行干预，观察衰老小鼠学习记忆能力、海马神经元形态结构、端粒酶逆转录酶和端粒酶活性的变化，探讨红景天苷在衰老小鼠中的作用及可能的机制。材料与方法 材料 动物清洁级 个月龄雄性 小鼠 只，体重 ；清洁级 个月龄雄性 小鼠 只，体重 ，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：（京），动物合格证号：。小鼠于清洁级动物房饲养，温度 ，湿度 ，自由饮食。动物实验由青岛大学医学部中西医中心伦理委员会批准执行（审批号：）。试剂和仪器 （），纯度 ，购自上海源叶生物科技有限公司；（），纯度 ，购自上海源叶生物科技有限公司；端粒酶 试剂盒（），购 自 德 国 罗 氏 公 司；（，生 产 批 号：）、（）（，生产批号：）抗体，购自美国 公司；抗体（，生产批号：），购自美国 公司；垂直电泳仪（），仪（），购自美国 公司；光学显微镜（），购自日本 公司；酶标仪（），购自美国 公司。方法 分组将 只 个月龄老年小鼠按照随机数表法分为老年组、环黄芪醇组（）、红景天苷低剂量组（）、红景天苷高剂量组（），每组各 只。另取 只 个月龄小鼠作为青年组。青年组和老年组小鼠给予等体积（）量生理盐水灌胃，次 ，连续 周。分别给予红景天苷低剂量组和红景天苷高剂量组 和 灌胃，次 ，连续 周。环黄芪醇组给予 灌胃，次 ，连续 周。动物实验过程严 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，格遵守动物伦理学要求。水迷宫实验动物给药结束 周后，采用 水迷宫（）实验测试小鼠的学习和记忆能力。水池直径 ，高度 ，水温，水深 ，分为个象限。实验包括定位航行训练和空间探索实验。定位航行训练时，在一个象限中点的放置一个隐藏平台，小鼠面向池壁放入水中，自动录像系统记录小鼠找到并爬上平台所用时间（逃避潜伏期），准许小鼠在平台上停留 ，若小鼠 内未找到平台，则引导小鼠到平台上，每天每个象限重复次，所有小鼠训练 。在第 天移除平台进行探索试验，将小鼠从平台象限的对角线象限面向池壁放入池中，每只小鼠探索 ，通过视频跟踪分析系统记录游泳轨迹、跨越平台次数和在目标象限停留时间。组织病理染色水迷宫实验结束后，各组小鼠经 水合氯醛腹腔注射（）深度麻醉，经心脏灌注生理盐水和 多聚甲醛，完整取脑。常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成 厚的冠状海马组织切片。海马组织切片脱蜡和水化，根据 和 试剂盒说明染色，倒置显微镜采集海马 区图像（倍）。端粒酶活性检测用端粒酶 试剂盒提供的裂解液裂解小鼠海马组织，获得蛋白提取物，加入含有端粒酶底物的反应混合物中，转移到 仪，反应条件：，个循环，。产物用杂交缓冲液稀释后，转移到预先涂有端粒重复特异性地高辛标记探针的 孔板中，变性杂交 。随后加入抗地高辛过氧化物酶偶联物和 底物，酶标仪测定 处的吸光度。经热灭活的提取物作为阴性对照，试剂盒中提供的蛋白提取物作为阳性对照。根据阴性对照的值，吸光度值 的样品为阳性。检测分离小鼠海马组织，使用 裂解液裂解获得组织蛋白，法检测蛋白浓度。每组取 蛋白经 凝胶电泳分离，然后电转移到 膜。用 脱脂牛奶在室温封闭 。冲洗膜后，加入一抗（，）孵育过夜。冲洗膜后，加入羊抗兔二抗 （）室温反应 ，化学发光（）显色，软件分析，计算蛋白的相对表达量。统计学方法采用 统计学软件统计分析，符合正态分布的数据以均数 标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 检验。以 为差异有统计学意义。结果 各组小鼠神经行为功能比较训练 后，观察各组小鼠运动轨迹，青年组小鼠运动轨迹集中在平台所在象限，且穿越平台的轨迹较多，说明青年小鼠主要停留在平台象限。而老年组小鼠平台象限的运动轨迹稀疏，且穿越平台的轨迹较少，说明老年小鼠较少停留在平台象限。给予红景天苷和环黄芪醇处理的小鼠，平台所在象限的轨迹明显增多。进一步统计分析表明，各组小鼠的逃逸潜伏期均有所降低，但老年组小鼠明显高于青年组小鼠，差异有统计学意义（），红景天苷低、高剂量组和环黄芪醇组小鼠逃逸潜伏期较衰老组明显降低，差异有统计学意义（），红景天苷高剂量组小鼠逃逸潜伏期较红景天苷低剂量组明显降低，差异有统计学意义（）。小鼠经过训练后停留在目标象限的时间和跨过平台次数可以说明小鼠的记忆巩固程度。老年组小鼠组在目标象限停留时间和跨过平台次数较青年组小鼠明显减少，差异有统计学意义（）。给予红景天苷和环黄芪醇处理的小鼠在目标象限停留时间和跨过平台次数相较于老年组小鼠明显增加，差异有统计学意义（）。红景天苷低、高剂量组和环黄芪醇组之间比较，差异无统计学意义（）。结果见图 、表 、表 。结果表明，给予红景天苷和环黄芪醇处理后，老年小鼠的学习记忆能力均有增加。各组小鼠海马神经元病理变化 染色表明，青年组小鼠的海马 区神经元形态结构清晰，排列整齐，胞质丰富，胞核和核仁清晰，小体均匀分布。而老年组小鼠组的海马组织神经元数量减少，细胞结构不清，排列紊乱，部分细胞胞体萎缩，细胞核固缩深染，小体分布不均，部分 小体消失。经红景天苷和环黄芪醇治疗后，老年小鼠的海马组织神经元的形态结构均有不同程度的改善，部分神经元数量增加，神经元排世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，图 各组小鼠探索实验运动轨迹图 各组小鼠海马组织结构和尼氏小体（上：染色，；下：尼氏染色，）表 各组小鼠逃逸潜伏期比较（，）组别青年组 老年组 环黄芪醇组 红景天苷低剂量组 红景天苷高剂量组 注：与青年组比较，；与老年组比较，；与环黄芪醇组比较，；与红景天苷低剂量组比较，表 各组小鼠跨越平台次数和目标象限停留时间比较（）组别跨越平台次数（次）目标象限停留时间（）青年组 老年组 环黄芪醇组 红景天苷低剂量组 红景天苷高剂量组 注：与青年组比较，；与老年组比较，列较整齐，细胞结构较清晰，小体增多，分布均匀。结果说明，红景天苷在形态学上对老年小鼠的海马组织具有一定的改善作用，红景天苷可以改善衰老小鼠海马组织的神经元损伤。结果见图 。红景天苷可以提高衰老小鼠海马组织的端粒酶活性端粒酶对延缓小鼠海马组织的衰老具有重要作用，使用 法检测小鼠海马组织的端粒酶活性。结果显示，衰老小鼠海马组织的端粒酶活性（）较青年小鼠（）明显降低，差异有统计学意义（）；经红景天苷和环黄芪醇处理后，衰老小鼠海马组织的端粒酶活性较老年组小鼠明显提高，差异有统计学意义（）。红景天苷低（）、高剂量组（）和环黄芪醇组（）之间比较，差异无统计学意义（）。提示红景天苷可以提高衰老小鼠海马组织的端粒酶活性，从而延缓小鼠海马组织衰老。各组小鼠海马组织 、和 蛋白表达比较 是端粒酶活性的主要决定因素，而 受 的调节。结果表明，老年组小鼠海马组织 和 的表达较青年小鼠明 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，显降低，差异有统计学意义（），尽管总 的表达没有明显变化。经红景天苷和环黄芪醇处理的小鼠海马组织 和 的表达较老年组小鼠明显升高，差异有统计学意义（）。红景天苷低、高剂量组和环黄芪醇组之间比较，差异无统计学意义（）。结果见图 、表 。是端粒酶活性的主要决定因素，而 受 的调节。提示，红景天苷可以通过提高小鼠海马组织中 和 的蛋白表达，进而上调衰老小鼠海马组织中的端粒酶活性可能是通过上调 和 的表达而实现的，实现延缓衰老的作用。图 各组小鼠海马组织中 、和 的蛋白表达表 各组小鼠海马组织中 、和 的蛋白相对表达量比较（）组别 青年组 老年组 环黄芪醇组 红景天苷低剂量组 红景天苷高剂量组 注：与青年组比较，；与老年组比较，讨论研究表明，大脑海马组织尤其容易受到年龄的影响，大脑衰老常会出现大脑记忆和认知能力下降，而与年龄相关的记忆损伤主要由海马的连接性和可塑性变化引起的，并以不同的方式在 区、区和齿状回等区域表现，如 区特别容易患阿尔茨海默（，）。传统中药红景天为景天科大花红景天的干燥根和根茎，是珍贵的补益药材，具有非常高的药用价值，临床上广泛用于气虚乏力、胸闷气短、胸痹心痛等 。中药红景天的主要有效主要成分红景天苷具有多种药理作用 ，尤其在防治老年神经退行性疾病中具有重要作用。等 研究发现，红景天苷可以抑制 表达，从而抑制 小鼠的神经元损伤。秦丽红等 研究表明，红景天苷可以提高 模型大鼠的学习记忆能力，在水迷宫实验中可以明显缩短大鼠逃避潜伏期。黄芪属益气类中药，黄芪甲苷是气主要皂苷类成分，环黄芪醇是黄芪甲苷在肠道内的主要水解代谢产物（苷元），可提高衰老小鼠体内过氧化物气化酶的活性、降低脂质过氧化物丙二醛的水平 ，并通过上调 表达而抑制脑缺血后细胞凋亡和炎症反应 ，发挥神经保护作用，为此被实验选择环黄芪醇为阳性对照药物。本研究应用 个月龄 小鼠作为老年小鼠，经水迷宫实验表明，衰老小鼠到达隐形平台前的逃逸潜伏期相较青年小鼠明显延长，而跨越原平台位置的次数和在原平台象限的停留实验显著缩短，提示衰老小鼠的空间学习记忆能力明显下降，这符合大脑衰老的行为学表现。染色结果表明，衰老小鼠的海马组织神经元出现明显损伤，形态结构明显改变。给予低、高剂量的红景天苷干预后，可以明显减轻衰老小鼠海马 区的神经元损伤，并明显改善衰老小鼠的学习记忆能力障碍，这与抗衰老药物环黄芪醇 的作用相似，而不同剂量的红景天苷作用相似。进一步说明红景天苷可延缓衰老小鼠海马组织衰老 。有研究证实，提高端粒酶活性有望成为延缓大脑衰老的有效措施 。是端粒酶的关键结构和主要调控亚基，在端粒酶活性的表达中具有重要作用，并且 的表达亦受多种因子的调控。目前研究表明，在 基因的启动子区已发现 结合位点，可以直接与 结合，从而激活端粒酶 。本研究结果提示，低、高剂量的红景天苷均可明显提高衰老小鼠海马神经元的端粒酶活性，并且与目前已知的端粒酶激活药物环黄芪醇 提高端粒酶活性的作用效果无明显差别。采用 检测小鼠海马组织中 和 的蛋白表达情况，结果表明，红景天苷明显提高了衰老小鼠海马神经元的 蛋白表达。尽管总神经元 的表达水平没有明显变化，但红景天苷明显提高了 的磷酸化水平，这提示 是磷酸化改变可能并不是因为总 表达的变化而引起的，而是通过红景天苷活化 ，磷酸化蛋白百分比增加而引起的。这些结果也支持了 与 表达相关的报道既往报道，是 的激活剂，的磷酸化激活可以提高 的表达 。综上所述，红景天苷可能通过增强小鼠海马神经元 和 的蛋白表达、提高神经元端粒酶活性，从而改善衰老小鼠的海马神经元形态结构和学习记忆能力。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ，参考文献 马桐，马菲 端粒长度对老年人认知功能的影响 国际老年医学杂志，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：王雪睿，赵娜，刘秀霞，等 氯化锂调控端粒酶逆转录酶抗大鼠老年痴呆凋亡作用的研究 国际老年医学杂志，（）：曹艳玲，李文兰，韦灵玉，等 环黄芪醇对 半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用 中国实验方剂学杂志，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：林晓月，孙新 红景天抗衰老作用机制研究进展 中国老年学杂志，（）：孙思邈 千金翼方 上海：第二军医大学出版社，：，（）：任非非，刘敬霞 中医药促进脑缺血再灌注损伤神经重塑的优势与思考 中国中西医结合杂志，（）：，（）：，（）：王琦，刘瑜琦 中药红景天干预阿尔茨海默发病机制的研究进展 中国中西医结合杂志，（）：，（）：于冬建 红景天药理学研究及临床作用新进展 中医临床研究，（）：屈糰癑，魏小东，赛曼，等 大花红景天化学成分的研究 中成药，（）：，（）：秦丽红，秦丽微，王国辉，等 红景天对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力及海马 通路的影响 中国老年学杂志，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）（），（）：（收稿日期：）