高分辨率连续光源石墨炉原子吸收法直接测定全血中硒.pdf

硒卫生检验与实验研究576Jiangsu JPrevMedVol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期高分辨率连续光源石墨炉原子吸收法直接测定全血中龚燕，孟元华，周小新，吴宇，宋振威？，仲立新”，朱醇：无锡市疾病预防控制中心，江苏无锡2 140 0 0；2.无锡市第八人民医院；3.江苏省疾病预防控制中心摘要：目的建立1种高分辨率连续光源石墨炉原子吸收光谱仪直接测定全血中硒含量的方法。方法优化石墨炉原子吸收光谱法检测血中硒的波长、基体改进剂、温度和样品预处理方法；绘制标准曲线，计算检出限、定量限、精密度、稳定性；考察常见共存离子对检测的影响。将改进后的方法与电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS）进行比较。结果血样用0.1%曲拉通+1%硝酸溶液10 倍稀释后，以硝酸钯+硝酸镁为基体改进剂，直接经连续光源石墨炉定量测定硒含量。加入5uL0.05%硝酸钯+0.0 5%硝酸镁的基体改进剂，石墨炉采用程序升温，在Se元素的特征波长19 6.0 2 6 7 nm处精确的测定吸收谱线，积分模式为峰面积，有效像素5像素,BGC模式IBC。结果显示，血中硒在0 50 g/L的范围内线性关系良好（r=0.9992)；方法检出限为0.7 g/L，定量限为2.4g/L，相对标准偏差为1.6%3.7%（n=7），加标回收率为9 7.1%10 5.0%。采用本法与ICP-MS测定10 份样品，结果差异无统计学意义（t=-0.330,P0.05）。结论建立的高分辨率连续光源石墨炉原子吸收仪直接测定全血中硒的方法，特异性强、灵敏度高、操作简单方便、准确度高，适合生物样本全血中硒的测定。关键词：硒；全血；石墨炉原子吸收光谱法；连续光源中图分类号：R113文献标识码：B文章编号：10 0 6-9 0 7 0(2 0 2 3)0 5-0 57 6-0 3硒（Se）是人体的必需元素，是构成谷胱甘肽过氧化物酶的组分。谷胱甘肽过氧化物酶具有抗氧化和消除自由基的作用，对于抗衰老、抗癌、减少心脑血管疾病意义重大；但硒暴露或补充过量也会影响健康,进人人体的硒首先在血液内达到平衡。目前，生物样本中硒测定方法为血清中硒的氢化物发生-原子吸收光谱法2 和尿中硒的氢化物发生-原子吸收光谱法3,其他还有电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、原子荧光法、分光光度法等4-6 。原子荧光法前处理复杂，ICP-MS灵敏度准确度高但仪器价格昂贵，传统的石墨炉原子吸收法背景干扰大。有研究表明，高分辨率连续光源石墨炉能精准识别特征光谱，可有效排除干扰，具有较高的灵敏度。本研究拟使用高分辨率连续光源石墨炉原子吸收光谱法，建立1种全血中硒测定的方法。1材料与方法1.1仪器和试剂连续光源石墨炉原子吸收光谱仪、自动进样器、涂层石墨管（contrAA800，德国耶拿），旋涡振荡器（英国IKA）；水中硒标准液10 0 0 mg/L（BW30 0 2 6-10 0 0-N-50,北京坛墨），硝酸（CMOS，上海国药），硝酸钯（Pd39%，阿拉丁），硝酸镁、曲拉通X-100（分析纯，南京试剂），脱脂羊血（郑州诚睿）；全血微量元素标准物质（SeronormTMTraceElementsTMWhole Blood L-1 LOT:1702821;Seronorm TM Trace El-ements WholeBlood L-2LOT:1702825;SeronormTMTrace Elements Whole Blood L-3LOT:1702826)1.2方法1.2.1仪器工作条件优化波长、基体改进剂、温度和样品预处理方法1.2.1试剂配制水中硒标准液10 0 0 mg/L，用1%硝酸溶液逐级稀释成10 0 g/L标准应用液；基体改进剂：称取0.0 5g硝酸钯加入1mL硝酸溶解，加入少量水，再加人0.0 5g硝酸镁，定容至10 0 mL；样品稀释液：0.1%曲拉通X-100+1%硝酸溶液。1.2.2标准曲线取7 个1mL离心管，各加人0.0 5mL羊血，依次加入标准应用液0、0.0 5、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5m L，加入稀释液至1mL，置于螺旋振荡器上混匀。配成0、5、10、2 0、30、40、50 g/L标准系列，进样体积为2 0 L进行测定。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，计算方程、相关系数（r）。1.3检出限、定量限连续测定11次空白溶液，以3倍S/N为方法检出限、10 倍S/N为方法定量限1.4精密度和准确度测定10 倍稀释后的全血微量D01:10.13668/j.issn.1006-9070.2023.05.018基金项目：江苏省卫生健康委面上项目（M2021028）作者简介：龚燕（19 8 3一），女，江苏无锡人，副主任技师，主要从事理化检验工作通信作者：朱醇，副主任技师，E-mail：z h u c h u n 2 0 7 12 6.c o m577JiangsuJPrevMedVol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期元素标准物质，重复7 次，计算回收率1.5样品采样与测定使用肝素钠抗凝管，静脉采血1 3mL,混匀。移液器吸取0.0 5mL血液至样品杯，加入0.9 5mL稀释液，混匀供测定；同时测定试剂空白，标准加人曲线法定量。1.6共存离子影响在样品中加人1mg/L元素混标0.1 mL,其 Ag、A l、A s、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、K、Mg、M n、M o、Na、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、T i、T I、V、Zn 浓度为0.1mg/L,评估是否干扰硒的测定。1.7与 ICP-MS 比较用2 种方法测定10 份血液中硒元素浓度并比较。2结果2.1仪器条件优化试验波长为19 6.0 2 6 7 nm，积分模式为峰面积,有效像素5像素，BGC模式IBC,基体改进剂加人量5L，测定过程石墨炉升温程序见表1。表1石墨炉程序升温条件步骤温度()升温速率（/s）保持时间（s）氩气1干燥80540最大2干燥90520最大3干燥110520最大4灰化200510最大5灰化110010030最大6原子化210015004停气7清除2.60015005最大2.1.1波长Se元素的特征波长为19 6.0 2 6 7 nm，ContrAA800型石墨炉原子吸收光谱仪使用的是1种连续光源，运用“最小二乘法”自动校正分析波长和结构背景的重叠部分，借助探测器观测位于相邻的干扰元素谱线校正光谱，从而消除光谱中的所有宽带效应和灯漂移7 。Se在特征波长处背景校正后的吸收谱线见图1,其左右分别为Fe峰（19 6.0 40 nm）和Pd峰（19 6.0 12 n m），对Se峰均不会产生明显干扰，另外附近的分子NO、O H 也未产生明显干扰，可以看出在196.0267nm处测定硒，特异性较强，与传统的原子吸收相比较，其抗背景干扰能力更好。波长(nm)195.90195.95196.00196.05196.10196.150.2050196Fe196.0267.nm0.1540.1/CH3OHCSNOOHPOSio(V)ZFe0.100.0500255075100125150175200像数图1Se元素特征分析线谱图2.1.2基体改进剂因血液基体复杂，需使用较高的灰化温度消除干扰，而Se元素在30 0 左右就有挥发，加人基体改进剂可以固定Se元素，防止提前挥发。本研究采用硝酸钯、硝酸镁、抗坏血酸以及其组合作为基体改进剂，对同一血液样进行Se测定，以吸光度评估基体改进剂对灵敏度的影响。不同改进剂处理后检测，吸光度由高到低依次为0.0 5%硝酸钯+0.05%硝酸镁混合液（0.10 6）、0.0 5%硝酸钯（0.0 8 9）、0.0 5%硝酸钯+1%抗坏血酸（0.0 8 8）、0.05%硝酸镁+1%抗坏血酸（0.0 7 6）、1%抗坏血酸（0.0 6 6）、0.0 5%硝酸镁（0.0 6 5）。故本研究选取0.05%硝酸钯+0.0 5%硝酸镁混合液作为基体改进剂，灵敏度最高。2.1.3干燥温度血样干燥需要时间较长，9 0 开始沸腾。本研究采用三步干燥法，可防止由于局部高温导致样品爆沸造成的测定元素损失。2.1.4灰化温度固定原子化温度2 10 0，灰化温度从7 0 0 130 0 每10 0 递增，测定同一血液样本中的硒元素，观察吸光度变化；当灰化温度为1200时，硒元素吸光度值较高、背景吸光度较低，灵敏度较高、干扰较小，见图2。2.1.5原子化温度固定灰化温度12 0 0，原子化温度18 0 0 2 30 0，观察每递增10 0 吸光度变化；当原子化温度为2 10 0 时，干扰较小、吸光度最高、测定效果最佳，见图3。0.2吸光度值一背景值(V)(0.1060080010001 2001400温度()图2灰化温度选择0.15金一吸光度值背景值(V)0.100.050180019002.00021002.2002.3002.400温度()图3原子化温度选择编辑：彭海燕578JiangsuJPrevMedVol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期2.2木样品预处理血液含有多种蛋白质和无机离子，石墨炉测定会产生大量碳积聚在石墨管中，影响光路通行，从而影响方法灵敏度、精密度和准确度。高温除残步骤通空气是清除积碳最有效的方法，但会快速降低石墨管寿命。综合考虑试剂用量、元素污染、微量检测等多种因素，选择将样品稀释后直接测定。稀释液为硝酸与曲拉通X-100混合溶液，为了减少背景干扰和降低积碳，选择稀释倍数为10 倍。曲拉通X-100为表面活性剂，可降低样品表面张力，减少积碳，浓度过高会产生大量泡沫影响进样稳定性。实验发现，0.1%曲拉通可使石墨管使用寿命就从2 0 0 次增加为约40 0 次。分别配制0.0.5%、1.0%、2.0%的硝酸-0.1%曲拉通X-100溶液，检测同一血样稀释液中硒元素，吸光度分别为0.0 58 7、0.0 58 7、0.0 6 0 7、0.0609。考虑硝酸浓度对石墨管寿命的影响，本方法选用0.1%曲拉通X-100+1%硝酸作为血中硒元素测定的稀释液。2.3标准曲线、检出限和定量限按照实验的条件，所测定的标准工作曲线y=0.0014x+0.0124，相关系数为0.9 9 9 2,在硒元素质量浓度0 50 g/L范围内线性良好。连续测定11次空白溶液，由测定值计算浓度标准差为0.2 33g/L，其检出限（LOD）为0.7g/L,定量限(LOQ)为2.4g/L。2.4精密度和准确度测定10 倍稀释后的全血微量元素标准物质，重复7 次，3个标准品中Se的参考值分别为（6 9 15）、（14431）、（2 5451）g/L，测定均值分别为（6 6.9 8）、（141.35）、（2 6 6.7 2）g/L，回收率分别为9 7.1%9 8.2%、10 5.0%，相对标准偏差分别为3.7%、2.1%、1.6%。2.5共存元素的影响在样品中加人1mg/L元素混标O.1mL,结果Ag、A l、A s、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、K、M g、M n、M o、Na、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、T i、T I、V、Zn 等元素,均不干扰 Se 的测定。2.6与 ICP-MS 比较采用本法与ICPMS法同时测定10 份正常人血样标本，全血中Se测定值的相对偏差为0.39%6.8 6%，差异无统计学意义（t=-0.330，P0.05）。见表2。表2 人血中Se元素测定值（g/L)标本号本法ICPMS相对偏差(%)1118.7107.25.09278.179.10.64366.075.36.584115.1116.00.395107.199.53.68678.790.36.86795.7109.26.598068.275.95.34980.476.92.2310119.6108.05.103讨论建立了1种连续光源石墨炉原子吸收光谱仪直接测定全血中硒的方法。试验波长为19 6.0 2 6 7 nm，积分模式为峰面积,有效像素5像素,BGC模式IBC,基体改进剂为5L的0.0 5%硝酸钯+0.0 5%硝酸镁，石墨炉采用程序升温。血中硒在质量浓度0 50 g/L的范围内线性关系良好（r=0.9992）。该方法检出限为0.7 g/L，定量限为2.4g/L，相对标准偏差为1.6%3.7%，加标回收率为9 7.1%10 5.0%，能满足检验要求。本方法测定的结果与电感耦合等离子体质谱法比较差异无统计学意义。综上，建立的连续光源石墨炉原子吸收光谱仪直接测定全血中硒含量的方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简单方便、准确度高的优点，适合生物样本全血中硒的测定。参考文献1刘宇凡，姜少琼，张娟.血浆硒水平与非酒精性脂肪肝的相关研究J.江苏预防医学，2 0 17,2 8（5）：536-538.2WS-T1091999,血清中硒的氢化物发生-原子吸收光谱测定方法S.3WS-T47一19 9 6,尿中硒的氢化物发生-原子吸收光谱测定法S.4张亚梅，高静.ICP-MS测定全血8 种微量元素的方法学建立与性能评价J.医学信息,2 0 18,31（2 1)：17 0-17 2.5李悦，豆小文，纪翔，等.ICP-MS法测定人全血中19 种微量元素的性能评价及临床应用J.国际检验医学杂志，2 0 2 0，41（2 0）：2438-2449.6范小飞，虞建宏.微量元素硒的生物学功能及测定方法的研究J.江苏预防医学.2 0 11,2 2（1：6 2-6 4.7陈泽智，刘琳，赖胜强，等.连续光源石墨炉原子吸收光谱法测定污泥中的铍J.工业水处理，2 0 2 1,41（2）：112-116.收稿日期：2 0 2 3-0 7-10