红须腹菌多糖的提取、羧甲基化修饰及免疫活性研究.pdf

第 卷第 期 年 月南京师大学报(自然科学版)()收稿日期:.基金项目:浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室开放基金项目.通讯作者:陶明煊硕士副教授研究方向:生物活性物质及保健功能因子.:.:./.红须腹菌多糖的提取、羧甲基化修饰及免疫活性研究黄馨阅丁慧敏马士玄王秋艳陶明煊(南京师范大学食品制药与工程学院江苏 南京)摘要 红须腹菌(.)是一类主要分布于中国云南省及福建省的根须腹菌属食用菌.本文以红须腹菌为原料提取红须腹菌多糖再加以羧甲基化修饰并通过体内动物实验对两种多糖的免疫活性进行比较研究.采用水提醇沉法提取红须腹菌多糖并通过氢氧化钠氯乙酸体系对多糖进行羧甲基化修饰.以小鼠血清细胞因子含量血细胞数量单核巨噬细胞吞噬能力及脏器组织形态作为指标评价两种多糖的免疫活性.研究结果表明红须腹菌多糖总糖含量为.羧甲基的取代度为.红须腹菌多糖及羧甲基多糖均对环磷酰胺造成的小鼠脏器指数下降部分血清细胞因子含量减少造血功能及巨噬细胞吞噬能力减弱以及脾脏和胸腺的组织损伤有较为显著的缓解作用其中以羧甲基多糖效果更佳.这表明红须腹菌多糖及羧甲基化多糖均具有一定的免疫调节功效且羧甲基化多糖的体内免疫活性更为显著.关键词 红须腹菌多糖羧甲基化修饰免疫调节活性中图分类号.文献标志码 文章编号()(.)():(.).(.)().().().:(.)红须腹菌(.)又名红包根菌归属于腹菌纲层腹菌目腹菌科根须腹菌属一般生长于针叶树下为树木外生菌.红须腹菌子实体中富含多种物质如蛋白质多糖酚类等.研究显示该菌具有一定的抗癌活性.但目前有关红须腹菌结构修饰及其免疫调节活性方面的研究鲜有报道.本研究采用超声波辅助热水浸提法提取红须腹菌多糖同时利用氢氧化钠氯乙酸体系对其进行羧甲基化修饰并通过体内动物实验研究了两种多糖可能的免疫调节功效以期为红须腹菌多糖类保健品的开发提供实验基础和理论参考从而促进红须腹菌的深度开发利用.黄馨阅等:红须腹菌多糖的提取、羧甲基化修饰及免疫活性研究 材料与方法.实验动物和材料红须腹菌(.)子实体购自大理市云芝之家.雄性小鼠体重 只许可证编号(苏)购自杭州子源实验动物科技有限公司.上海源叶生物科技有限公司葡萄糖标准品国药集团化学试剂有限公司香菇多糖上海源叶生物科技有限公司注射用环磷酰胺百特肿瘤制药有限公司 试剂盒南京建成生物工程研究所.其他试剂均为分析纯.仪器与设备 超声波细胞破粹机宁波新芝生物科技股份有限公司 旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂 振荡培养箱上海知楚仪器有限公司 型全自动生物组织包埋机浙江金华益迪医疗设备厂 石蜡切片机德国 公司 酶标仪上海东风电讯仪器厂 血液分析仪美国 公司.实验方法.红须腹菌多糖的制备.提取方法将红须腹菌子实体置于 恒温干燥箱中烘干至恒重粉碎后过 目筛.取 红须腹菌干粉按料液比 加入蒸馏水进行超声破碎().水浴浸提 后离心()取上清液减压浓缩至原体积的四分之一.用总浓度为 的乙醇沉淀多糖 静置 后离心()收集沉淀物于 烘箱中烘干至恒重.沉淀物复溶后通过 法去除蛋白质重复操作多次直至复溶液中无明显蛋白层.复溶液减压蒸发除去有机试剂后流水透析(截留量为 )冷冻干燥后得到红须腹菌粗多糖.红须腹菌多糖的分离和纯化取 /红须腹菌粗多糖溶液以 /的流速通过 进行分离使用./作为洗脱液每管收集 .收集的样品采用苯酚硫酸法进行隔管检测绘制 洗脱曲线收集洗脱峰管中液体浓缩至适当体积后透析(截留量为 )并进行冷冻干燥.干燥后的样品继续用 进行分离.采用蒸馏水以./的流速进行洗脱每管收集 收集洗脱峰管中的液体进行蒸发浓缩冷冻干燥得到红须腹菌纯化多糖样品.总糖含量的测定总糖含量的测定采用苯酚硫酸法以无水葡萄糖作为标准品.标准曲线的制作:称取恒重的无水葡萄糖 用蒸馏水溶解后于 容量瓶中进行定容.取./葡萄糖溶液于试管中蒸馏水补齐至.加入.苯酚涡旋混匀再加入.浓硫酸摇匀后室温静置 以第一管作为空白于 处测定吸光度以葡萄糖浓度(/)为横坐标吸光度 为纵坐标绘制标准曲线.多糖样品中的总糖含量测定:取.多糖溶液加入.苯酚摇匀后沿管壁加入.浓硫酸振荡摇匀静置 后于 处测定吸光度代入标准曲线计算总糖含量.羧甲基化多糖的制备.制备方法红须腹菌纯多糖的羧甲基化修饰根据文献报道的方法进行适当修改.称取.纯化多糖用 无水乙醇进行搅拌溶解 在 下加入 溶液搅拌 .最后再加入.氯乙酸进行醚化 搅拌 冷却至室温后冰乙酸调 至中性蒸馏水透析(截留量为 )减压浓缩至原体积的四分之一加入四倍体积 乙醇进行醇沉离心()后取沉淀用蒸馏水冲洗冷冻干燥后得到羧甲基化多糖.南京师大学报(自然科学版)第 卷第 期(年).羧甲基取代度的测定参照文献报道的方法并对其进行一定的修改.准确称取 纯多糖加入 /进行溶解搅拌.后离心去除上清液残渣用甲醇冲洗多次后溶于 ./溶液中 水浴至完全溶解用./进行滴定酚酞作为指示剂以溶液中红色消失作为滴定终点.取代度.().()()式中为 浓度为 体积为 浓度为消耗的 体积.红须腹菌多糖及羧甲基化多糖的红外光谱()测定取 多糖经 压片后利用傅里叶红外光谱仪在 波长范围内进行扫描(仪器分辨率为 扫描 次).小鼠模型的建立与分组表 动物分组及给药 组别腹腔注射(第 )灌胃(第 )空白对照组生理盐水生理盐水模型对照组 /生理盐水阳性对照组 /低剂量组 /高剂量组 /低剂量组 /高剂量组 /参照文献将 只五周龄 雄性小鼠随机均分为空白对照组实验组(模型对照组阳性对照组纯多糖低、高剂量组羧甲基多糖低、高剂量组)共 组.给药情况如表 所示.给药 结束后各组小鼠禁食 称量体重颈椎处死小鼠.脾脏和胸腺组织形态学的观察取小鼠脾脏和胸腺放入 多聚甲醛溶液中进行固定经洗涤、脱水、透明、浸蜡后进行包埋、切片.石蜡切片经脱蜡后用不同梯度浓度的乙醇(至水)进行水洗苏木素染色 蒸馏水水洗切片浸泡在 盐酸乙醇中分化 蒸馏水水洗 在.伊红液中染色 .最后进行常规脱水、透明、树脂封片后置于显微镜上进行观察拍照.体重及脏器指数的测定称量小鼠体重及脏器重量后按下式计算脏器指数.脏器指数脏器重量()小鼠体重()().小鼠血清细胞因子的测定取小鼠眼眶后静脉丛血于 管中室温静置 后离心()得到血清.利用 试剂盒检测肿瘤坏死因子()、干扰素()及细胞白介素()含量.造血功能的测定采小鼠眼眶血于抗凝管中在 内用全血细胞仪进行白细胞()、红细胞()和血小板()的计数.单核巨噬细胞吞噬功能的测定单核巨噬细胞的吞噬功能采用碳粒廓清试验来进行测定.第 对小鼠进行末次灌胃 后于小鼠尾静脉注射印度墨汁溶液(印度墨汁:生理盐水)注射量为./.在注射后的 和 分别从小鼠的眼眶采血 加入到 .溶液中.混匀后以.溶液为空白在 处测定其吸光度.取血后按照动物伦理要求对小鼠进行颈椎处死解剖取其肝脏和脾脏按照式()计算小鼠的单核巨噬细胞吞噬指数.()/()吞噬指数 体重/肝重脾重()式中 为廓清指数为第一次眼球取血时间()为第二次眼球取血时间()为 时样品的吸光度为 时样品的吸光度 为校正廓清指数.数据处理和统计采用 .统计软件对数据进行处理和显著性分析数据以平均值标准差()表示.黄馨阅等:红须腹菌多糖的提取、羧甲基化修饰及免疫活性研究 结果与分析.红须腹菌多糖的制备采用 对红须腹菌粗多糖进行第一阶段的分离纯化用苯酚硫酸法隔管测定多糖含量.洗脱曲线见图.采用蒸馏水以 /的固定洗脱速度进行洗脱得到中性红须腹菌多糖().采用./溶液逐级进行浓度梯度洗脱得到含量最高的酸性红须腹菌多糖().使用 对 进行进一步纯化.用去离子水以./的流速进行洗脱洗脱曲线见图.收集含量较多的组分()进行冷冻干燥最终得到红须腹菌纯化多糖.使用苯酚硫酸法测定了 及 的总糖含量分别为.和.图 的 色谱柱洗脱图 图 的 色谱柱洗脱图 .红须腹菌羧甲基多糖的制备采用水媒法对 进行了羧甲基化修饰得到羧甲基化多糖()并对其进行了羧甲基取代度的测定经测定该多糖羧甲基取代度为.图 的 谱图 .及 的红外光谱分析 和 的红外光谱图见图.和 的红外光谱吸收峰位置虽发生了移动但大体相似可能是因为多糖分子中引入了羧甲基基团.和 区域为 和 引起的多糖特征吸收峰.与 的红外峰相比在 处的吸收峰变宽表明羧甲基基团的引入加强了羟基的缔合作用.在 、和 处出现了新的较强吸收峰其中 处为 非对称伸缩振动 处为 对称伸缩振动 处为 中 的伸缩振动三者都是羧甲基的特征吸收峰.的其余吸收峰与 相似表明红须腹菌酸多糖在分子结构不变的情况下成功引入了羧甲基基团.和 体内免疫活性分析.及 对小鼠脾脏和胸腺的影响.小鼠脏器指数的测定脾脏和胸腺作为机体重要的免疫器官可以较好地反映机体的免疫功能.胸腺是机体的中心免疫器官是 细胞分化、发育和成熟的场所.健康的脾脏为身体提供抗炎、抗肿瘤因子、自然杀伤细胞和不同类型的 细胞帮助身体避免各种病毒和细菌的感染.当机体免疫功能增强时免疫器官的重量会随免疫细胞的增殖分化而增加反之则减少.所以测定小鼠的胸腺、脾脏指数可以间接反映样品对小鼠免疫系统的调节作用.如图 所示在注射环磷酰胺()后模型组小鼠胸腺和脾脏指数分别下降至空白对照组的.及.而在灌胃适当浓度的(/)后胸腺和脾脏指数均呈现剂量依南京师大学报(自然科学版)第 卷第 期(年)图 和 对小鼠脏器指数的影响()()表示与空白组对比表示与模型对照组相比和表示.和 表示.:空白对照组:模型对照组:阳性对照组:低剂量组:高剂量组:低剂量组:高剂量组.赖性增加在 /、/浓度下胸腺和脾脏指数分别为模型组的.、.、.及.而 各剂量组脏器指数较模型对照组也有显著上升(.)且与 浓度呈正相关关系.对比 对免疫抑制型小鼠脏器指数的影响更为显著(.).上述结果表明 和 均可通过减少免疫抑制剂对胸腺和脾脏的伤害而发挥免疫调节的作用其中 的作用更为显著.小鼠胸腺和脾脏的形态学观察对脾脏和胸腺进行形态学观察可以更加直观地了解样品对小鼠脾脏和胸腺造成的影响从而进一步验证通过研究脏器指数得到的结论.其中 图像是用来评估免疫器官损伤的常规方法之一可以较为直接地探究器官的免疫抑制状态.注:白髓:红髓:脾小梁:中央动脉.图 和 对小鼠脾脏组织病理变化的影响(染色)().空白对照组.模型对照组.阳性对照组.低剂量组.高剂量组.低剂量组.高剂量组.如图 所示空白对照组小鼠脾脏中红髓和白髓分界明显在白髓中央可见中央动脉脾小梁不规则黄馨阅等:红须腹菌多糖的提取、羧甲基化修饰及免疫活性研究分布在脾脏中.白髓染色深表明含有较多的淋巴细胞.而模型组小鼠脾脏白髓和红髓结构混乱二者间无明显界线未见中央动脉和脾小梁白髓颜色变浅表明淋巴细胞大量减少小鼠脾脏发生严重病变(图 ).如图 所示阳性对照组小鼠脾脏白髓和红髓的界线变明显白髓染色变深可见中央动脉和脾小梁但清晰度较空白对照组略低可见实验浓度下的香菇多糖()对免疫抑制型小鼠的脾脏组织具有保护作用但无法使脾脏恢复到正常状态.而 低剂量组小鼠脾脏中的红髓和白髓界线逐渐清晰但清晰度不及空白对照组可见脾小梁.白髓的面积较少且染色较浅说明淋巴数量较少.与模型对照组相比小鼠的脾脏损伤有所改善说明 对免疫抑制型小鼠具有一定的保护作用(图 ).图 中 高剂量组小鼠脾脏组织中白髓与红髓的界线与 低剂量组相比更加清晰可见明显的中央动脉和脾小梁白髓面积变大且染色变深表明 对免疫抑制型小鼠的脾脏保护作用呈剂量效应关系.与 低剂量组相比 低剂量组小鼠脾脏组织中的白髓和红髓界线更为清晰白髓的面积变大且染色变深可见脾小梁未见中央动脉(图 ).上述结果表明在同等浓度下 对免疫抑制型小鼠脾脏的保护作用强于.图 中 高剂量组小鼠脾脏组织中的红髓和白髓界线明显可见明显的中央动脉和脾小梁表明 对免疫抑制型小鼠脾脏的保护作用与多糖样品浓度呈现剂量效应关系.注:皮质:髓质:胸腺小体.图 和 对小鼠胸腺组织病理变化的影响(染色)().空白对照组.模型对照组.阳性对照组.低剂量组.高剂量组.低剂量组.高剂量组.、对小鼠胸腺的影响如图 所示.空白对照组小鼠胸腺组织中皮质和髓质的分界明显髓质中可见明显的胸腺小体未见组织坏死现象(图 ).而模型对照组则与之相反模型组小鼠胸腺皮质和髓质之间没有明显界线髓质大面积减少未发现胸腺小体说明 对小鼠的胸腺造成了一南京师大学报(自然科学版)第 卷第 期(年)定的损伤(图 ).如图 所示与模型对照组相比阳性对照组小鼠胸腺皮质和髓质的分界更为明显可见清晰的胸腺小体表明 可在一定程度上恢复了免疫抑制剂对小鼠胸腺造成的损伤.如图 所示 低剂量组小鼠胸腺较模型组而言皮质和髓质界线的清晰度略有提升髓质的面积变大这表明 对免疫抑制型小鼠的胸腺有一定的保护作用.而 高剂量组(图 )与 低剂量组相比髓质和皮质的分界线更加明显且髓质的面积更大表明 对免疫抑制型小鼠胸腺的保护作用呈浓度依赖关系.相较于 低剂量组 低剂量组小鼠胸腺中皮质与髓质之间的界线更加明显且髓质的面积更大表明在同样的浓度下 具有比 更强的胸腺保护作用(图 ).如图 所示 高剂量组与 低剂量组相比小鼠皮质与髓质的分界线更加清晰且髓质的面积更大表明 对免疫抑制型小鼠胸腺的保护作用随着浓度的增加而增加.小鼠血清细胞因子的测定细胞因子在免疫系统中发挥重要作用其含量也可较直观地反映机体免疫系统的状态.等细胞因子在细胞内病原体防御方面扮演重要角色.若免疫抑制剂使免疫系统受损则血清中的细胞因子如 等含量也会明显下降.如图 所示在向小鼠注射 后模型组细胞因子(、)的分泌较空白组都有明显降低(.)表明实验建立免疫抑制模型成功.已被证实具有较好的免疫调节作用能有效促进细胞因子的分泌故选用 作为阳性对照.由图 可知 以浓度依赖性方式增强着、的分泌.其中当 浓度达到/时、的浓度可达.、.、./分别为模型组的.、.、.倍及阳性对照组的.、.、.倍.同样地 也以浓度依赖性方式增强着、的分泌.高剂量组较低剂量组三种细胞因子(、)含量分别上升了.、.及.并且 各剂量组的三种细胞因子含量较 各剂量组都有显著提高(.).其中 高剂量组 及 含量均达到了阳性对照组水平.上述结果表明及 可促进、等细胞因子的分泌从而实现免疫调节作用并且在一定浓度范围内促进作用与 相差不大.而对 进行羧甲基化修饰后此促进作用显著提高.图 红须腹菌多糖及羧甲基多糖对小鼠血清中细胞因子含量的影响()()表示与空白组对比表示与模型对照组相比和 表示.).上述结果表明 及 可减轻 对骨髓的抑制作用有利于骨髓造血功能的恢复.单核巨噬细胞吞噬功能的测定巨噬细胞是重要的吞噬细胞在宿主防御系统中有着重要作用不仅能够启动先天免疫应答还能够黄馨阅等:红须腹菌多糖的提取、羧甲基化修饰及免疫活性研究参与细胞免疫应答.巨噬细胞被激活后可以吞噬致病微生物加工呈递抗原同时合成和分泌趋化因子和细胞因子增强机体的免疫防御功能可以用来评价机体的非特异性免疫状态.如图 所示模型组吞噬指数较空白组降低了.表明 对巨噬细胞的吞噬功能造成了一定的影响.而与模型组相比 以浓度依赖方式增强了巨噬细胞的吞噬作用.当 浓度达 /时吞噬指数可达模型组的.倍.与 各剂量组相比 各剂量组的吞噬指数都有所上升其中 高剂量组吞噬指数极显著上升(.).上述结果表明 及 均可提高巨噬细胞活力增强其吞噬能力且多糖经过羧甲基化修饰后效果更佳.图 红须腹菌多糖及羧甲基多糖对小鼠外周白细胞数量的影响()()()图 红须腹菌多糖及羧甲基多糖对小鼠外周红细胞数量的影响()()()图 红须腹菌多糖及羧甲基多糖对小鼠外周血小板数量的影响()()()表示与空白组对比表示与模型对照组相比和 表示.:空白对照组:模型对照组:阳性对照组:低剂量组:高剂量组:低剂量组:高剂量组.图 红须腹菌多糖及羧甲基多糖对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响()()表示与空白组对比表示与模型对照组相比和表示.和 表示.:空白对照组:模型对照组:阳性对照组:低剂量组:高剂量组:低剂量组:高剂量组.结论本研究采用超声波辅助热水浸提法提取出红须腹菌多糖并通过水媒法对其进行了羧甲基化的修饰测得红须腹菌多糖总糖含量为.及 都具有较好的免疫调节活性二者均能显著提高免疫抑制型小鼠血清中细胞因子含量和血细胞数量显著提升单核巨噬细胞的吞噬能力且能在一定程度上恢复 对小鼠脾脏和胸腺造成的损伤其中 的免疫活性更佳.参考文献 才晓玲.常见食用菌简介.北京:中国农业大学出版社:.刘江英.锁阳多糖体外免疫活性及多糖提取工艺优化研究.内蒙古:内蒙古大学.罗婷.苹果渣多糖的羧甲基化修饰及其抗氧化活性研究.西安:陕西科技大学.江连洲张巧智关嘉琦等.羧甲基化大豆水酶法膳食纤维的制备及其性能研究.农业机械学报():.南京师大学报(自然科学版)第 卷第 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