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激光生物学报ACTALASERBIOLOGYSINICAVol.32 No.4Aug.2023第 32 卷第 4 期2023 年 8 月收稿日期：2023-05-30；修回日期：2023-06-13。作者简介：王硕，硕士研究生。*通信作者：苗蓓，副教授，主要从事胃肠道常见病及肠脑互动紊乱疾病等的研究。E-mail:。构建铜死亡相关LncRNA风险模型预测肝细胞癌的预后及分子特征王硕，白红艳，费素娟，苗蓓*（徐州医科大学附属医院消化科，徐州 221004）摘要：铜死亡是一种新的程序性细胞死亡途径，由铜与脂酰化三羧酸循环蛋白直接结合而启动。调节肿瘤细胞中的铜死亡是一种新的治疗方法。然而，铜死亡相关长链非编码RNA（LncRNA）在肝细胞癌（HCC）中的潜在作用和临床意义尚不明确。本研究基于TCGA-LIHC数据集对19个铜死亡相关基因进行共表达分析，共鉴定出994个铜死亡相关LncRNA。采用LASSO回归和多因素Cox回归分析筛选出4个与铜死亡相关的预后LncRNA（TMCC1-AS1、AC009974.2、AL355574.1和DDX11-AS1）构建预后风险模型，并计算所有HCC患者样本的风险评分。按1:1的比例将肝癌患者分为高风险组和低风险组。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，高风险组患者的总生存率（OS）明显低于低风险组。回归分析和ROC曲线证实了风险评分的预后价值。此外，本研究分析了风险评分与通路富集分析、免疫检查点基因、免疫细胞浸润、抗癌药物敏感性和体细胞基因突变之间的相关性。差异表达分析结果表明，TMCC1-AS1、AC009974.2、AL355574.1和DDX11-AS1在肿瘤组织中的表达均升高。最后，利用收集的8例行根治性手术肝癌患者的癌组织及癌旁肝组织进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证，以增加本模型的组织学证据。本研究构建了一个由4种铜死亡相关LncRNA组成的风险模型，该模型与患者的预后及免疫浸润环境明显相关，在预测患者免疫治疗效果及指导化疗药物选择方面具有一定的临床应用价值。关键词：肝细胞癌；铜死亡；免疫逃逸；肿瘤突变负荷；LncRNA中图分类号：R735.7 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.04.006Construction of a Cuproptosis-related LncRNA Risk Model to Predict the Prognosis and Molecular Characteristics of Hepatocellular CarcinomaWANG Shuo,BAI Hongyan,FEI Sujuan,MIAO Bei(Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221004,China)Abstract:Cuproptosis is a new programmed cell death pathway,which is initiated by the direct binding of copper to the fatty acyl tricarboxylic acid cycle proteins.Modulation of cuproptosis in tumor cells is a novel therapeutic approach.However,the potential role and clinical significance of cuproptosis-related long non-coding RNA(lncRNA)in hepatocellular carcinoma(HCC)remain unclear.In this study,a total of 994 cuproptosis-related lncRNA were identified by co-expression analysis of 19 cupro-ptosis-related genes based on the TCGA-LIHC dataset.LASSO regression and multivariate Cox regression analysis were used to screen out four prognostic lncRNA(TMCC1-AS1,AC009974.2,AL355574.1 and DDX11-AS1)related to copper mortality to construct a prognostic risk model,and the risk scores of all HCC patient samples were calculated.HCC patients were divided into high risk and low risk groups at a 1:1 ratio.Kaplan-Meier survival curve analysis showed that the overall survival rate(OS)of the high risk group was significantly lower than that of the low risk group.Regression analysis and ROC curve confirmed the 331第 4 期肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第五大常见癌症，发病率呈上升趋势1。中国的新诊断肝癌病例和肝癌相关死亡病例占全球病例的近55%2。尽管有手术、肝移植、放疗和化疗等治疗方案，但HCC患者的生存率并不令人满意，大多数HCC患者被诊断为晚期疾病3，因此，迫切需要确定调控HCC生长和进展的新机制，以便发现新的有效的诊断和治疗方法来改善生存结局。近年来，越来越多的癌症患者受益于免疫治疗。在HCC患者中，鉴定可靠的预后生物标志物是开发有效治疗靶点的可靠策略4。铜死亡是一种新的铜诱导细胞死亡机制，它与其他已知的程序性细胞死亡机制（如凋亡、焦亡、自噬和铁亡）不同5。铜是人体正常生理功能所必需的微量元素。高于阈值的铜水平具有细胞毒性，特别是在肿瘤微环境中6。铜诱导的免疫毒性和剂量依赖性细胞周期阻滞与肝细胞死亡发生在小鼠的肝脏中7。铜诱导的细胞死亡涉及铜离子与脂酰化三羧酸周期蛋白的结合，可诱导脂酰化蛋白的积累和Fe-S簇蛋白的丢失，从而诱导蛋白毒性应激和铜死亡 8。长链非编码RNA（long non-coding RNA，Ln-cRNA）作为一种主要的非编码调控RNA，参与了许多生物过程9。LncRNA在细胞核和细胞质中通过多种机制调节基因的表达10。多项研究表明，Ln-cRNA可调节多种癌症的发生、生长和进展，是多种癌症中很有前景的诊断和预后生物标志物11-12。铜死亡相关LncRNA是头颈部鳞状细胞癌患者可靠的预后生物标志物13，在肿瘤预后和肿瘤免疫应答中的预测价值逐渐成为研究的主要领域。因此，本研究的目的是鉴定出与肝癌患者预后相关的铜死亡相关LncRNA，构建铜死亡相关LncRNA预后模型，并研究预后模型在预测HCC患者预后和免疫治疗反应方面的准确性。1材料与方法1.1TCGA-LIHC 数据集HCC的基因表达数据（424个样本）、临床信息（377个样本）和体细胞突变数据均来自癌症基因组图谱（the cancer genome alias program，TCGA）数据库（https:/portal.gdc.cancer.gov/repository）。首先，对临床信息不完整的样本进行分析和排除后，仅纳入370例肿瘤样本的临床信息进行后续分析。然后，使用GENCODE数据库（https:/www.gencodegenes.org）注释LncRNA。最后，从先前发表的一项研究中提取了19个与铜死亡相关的基因8。本研究已获得徐州医科大学附属医院伦理委员会的批准（伦理批号：XYFY2022-KL486-01）。遵照伦理相关规定收集了8例HCC患者（年龄范围为3275岁；平均年龄为64岁）的肿瘤组织和匹配的邻近正常肝组织（距离肿瘤边缘至少5 cm）。这些患者于2021年9月至2022年6月在徐州医科大学附属医院接受了常规根治性手术。术后立即将所有组织样品放在液氮中冷冻以进行进一步试验。1.2铜死亡相关LncRNA的鉴定 用R中的“limma”包鉴定铜死亡相关Ln-cRNA。这些LncRNA与19个铜死亡相关基因共表达，这些基因在之前的研究中已被鉴定8。阈值参数包括|Cor|0.4和P 0.001。通过桑基图和热图可视化铜死亡相关基因和铜死亡相关LncRNA的共表达关系。1.3基于铜死亡相关LncRNA的预后模型构建将临床资料完整的患者样本随机分为训练组（185例）和验证组（185例），进行单因素Cox回归分析，以确定训练组中铜死亡相关的LncRNAprognostic value of the risk score.In addition,we analyzed the correlation between risk scores and pathway enrichment analysis,immune checkpoint genes,immune cell infiltration,anticancer drug sensitivity,and somatic gene mutations.The results of dif-ferential expression analysis showed that TMCC1-AS1,AC009974.2,AL355574.1 and DDX11-AS1 were all up-regulated in tumor tissues,which were verified by real-time fluorescent quantitative PCR(qRT-PCR)in tumor tissues and adjacent liver tis-sues collected from 8 patients with hepatocellular carcinoma undergoing radical surgery.This give histological evidence for this model.In conclusion,a risk model composed of four cuproptosis-related lncRNA was constructed,which was significantly relat-ed to the prognosis and immune infiltration environment of patients.This model has certain clinical application value in predict-ing the effects of immunotherapy and guiding the selection of chemotherapy drugs.Key words:hepatocellular carcinoma;cuproptosis;immune escape;tumor mutation burden;LncRNA （Acta Laser Biology Sinica,2023,32(4):330-344）页眉文章标题王硕等：构建铜死亡相关LncRNA风险模型预测肝细胞癌的预后及分子特征王硕等：构建铜死亡相关LncRNA风险模型预测肝细胞癌的预后及分子特征激光生物学报332第 32 卷与HCC患者的预后相关。随后，进行最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）Cox回归分析，并进行 1 000 倍交叉验证，以进一步筛选候选LncRNA。最后，进行多变量Cox回归分析，以识别风险基因并计算其风险系数。风险评分模型按以下公式构建：风险评分=TMCC1-AS10.813 051 596 972 350+AC009974.2（-1.607 526 169 270 300）+AL355574.10.589 827 605 252 249+DDX11-AS10.829 692 708 022 306。计算所有样本的风险评分，然后，基于训练组中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组。采用Kaplan-Meier生存曲线评估风险模型的预后性能。1.4铜死亡相关LncRNA预后模型的验证用单因素和多因素Cox回归分析评估预后因素的预测能力，包括风险评分和其他临床病理特征。使用受试者工作特征（receiver operating charac-teristic curve，ROC）曲线评估风险模型预测HCC患者的总生存期（overall survival，OS）的准确性。用无进展生存期（progression free survival，PFS）分析和C指数分析进一步验证风险模型的性能。1.5免疫检查点基因分析为了探究免疫检查点基因阻断的治疗效果，我们根据TCGA-LIHC基因表达谱获取关键免疫检查点基因的表达量，包括PDCD1、PD-L1和CTLA-4等，并分析其在不同风险组表达量的差异。1.6肿瘤免疫细胞浸润与免疫应答分析通过单样本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）评估所有患者的肿瘤免疫细胞浸润评分和免疫功能。用热图展示免疫功能的差异，用箱式图展示免疫细胞富集的差异。随后，利用ESTIMATE计算样本肿瘤微环境（tu-mor microenvironmrnt，TME）中免疫细胞和基质细胞的成分，对比高、低风险组间微环境特征的差异。运行肿瘤免疫功能障碍与排斥算法（tumor immune dysfunction and exclusion，TIDE）计算数据集（http:/tide.dfci.harvard.edu）中每个患者的免疫治疗评分，展示预后风险评分和免疫反应之间的关系15。1.7功能富集分析为了阐明低风险组和高风险组之间富集途径的差异，采用R编程语言（4.1.3）版本中的cluster-Profiler包进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。1.8风险评分与肿瘤突变负荷（TMB）的关系使用R包“maftools”计算每位患者基于LIHC样本突变数据的肿瘤突变负荷（tumor mutational bur-den，TMB）评分。采用箱式图分析不同风险组的TMB评分。使用瀑布图对突变频率较高的基因进行可视化。1.9药物敏感性评估使用R包“pRRophetic”进行岭回归分析预测所有样本的半抑制浓度（half maximal inhibitory concen-tration，IC50）值18。用于分析的数据来自肿瘤药物敏感性基因组学（genomics of drug sensitivity in cancer，GDSC）数据库（https:/www.cancer-rxgene.org/），这是最大的药物基因组学数据库。采用R包“ggplot2”绘制箱式图，显示不同风险组的药敏分布。1.10统计分析使用R编程语言（4.1.3）版进行统计分析。统计检验采取双边检验，P1、P0.01及P.adjust0.05的富集结果为差异具有统计学意义（NES为标准化富集分数，P 为标准化显著性水平，P.adjust为经过矫正多重假设检验的显著性水平）。PCR试验中采用两组配对样本t检验，P0.05为差异具有统计学意义。1.11逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）采用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒（Takara生物技术有限公司）进行逆转录定量聚合酶链反应（re-verse transcriptional quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。使用的引物序列如下：TMCC1-AS1正向为5-AGCGAGGGATCGAGTTGAGA-3；TMCC1-AS1反向为5-TAGTCATGTCCCCGTTGGTG-3；GAPDH正向为5-CGACTTACATGGCCTTA-3；GAPDH反向为5-TTCCGATCACTGTTGGAAT-3；AL355574.1正向为5-TGCTTTCCTCAGGCTCTAAGG-3；AL355574.1反向为 5-CCTGTCCACCTCGTGTTCTTPCR-3；DDX11-AS1正向为 5-CTGGCTACTCTTCCTCCT-GG-3；DDX11-AS1 反向为 5-CAGAGGACATGT-GGGAGGTT-3。反应条件如下：95持续1 min，40个循环；95持续10 s，57持续40 s。相对表达水平使用2Cq方法，以GAPDH为内源性对照。333第 4 期2结果与分析2.1在HCC样本中鉴定994个铜死亡相关LncRNA使用GENCODE数据库在TCGA-LIHC表达矩阵中鉴定了16 876个LncRNA。利用Pearson分析鉴定出994个铜死亡相关LncRNA。这些LncRNA与19个铜死亡相关基因相关。图1中的桑基图和热图分别显示了铜死亡相关基因和铜死亡相关LncRNA之间的相关性。本研究从TCGA数据库中纳入了370例具有完整临床信息的患者。此外，将所有患者随机分为训练组和验证组。HCC患者的临床资料汇总见表1，两组临床指标基本一致，具有可比性。2.2肝癌患者铜死亡相关 LncRNA 预后模型的构建首先以P 0.05为阈值，基于单变量Cox回归分析确定了264个铜死亡相关的LncRNA。图2a中的森林图显示了前18个LncRNA的风险比和P值。图1在HCC样本中鉴定994个铜死亡相关LncRNAFig.1A total of 994 copper-associated LncRNA were identified in HCC samples（a）19个铜死亡相关基因与994个铜死亡相关LncRNA的共表达关系；（b）4个预后相关LncRNA与19个铜死亡相关基因的相关性。(a)Co-expression relationship between 19 cuproptosis-related genes and 994 cuproptosis-related LncRNA;(b)Correlation between four prognostic related LncRNA and 19 cuproptosis-related genes.对264个铜死亡相关LncRNA进行LASSO Cox回归分析，确定了9个可能与预后相关的LncRNA（图2b2c）。随后，多变量Cox回归分析确定了4个与预后相关的LncRNA，利用 4 种预后相关LncRNA建立预后风险模型。风险评分计算公式为：风险评分=（0.813 051 597Expression TMCC1-AS1）+（-1.607 526 169Expression AC009974.2）+（0.589 827 605Expression AL355574.1）+（0.829 692 708Expression DDX11-AS1）。使用训练组中位风险评分将训练队列HCC患者分为高风险组和低风险组。通过Kaplan-Meier生存曲线分析评估高风险组和低风险组HCC患者OS率的差异（图2d2f）。如图2g2h所示，HCC患者的高风险评分与预后不良相关。利用热图显示高风险组和低风险组中4个模型LncRNA的表达差异（图2i）。2.3铜死亡相关LncRNA预后模型的验证及预后价值基于单因素和多因素Cox回归分析，进一步研究了预后因素的预测能力，包括风险评分、性别、年龄（年龄从16岁到85岁不等）、组织学分级和临床分期。单因素分析显示，临床分期和风险评分可能是评估HCC患者OS的可靠预后因素（图3a）。多变量分析证实，在对可能的混杂因素进行校正后，在HCC患者的TCGA数据集中，临床分期和风险评分是OS的独立预测因素（图3b）。低风险组HCC患者的PFS明显长于高风险组（P 65138(37.30%)72(38.92%)66(35.68%)GenderFemale121(32.70%)61(32.97%)60(32.43%)1.000 0Male249(67.30%)124(67.03%)125(67.57%)GradeG155(14.86%)26(14.05%)29(15.68%)0.880 0G2177(47.84%)93(50.27%)84(45.41%)G3121(32.70%)59(31.89%)62(33.51%)G412(3.24%)6(3.24%)6(3.24%)Unknown5(1.35%)1(0.54%)4(2.16%)StageStage I171(46.22%)86(46.49%)85(45.95%)0.100 8Stage II85(22.97%)34(18.38%)51(27.57%)Stage III3(0.81%)0(0%)3(1.62%)Stage IIIA65(17.57%)36(19.46%)29(15.68%)Stage IIIB8(2.16%)3(1.62%)5(2.7%)Stage IIIC9(2.43%)7(3.78%)2(1.08%)Stage IV2(0.54%)2(1.08%)0(0%)Stage IVA1(0.27%)1(0.54%)0(0%)Stage IVB2(0.54%)1(0.54%)1(0.54%)Unknown24(6.49%)15(8.11%)9(4.86%)Primary tumor stageT1181(48.92%)93(50.27%)88(47.57%)0.322 9T291(24.59%)38(20.54%)53(28.65%)T2a1(0.27%)0(0%)1(0.54%)T2b1(0.27%)1(0.54%)0(0%)T345(12.16%)23(12.43%)22(11.89%)T3a29(7.84%)18(9.73%)11(5.95%)T3b6(1.62%)3(1.62%)3(1.62%)T413(3.51%)9(4.86%)4(2.16%)Tx1(0.27%)0(0%)1(0.54%)Unknown2(0.54%)0(0%)2(1.08%)Staging of distant metastasisM0266(71.89%)129(69.73%)137(74.05%)0.449 2M14(1.08%)3(1.62%)1(0.54%)Mx100(27.03%)53(28.65%)47(25.41%)Staging of regional lymph node metastasisN0252(68.11%)123(66.49%)129(69.73%)0.543 4N14(1.08%)3(1.62%)1(0.54%)Nx113(30.54%)58(31.35%)55(29.73%)Unknown1(0.27%)1(0.54%)0(0%)335第 4 期图2肝癌铜死亡相关LncRNA预后模型的构建与验证Fig.2Construction and validation of a prognostic model of LncRNA associated with cuproptosis in liver cancer（a）展示前18位与预后相关的铜死亡相关LncRNA的森林图；（b）LASSO Cox回归分析的系数分布图；（c）LASSO Cox回归分析的交叉验证曲线；（d）整个组生存分析的Kaplan-Meier曲线；（e）训练组生存分析的Kaplan-Meier曲线；（f）验证组生存分析的Kaplan-Meier曲线；（g）HCC患者的风险评分分布图；（h）HCC患者的生存状态分布图；（i）显示高风险组和低风险组模型LncRNA表达差异的热图。(a)Forest maps showing the first 18 cuproptosis-related LncRNA associated with prognosis;(b)Coefficient distribution diagram of LASSO Cox regression analysis;(c)Cross-validation curve of LASSO Cox regression analysis;(d)Kaplan-Meier curves for survival analysis of the whole group;(e)Kaplan-Meier curves for survival analysis in the training group;(f)Kaplan-Meier curve of survival analysis in validation group;(g)Distribution of risk scores for HCC patients;(h)Distribution map of survival status of HCC patients;(i)Heat map showing the difference in model LncRNA expression between high risk and low risk groups.为I类、II类和III类基因区域，一般通过参与细胞表面的抗原呈递和机体的免疫调节来激活免疫反应。通常认为，HLA 中某些分子的高表达与某些人类癌症的预后不良有关。图4b表明，HLA-DRA、HLA-DMB、HLA-DOA、HLA-DMA、HLA-DPB1、HLA-DRB6、HLA-DQA2、HLA-DOB、HLA-H、HLA-A和HLA-DQB2在高风险组中的表达明显高于低风险组。最后，基于CTLA-4和PD-1的表达状态比较高风险组和低风险组之间的免疫表型，结果显示，在CTLA-4基因表达阴性的免疫表型中高风险组和低风险组的免疫应答反应具有显著差异（图4c）。2.5风险模型与 HCC 患者的肿瘤免疫细胞浸润 和肿瘤免疫应答密切相关采用ssGSEA分析评估高风险组和低风险组HCC患者13种免疫相关功能的状态。如热图所示，Type II IFN response、Type I IFN response、cytolytic activ-ity和 MHC class I在高风险组和低风险组之间有显著的差异（图5a）。为了进一步了解不同风险组的肿瘤页眉文章标题王硕等：构建铜死亡相关LncRNA风险模型预测肝细胞癌的预后及分子特征王硕等：构建铜死亡相关LncRNA风险模型预测肝细胞癌的预后及分子特征激光生物学报336第 32 卷图3铜死亡相关LncRNA模型在HCC中的预后价值Fig.3Prognostic value of copper-death associated LncRNA models in HCC（a）基于单变量回归分析的森林图。显示风险评分与年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤分期等临床病理参数的风险比和P值；（b）基于多元回归分析的森林图。显示风险评分的风险比和P值，以及年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤分期等临床病理参数；（c）Kaplan-Meier生存曲线显示高风险和低风险HCC患者的PFS；（d）风险模型的时间依赖性ROC曲线；（e）风险模型的分类ROC曲线；（f）包含风险评分及其他临床参数的C指数分析。(a)Forest plot based on univariate regression analysis showing hazard ratios and P values of risk scores with clinicopathological parameters such as age,sex,tumor grade,and tumor stage;(b)Forest plot based on multiple regression analysis,showing hazard ratios and P values of risk scores,and clinicopathological parameters such as age,sex,tumor grade,and tumor stage;(c)Kaplan-Meier survival curves showing PFS of high risk and low risk HCC patients;(d)Time-dependent ROC curves for risk models;(e)Classification ROC curve of the risk model;(f)C-index analysis with risk scores and other clinical parameters.337第 4 期微环境的差异，本研究计算并比较了23种常见浸润免疫细胞的相对表达，结果表明，活化CD4+T细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞及单核细胞等在高、低风险组间具有明显的差异性（图5b）。肿瘤微环境一般由免疫细胞、肿瘤细胞及间质细胞构成，用TME评分比较不同风险组的基质及免疫活性差异，结果提示，低风险组人群拥有较低的肿瘤纯度及较高的间质和评估评分（图5c5d）。HCC患者的TIDE评分与免疫治疗反应呈负相关 19。两个风险组之间的TIDE评分有显著差异（图5e）。高风险组HCC患者的TIDE评分明显低于低风险组。这表明，高风险组患者的免疫治疗效果更好。因此，风险评分是HCC患者免疫治疗结果的一个有希望的预测指标。2.6风险评分与HCC患者的肿瘤突变负荷相关从TCGA数据库中提取HCC患者的体细胞突变数据，用于计算HCC样本的TMB评分，结果显示，高风险组和低风险组TMB评分有显著的差异（图6a）。采用TMB中位数评分将HCC患者分为高TMB组和低TMB组。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，高TMB组患者的OS明显低于低TMB组（图6b）。最后，我们分析了不同风险组的前15个高频基因，用瀑布图可视化两组中突变频率最高的图4免疫检查点基因分析Fig.4Immune checkpoint gene profiling(a)不同风险组间免疫检查点基因的表达；（b）比较高低风险组间HLA的表达；（c）不同风险组的免疫表型比较。(a)Immune checkpoint gene expression among different risk groups;(b)Comparison of HLA expression between high risk and low risk groups;(c)Comparison of immunophenotypes of different risk groups.页眉文章标题王硕等：构建铜死亡相关LncRNA风险模型预测肝细胞癌的预后及分子特征王硕等：构建铜死亡相关LncRNA风险模型预测肝细胞癌的预后及分子特征激光生物学报338第 32 卷图5TME及肿瘤免疫应答在不同风险组的比较Fig.5Comparison of TME and tumor immune response in different risk groups（a）比较高风险和低风险人群之间的13种免疫相关功能；（b）23种免疫细胞在高风险及低风险患者中的差异分析；（c）不同风险组的免疫评分、基质评分和估计评分的比较；（d）不同风险组的肿瘤纯度的比较；（e）高低风险组患者之间TIDE评分的小提琴图。(a)Thirteen immune-related functions were compared between high risk and low risk groups;(b)Differential analysis of 23 immune cells between high risk and low risk patients;(c)Comparison of immune score,stromal score and estimated score in different risk groups;(d)Tumor purity was compared between different risk groups;(e)The violin plot shows the TIDE estimated score between high risk and low risk patients.339第 4 期前15个基因，结果显示，TP53突变的频率在高风险组最高（图6c），低风险组CTNNB1突变频率最高（图6d）。2.7功能富集分析为了进一步探究高风险组与低风险组患者基因功能富集的差异，运用基因集富集分析方法进行富集分析。结果表明：低风险组中显著富集的是氧化还原活动和有机酸代谢过程（图7a7b）；高风险组中显著富集的是蛋白水解和肝癌亚型的激增（图7c7d）。2.8风险模型与 HCC 患者的抗癌药物敏感性的关系使用“pRRophetic”R包评估风险预后模型与抗肿瘤药物敏感性之间的关系，共鉴定出12种药物，且其敏感性（IC50）在高风险组和低风险组之间存在显著的差异（P 0.05）（图8、图9），表明这些药物图6风险模型的肿瘤突变负荷Fig.6Risk model score and tumor mutational burden in HCC patients（a）高风险组和低风险组的TMB评分的对比；（b）高TMB和低TMB评分患者的Kaplan-Meier生存曲线分析；（c）高风险组患者的突变基因及突变频率；（d）低风险组患者的突变基因及突变频率。(a)The TMB scores of the high risk group and the low risk group were compared;(b)Kaplan-Meier survival curve analysis of patients with high TMB and low TMB scores;(c)Mutation genes and mutation frequencies in high risk patients;(d)Mutation genes and mutation frequencies in low risk patients.页眉文章标题王硕等：构建铜死亡相关LncRNA风险模型预测肝细胞癌的预后及分子特征王硕等：构建铜死亡相关LncRNA风险模型预测肝细胞癌的预后及分子特征激光生物学报340第 32 卷在未来可能对HCC患者的个性化治疗有用。2.9TMMCC1-AS1、AL35574.1及DDX11-AS1在HCC中上调本研究分析了模型LncRNA在肝癌组织及癌旁组织的表达量差异。如图9a所示，TMMCC1-AS1、AL35574.1及DDX11-AS1均在癌组织中表达上调。利用收集到的肝癌组织进行qRT-PCR组织验证，结果显示，肝癌组织中TMMCC1-AS1、AL35574.1及DDX11-AS1的表达水平升高（图9b9d)。3讨论一些研究报道，免疫治疗可显著提高HCC患者的生存率20-21。索拉非尼（sorafenib）可以显著提高HCC患者的OS，并显著改善不可切除HCC患者的预后22。然