改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量.pdf

研究论文改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量刘宁 1.2，徐建中1,2（1.江南大学生物工程学院，江苏无锡2 1412 2；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)摘要：乙酰羟酸合成酶（acetohydroxyacid synthaseAHAS，编码基因iluBN）是L-亮氨酸合成途径的第一个限速酶。以谷氨酸棒杆菌XL-3(Corynebacterium glutamicum XL-3)为底盘细胞，通过分析并改造AHAS增加其对底物丙酮酸的偏好性，从而提高L-亮氨酸产量。首先利用AHAS的氨基酸序列进行同源建模，根据蛋白质结构进行丙氨酸扫描，找到突变的潜在位点，通过测定突变体酶活力和重组菌株的L-亮氨酸产量寻找最适突变体。测定结果发现将157 位Gln突变成Arg能够有效提高AHAS催化丙酮酸的能力，最终重组菌株的L-亮氨酸产量达到（2 3.51.8）g/L，比出发菌株谷氨酸棒杆菌XL-3增加了51%，同时副产物L-异亮氨酸产量有所下降。因此，通过对AHAS的理性改造促进了L-亮氨酸的合成，该研究结果对后续利用蛋白质工程强化微生物合成L-亮氨酸等支链氨基酸具有重要的参考价值。关键词：乙酰羟酸合成酶；谷氨酸棒杆菌；L-亮氨酸；支链氨基酸；蛋白质改造中图分类号：Q814.9文章编号：16 7 3-16 8 9(2 0 2 3)0 9-0 0 45-11DOl:10.12441/spyswjs.20220228003Improvement of L-Leucine Production by Modifying Acetohydroxy AcidSynthaseLIU Ningl,XU Jianzhongn.(1.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of IndustrialBiotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)Abstract:Acetohydroxy acid synthase(AHAS,encoded by the gene ilwBM)is the first rate-limitingenzyme in L-leucine synthesis pathway.Corynebacterium glutamicum XL-3 was used as the chassiscell to increase its preference for pyruvate and improve the yield of L-leucine by analyzing andmodifying AHAS.Initially,the amino acid sequence of AHAS was used for homologous modeling.Then potential mutation sites were identified through alanine scanning of the protein structure.Theoptimal mutant was selected by measuring the catalytic activity of the mutant and the L-leucine yieldof the recombinant strain.The results showed that substituting Gln157 with Arg effectively enhancedthe ability of AHAS to catalyze pyruvate,resulting in a final L-leucine production of(23.5+1.8)g/Lin the recombinant strain,which was a 51%increase compared to the parent strain Corynebacteriumglutamicum XL-3.In addition,the yield of by-products L-isoleucine decreased.Therefore,therational modification of AHAS could promote the synthesis of L-leucine.The research results have收稿日期：2 0 2 2-0 2-2 8 修回日期：2 0 2 2-0 5-0 8基金项目：江苏省研究生科研与实践创新计划项目（SJCX20_0745）。*通信作者：徐建中（198 4一），男，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事微生物代谢改造研究。E-mail：x u j i a n z h o n g j i a n g n a n.e d u.c n食品与生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第9期45RESEARCHARTICLELIU Ning,et al:Improvement of,L-Leucine Production by ModifyingAcetohydroxy Acid Synthaseimportant implications for the subsequent use of protein engineering to strengthen the microbialsynthesis of branched-chain amino acids such as L-leucine.Keywords:acetohydroxy acid synthase,Corynebacterium glutamicum,L-leucine,branched-chainamino acids,protein engineeringEMPL-亮氨酸是主要的支链氨基酸之一，主要应用葡萄糖于食品、医药、动物饲料和化妆品行业。目前工业生产L-亮氨酸的主要方法是微生物发酵法、直接提取法和化学合成法。微生物发酵法由于成本低、环境友好等优点而被广泛运用，工业常用的菌株为谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌2。在谷氨酸棒杆菌中,L-亮氨酸生物合成与L-异亮氨酸和L-缬氨酸合成密切相关，因为这3个支链氨基酸都以丙酮酸为前体,并且代谢步骤中经过4个相同的酶催化反应3-41,依次由乙酰羟酸合成酶（AHAS,编码基因ilvBN)、乙酰羟酸异构还原酶（AHAIR,编码基因ilvC)、二羟酸脱氢酶(DHAD,编码基因iluD)以及支链氨基酸转氨酶（TAs，编码基因ilvE）催化（见图1)5-6 。其中AHAS是由两个ilvB基因编码的大亚基（催化亚基）和两个ilvN基因编码的小亚基（调节亚基)组成的四聚体。它是合成途径中的第一个限速酶,其调节亚基受L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的协同反馈阻遏，作用原理是其能与AHAS的调节位点结合，从而抑制AHAS活性7 。在大肠杆菌（Es c h e r ic h ia c o li）和鼠伤寒杆菌（Salmonellatyphimurium）中，AHAS存在3种同工酶，分别是AHASI、A H A SI I 和AHASIII，由操纵子ilvBN、ilvGMEDA和ivIH所编码，但并不是全部的细菌都有多种AHAS同工酶,在谷氨酸棒杆菌中就只存在一种AHAS。在谷氨酸棒杆菌中,AHAS主要是受L-氨酸的反馈抑制,并且其可以同时催化2 个反应，第一个反应是催化丙酮酸生成2-乙酰乳酸,进人L-亮氨酸和L-氨酸的合成途径；第二个反应则是催化2-酮基丁酸和丙酮酸生成2-乙酰-2-羟基丁酸,进而合成L-异亮氨酸8-9。因此,AHAS在支链氨基酸的合成过程中占有重要的地位。目前对AHAS的蛋白质改造主要集中于降低其对支链氨基酸的敏感性,从而来降低支链氨基酸的反馈抑制0 。Guo等发现A42V、A 8 9V、K 136 E、A42V、A 8 9 V 这些突变位点对于AHAS的蛋白质改造具有一定意义l;Zhang等首先过表达基因ilvBN，然后将47 位异亮氨酸突变成酪氨酸来减少46JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 9 2023丙酮酸AHASilvBN2-乙酰乳酸NADPHNADP.42,3-二氢异戊酸乙酰-CoA2-酮基异戊酸CoARleu.AC-IPMS2-异丙基苹果酸NADNADH2-酮基-4-甲基泛酸TAsNADPHilvENADPL-亮氨酸图1L-亮氨酸合成代谢途径Fig.1Metabolic pathway of synthetic L-leucine反馈抑制，最终重组菌株的L-亮氨酸产量达到了32.1g/L2l;Hasegawa等发现如果将谷氨酸棒杆菌中iluN基因的156 位Gly定点突变成Glu，并且敲除谷氨酸棒杆菌中的ldhA基因，同时过表达iluBNCDE可以有效提高AHAS抗反馈抑制的能力，结合工艺优化后L-缬氨酸产量可达2 2 7 g/L3;Lu等通过定点诱变技术，定点诱变AHAS调节亚基上的位点（N11S、T 34I、A 36 V、T 10 4S、N11F、G 14E和N29H),使突变体对L-异亮氨酸敏感性显著下降4。同时,在代谢工程方面对AHAS的改造也有一定的进展。Hou等在黄色短杆菌中串联表达经定点突变的iluEBNC基因,L-缬氨酸产量达到了38 g/L5;Wang等将基因ilwBNC的原始启动子替换成Pug启动子后，重组菌株最终摇瓶发酵可获得2 8.47 g/L的L-亮氨酸;崔毅引入L-缬氨酸生产菌中的AHAS突变体，最终分批补料发酵生产39.8 g/L的L-亮氨酸9;陈宁等改变中心碳代谢途径，最终使得L-亮氨酸的产量(53.0 g/L)提高10.0%g。在谷氨酸棒杆菌中,AHAS对2-酮基丁酸的亲和力明显高于丙酮酸,所以当丙酮酸和2-酮基丁酸同时存在时，AHAS会优先利用2-酮基丁酸合成L-异亮氨酸7。由此可以推测出当存在较高含量的2-酮基丁酸时，可能会造成L-缬氨酸和L-亮氨酸的合成受限制而造成生长缺陷18,从而不利于L-亮氨酸的积累。作者通过蛋白质改造工程对AHAS进2-酮基丁酸2-乙酰-2-羟基丁酸AHAIRNADPNADPHivc2,3-二氢-3-甲基戊酸DHADibvDTAsilvEL-缬氨酸2-酮基-3-甲基戊酸NADPHNADPL-异亮氨酸支链氨基酸研究论文刘宁，等：改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量行理性改造，针对其底物偏好性做出优化，利用同源建模和分子模拟找出合适突变位点，筛选出最优突变体来提高AHAS对丙酮酸的催化能力，从而提高L-亮氨酸产量。材料与方法1.1主要试剂异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、2 x Ph a n t aMax Master Mix、2 x T a g M a x M a s t e r M i x (D y e Pl u s)、卡那霉素：南京诺唯赞生物科技有限公司产品；限制性内切酶、DNA连接酶：赛默飞世尔科技有限公司产品；酵母提取物、胰蛋白陈：英国Oxoid公司产主要菌株以及质粒C.glutamicum XL-3BL21/pET-28a-ilvBNBL21/pET-28a-ilb BIVshrBL21/pET-28a-ilvBNAgl3slsBL21/pET-28a-ilBIVChn54ysBL21/pET-28a-ilvBIVCh17Ag菌BL21/pET-28a-iluBNVSt38hw/Agl381s株BL21/pET-28a-iluBIVSse381w/Ch1541lsBL21/pET-28a-ilBNSes8nw/Ch157AngBL21/pET-28a-iloBNAgl3sl/Chi14lysBL21/pET-28a-ilbBINAagl3ly-Ch17AgBL21/pET-28a-ilbBINGhn154lsyCh157ArgC.glutamicum XL-3-1pET-28apK18mobsacBpET-28a-ilvBNpET-28a-ilvBNVser38AlapET-28a-ilvBNle2Ala质pET-28a-ilvBINPo134Ala粒pET-28a-ilvBNAg138AlapET-28a-ilvBIVCh154AlapET-28a-ilvBIVse15AlapET-28a-ilvBIVClnls7AlapET-28a-ilvBIVSerashrpET-28a-iluBVArg/38ys品；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒、定点突变试剂盒：上海生工生物工程股份有限公司产品。1.2菌株与质粒出发菌株为作者所在实验室保藏的C.glutamicum XL-3,由菌株 C.glutamicum XQ-9诱变而来的一株L-亮氨酸生产菌株19。本研究中利用质粒pET-28a进行蛋白质表达，利用质粒pK18mobsacB进行基因的敲除或替换，大肠杆菌JM109用于质粒构建，大肠杆菌BL21(DE3)用于表达目的蛋白质。本实验中所用的主要菌株与质粒如表1所示，所用引物如表2 所示。表1本研究中用到的菌株和质粒Table 1Strains and plasmids used in this study相关特性L-亮氨酸生产菌株菌株E.coliBL21携带质粒pET-28a-ilvBN菌株E.coli BL21携带质粒 pET-28a-ilu BVNsashr菌株E.coli BL21携带质粒 pET-28a-ilbBNArl3sls菌株E.coliBL21携带质粒pET-28a-ilvBINChi54ls菌株E.coliBL21携带质粒pET-28a-iluBINCh157Ag菌株 E.coli BL21携带质粒 pET-28a-ilbBVNs38mwagl380s菌株 E.coli BL21携带质粒 pET-28a-ilbBNs38hiwChn54s菌株E.coli BL21携带质粒 pET-28a-iluBNSasniwChn17ng菌株E.coliBL21携带质粒pET-28a-iloBNAr138liyChn154y菌株E.coli BL21携带质粒pET-28a-ilbBNAagl3lyCh157ag菌株E.coli BL21携带质粒pET-28a-ilu BNCh154ywChn157ag菌株C.glutamicumXL-3携带突变基因iluBINChn157AngC.glutamicum中敲除质粒pET-28a携带基因ilBNpET-28a携带突变基因iluBINSe38AlapET-28a携带突变基因iluBNVle2AlapET-28a携带突变基因iluBNPo134AlapET-28a携带突变基因ilvBNAag138AlapET-28a携带突变基因iluBINChn154AlapET-28a携带突变基因iluBNVSe15SlapET-28a 携带突变基因 iluBCh157AlapET-28a携带突变基因iluBNSeashrpET-28a携带突变基因ilvBNAng1381ys来源作者所在实验室保藏本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建表达质粒作者所在实验室保藏作者所在实验室保藏本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第9 期47RESEARCHARTICLELIU Ning,et al:Improvement of,L-Leucine Production by ModifyingAcetohydroxy Acid Synthase续表1主要菌株以及质粒pET-28a-ilBNCh154lyspET-28a-iluBVClh157ArgpET-28a-iluBNSer38nhwAg38lyspET-28a-iluBNSer381ha/Ch154lys质pET-28a-ilvBINSeshaCh157Arg粒pET-28a-iluBNAg/38IyChn154lyspET-28a-iluBNArg38lywCn1s7AgpET-28a-ilvBINCln154ly/Cln157AgpK18mobsacB-iluBNpK18mobsacB-ilvBINCh157Ang引物pET-28a-ilvBN-FpET-28a-ilvBN-Rilo BIVsa3sAl-RiluB/Nle2Al-Rilo BIVPbol3Al-Filbo BINPo134Ala-RiluBNAng/38Al-Filo BIVChi54Al-Fily BIVClnsAl-RiluBIVChi17Al-Filu BINCh157Al-RiloBINSe38shnr-Filu BIVChis4Is-Filu BINChi54ls-RiloBINChI57Ar-Filu BINChI57Arm-RpK18-iluBN-FpK18-iluBN-RpK18-ilvBINChis7An-FpK18-ilvBINChi57Are-R相关特性pET-28a携带突变基因ilvBINChis41spET-28a携带突变基因ilvBIVCh157ArgpET-28a携带突变基因iluBNVSe38mu/Ag13810spET-28a携带突变基因iluBIVSe38ma/Ch14lspET-28a携带突变基因iluB/VSa38haChn157AngpET-28a携带突变基因iluBNAg138lyCh14spET-28a携带突变基因iluBINAag1381owCh157AngpET-28a携带突变基因iluBINChn154lgyCh157AngpK18mobsacB携带基因iluBNpK18mobsacB携带突变基因iluBINCh157Arg表2 本研究中用到的引物Table2Primers used in this study序列（53）CGCGGATCCGTGAATGTGCCAGCTTCTCCCGGAATTCTTAGATCTTGGCCGGAGACCTCGTGGCCCTCGTGTCTGCAAAGACCGACACGAGGGCCACGAGGTTGAATGCGCGTCCCCGCGCAGCCATGCTGGTTAAGGTCTCTTAACCAGCATGGCTGCGCGGGCGATAGTGCAGGCACCGCCGGCAAGCTCCGCGCACTGGAGCTTGCCGGCGGTGCCTGTGGATTCAATGCAAGCTCGCCGCACTGCTTGACGTGATGCAGTGCGGCGAGCTTGCCTGGGGTGCCACTGATCGCCTCCGGACAGATTGCACTCTCTGTCCGGAGGCGATCAGTTCGCGGAACTGATCCAAGCCGGACAGATTGCACTCTCTGTCCGGCTTGGATCAGTTCGCGGATCCGGAGCCATTGCACTCAACCGCGGTCCGTGCAATGGCTCCGGATTGGATCAGTTACCTCGTGACCCTCGTGTCTGCAAAGACCGACACGAGGGTCACGAGGTTGAATGCGCGTCGCAAGCTCAAGCCACTGCTTGACGTGATGCAGTGCCTTGAGCTTGCCTGGGGTGCCACTGATCAAGTCCGGACAGATTGCACTCTCTGTCCGGACTTGATCAGTTCGCGGATCCGGACGCATTGCACTCAACCGCGGTCCGTGCAATGCGTCCGGATTGGATCAGTTCCGGAATTCGTGAATGTGGCAGCTTCGCTCTAGATTAGATCTTGGCCGGAGCCATTCCGGACGCATTGCACTCAACCGCGGTCCGTGCAATGCGTCCGGATTGGATCAGTT来源本研究构建作者所在实验室保藏本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建本研究构建限制性酶BamHIEcoRIEcoRIXbal48JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 9 2023研究论文刘宁，等：改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量1.3培养基与诱导表达LB培养基(g/L):胰蛋白陈10、酵母提取物5、NaCl10。LBG 培养基：葡萄糖5、胰蛋白陈10、酵母提取物5、NaCl10。EPO 培养基：在LBG培养基的基础上添加30 g/L甘氨酸、4g/L异烟肼和1g/L吐温-8 0。LBHIS培养基：在LB培养基的基础上添加91g/L山梨醇和18.5g/L脑心浸出液。种子培养基(g/L)：葡萄糖30、玉米浆30、硫酸铵5、酵母浸膏10、柠檬酸钠10、K,HP043H201.3、M n S0 44H200.01、M g S0 4.7 H,0 0.4、生物素2 10 4、硫胺素310 4和L-蛋氨酸0.4。发酵培养基（g/L)：葡萄糖130、玉米浆2 5、醋酸铵15、硫酸铵15、柠檬酸钠2、MgS047H200.5、K 2 H P0 43H201.3、L-蛋氨酸0.7、L-异亮氨酸0.0 6、L-谷氨酸0.5、MnS04H.00.01、生物素1x104、硫胺素 2 x104、Ca CO;30。大肠杆菌在LB培养基中生长,培养条件是37、100r/min。谷氨酸棒杆菌在LBG培养基中生长,培养条件是30、10 0 r/min20。使用EPO培养基和LBHIS培养基构建谷氨酸棒杆菌重组菌株2 。此外，用50 g/mL卡那霉素构建质粒，用2 5g/mL卡那霉素筛选重组菌株。诱导表达：将大肠杆菌BL21（D E3）接种于10mL液体LB培养基中，在37、10 0 r/min的摇床中培养10 12 h，然后以5%接种体积分数转移到TB培养基中。当菌液OD600mm达到0.5 0.6 时加人诱导剂IPTG(0.5mmol/L),然后放置于16、10 0 r/min的摇床中培养16 2 0 h。将诱导表达培养后的菌体在4下以10 0 0 0 r/min离心10 min，用体积分数2%的冷KCl溶液洗涤细胞2 次。然后用10 0 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.4)悬浮细胞。利用超声破碎仪进行细胞破碎15 2 0 min，然后离心收集上清液，则为粗酶液叫。1.4蛋白质纯化首先将粗酶液通过0.45m孔径的过滤头进行过滤处理，然后用结合液（10 mmol/L咪唑、10 0mmol/L磷酸钾缓冲液,pH7.4,15mL)清洗纯化柱。用洗脱液（30 0 mmol/L咪唑、10 0 mmol/L磷酸钾缓冲液,pH7.4,15mL)洗脱挂柱的蛋白质。洗脱时间为2 0 min，洗脱过程中结合液和洗脱液体积比从90:10至40:6 0。纯化后的酶在4或-8 0 下保存。1.5分析方法1.5.1车软件分析本研究中使用了蛋白质分析软件Schordinger、Py M O L以及同源建模网站Swissmodel。1.5.2目的产物测定目的产物以及支链氨基酸主要通过高效液相色谱测定2 2 。色谱柱为AgilentHC-Cis(4.6 mmx250 mm,5 m),流动相A为乙腈-水溶液（体积比6 0:40），流动相B为乙腈-0.0 14mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.2,体积比2 0:8 0），流量为1.0mL/min，柱温为30,检测波长为36 0 nm,进样体积为10 L,每个样品30 min,最终流动相A与B的体积比为8 0:2 0。1.5.3酶活力测定反应体系为磷酸钾缓冲液（10 0 m m o l/L,p H 7.4）,含50 mmol/L丙酮酸钠、10mmol/LMgClz、10 0 m m o l/L硫胺素焦磷酸盐(TPP)和10 0 mmol/L黄素腺嘌呤二核苷酸。首先添加10 0 L酶液至2.5mg磷酸钾缓冲液中开始反应，然后在37 下孵育1h，最后添加2 0 0 L3mol/LH,SO4终止反应，混合物在6 0 处理15min。1mL体积分数0.5%肌酸和1mL体积分数5%-萘酚（在2.5mol/LNaOH中进行制备）添加到混合物中，然后在6 0 处理2 0 min，最终在52 5nm处测量反应的吸光度。对照组以同样的方式进行处理。一个酶活力单位被定义为每毫克蛋白质每分钟形成的1 nmol 乙酰乳酸。1.6谷氨酸棒杆菌双交换同源重组策略谷氨酸棒杆菌双交换同源重组策略如图2 所示2 3,整个过程使用自杀型质粒pK18mobsacB。首先通过融合PCR技术将要敲除或替换基因的同源臂进行融合，获得目的片段，然后将目的片段通过酶切酶连技术与空质粒载体pK18mobsacB连接在一起，获得敲除或替换质粒。将质粒电转入提前制备好的谷氨酸棒杆菌感受态中完成第一次同源重组，这一步骤通过卡那霉素抗性以及琼脂糖凝胶电泳进行筛选，成功获得完成一次同源的菌株之后进行二次同源筛选。由于质粒pK18mobsacB携带了sacB基因,此基因编码的蛋白质使得完成一次同源的菌株不能在含有蔗糖的培养基中生存,利用sacB蔗糖致死原理将质粒从菌株中脱落来完成二次同源，从而获得目的重组菌株。食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第9 期49RESEARCHARTICLELIU Ning,et al:Improvement of L-Leucine Production by ModifyingAcetohydroxy Acid SynthaseA-L第一次同源重组A-LA-RkanSacB卡那霉素抗性挑选/HA-LkanA-LA-LA-L回复野生型图2 pK18mobsacB敲除基因流程Fig.2 Gene knockout of pK18mobsacB plasmid2结果与分析2.1突变位点的选择AHAS是由基因iluBN编码的合成支链氨基酸的第一个限速酶,是由两个大亚基和两个小亚基组成的四聚体,效应物主要与小亚基结合，使小亚基结构改变达到催化底物的作用，所以后续的蛋白质改造主要针对AHAS的小亚基结构（编码基因lvN)进行突变改造。代谢过程中丙酮酸与小亚基结合，催化两分子丙酮酸脱羧缩合形成2-乙酰乳酸，同时也可催化一分子丙酮酸与一分子2-酮基丁酸缩合形成2-乙酰-2-羟基丁酸。当丙酮酸和2-酮基丁酸同时存在时，AHAS会优先利用2-酮基丁酸合成L-异亮氨酸，而为了使L-亮氨酸的产量进一步得到优化，本研究中尝试突变AHAS使其更偏向催化丙酮酸生成2-乙酰乳酸,用于合成目的产物。考虑到想要改变酶对底物丙酮酸的亲和性，首先增加酶与底物的结合稳定性,所以研究过程中主要针对AHAS与丙酮酸底物结合位点4A范围内的氨基酸残基进行突变。目前还未有报道谷氨酸棒杆菌中AHAS小亚基精确的蛋白质结构，所以首先利用了同源建模网站Swissmodel进行AHAS蛋白质结构的预测，以2pc6A(2.5A)作为模板同源建模得到了AHAS小亚基的蛋白质结构。通过分子对接软件Schordinger将小亚基和丙酮酸进行对接，然后将对接结构导入PyMOL进行分析2 4。结果如图3(a)所示,对接之后发现Ser38、I l e 92、Pr o 134、A r g 138、G l n 154、Se r 155和50JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 9 2023A-RA-Rkan第二次同源重组SacBA-RA-R蔗糖致死筛选A-RH/谷氨酸棒杆菌基因组SacBA-LkanA-LA-LA-L基因敲除型Gln157位于丙酮酸结合位点附近,推测这7 个氨基酸残基可能对底物丙酮酸的结合有一定的作用。为了找出对底物结合有重要作用的氨基酸残基,分别将以上7 个氨基酸突变成丙氨酸,并测定突变酶催化丙酮酸的酶活力。突变体酶活力测定结果如图3（b)所示，可以看出，对比AHASW(野生型）,突变体AHASIle92Al、AHASPo134Ala以及AHASser5Ala的酶活力变化较小，推测可能不是催化过程中关键的氨基酸残基,而突变体AHASt38l,AHAS Aagl38Al AHASGm14Ala 和AHASGh17lh的酶活力明显下降，分别下降至初始酶活力的21%、2 8%、53%和45%，在一定程度上说明这4个位点可能对丙酮酸底物结合口袋比较重要。通过分子模拟软件进一步分析以上位点与丙酮酸的相互作用,结果如图3（c)所示，Ser38、A r g 138 与底物丙酮酸之间形成氢键,理论上这两个氨基酸残基对于酶催化底物起着关键的作用，同时这也可能是导致突变体AHASSer38la和AHASArg138Ala酶活力明显下降的原因。Gln154和Gln157虽然与丙酮酸没有直接的相互作用力，但是其突变成Ala后酶活力也受到了较大的影响，推测这两个位点可能对催化反应有重要的作用。因此后续研究将围绕这4个位点进行定点突变来提高酶活力。2.2突变体筛选目前对于蛋白质改造主要通过序列比对、分子模拟技术以及定点突变挖掘潜在保守位点，将氨基酸突变成性质相同或者相反的氨基酸,可能使蛋白质与分子间形成新的空间构象或者形成新的键，从ARH/sacBA-RA-R蔗糖致死筛选A-R研究论文刘宁，等：改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量菌BL21（D E3）中获得重组菌株BL21/pET-28a-突变体Gln154Ile92Ser155Ser38(a）分子对接结果12010080%/6040200ASTVHV图3分子对接以及突变体的酶活力分析结果Fig.3 Results of molecular docking and enzyme activityanalysis of mutants而导致两者结合更加紧密，也可能使底物结合口袋发生变化使得蛋白质对底物的偏好性发生改变。为了进一步对 Ser38、A r g 138、G l n 154 和 Gln157这 4个位点进行研究，尝试进行以下突变Ser38Thr、Arg138Lys、G l n 154Ly s 以及Gln157Arg，通过定点突变试剂盒得到突变质粒，将质粒转化到菌株大肠杆iluBNSe38hlr BL21/pET-28a-ilvBNAg1381ys BL21/pET-28a-ilo BINCm154s 和BL21/pET-28a-ilbBNGm157Ang，酶活Arg138力测定方法参考1.5.3部分。Pro134单突变体酶活力测定结果如图4（a）所示,与Gln157AHASWT相比较，AHASArg13814s和AHASChn1541/分别下降了13%和2%，但是AHASe38lr和AHASCln157Ag的酶活力分别上升了14%和41%，结果表明通过单突变使得酶活力有了一定的提升。为了进一步提高酶活力，将选择的4种突变体分别进行两两组合突变，从而获得了新的突变体AHASser38m/Arg3810gAHASAng31ycCh17ng 以及 AHASCl14lyCh17Arg。双突变体酶活力测定结果如图4(b)所示,突变体AHASSer38hachn154lys和AHASAng138Ly/Cln157Anm的酶活力与AHASWT相比分别上升了2 0%和14%，但是都没有单突变体eiVssIVLSTUSVHYHAS(b）丙氨酸扫描突变体相对酶活力Gln157Ser38丙酮酸Gln154Arg138（c）4个位点与丙酮酸分子对接结果AHASChn157Am酶活力高，推测可能是组合突变对酶的VH催化空间构型产生了较大的影响，使得蛋白质与底物结合不紧密。实验中测定了野生型和突变体酶对突变体丙酮酸的动力学参数,结果如表3所示，与AHASWT相比，突变体AHASChm157Arg对底物丙酮酸的Km值下降，说明将AHAS的157 位从Gln突变为Arg后在一定程度上改变了底物偏好性,提高了酶对丙酮酸的催化能力。同时从表中可以得到突变体AHASChm157Ang的Kea/Km高于AHASWT，所以突变酶与野生酶相比有更高的催化效率，最终选择AHASCln157Arg为最优突变体。150120%906030F0HVHV（a）单突变体相对酶活力食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第9 期51RESEARCHARTICLELIU Ning,et al:Improvement of L-Leucine Production by ModifyingAcetohydroxy Acid Synthase2.3AHAS及突变体结构分析150通过上述实验得到了一个最佳的突变体120AHASCh157Ang，提高了酶活力，且显著提高了AHAS对底物丙酮酸的亲和性。为了进一步探究酶活力提高%9060300ASVHV图4突变体的酶活力分析Fig.4Enzyme activity analysis of mutants表3野生型和突变体酶对丙酮酸合成的动力学参数Table 3Kinetic parameters of wild-type enzyme and mutants to pyruvate突变体AHASWTAHA.SSsr38mrAHASAg138LysAHA.SClh154lysAHA.SClhI57AngAHA.SSu38ha/Ch154lyAHASAgl38IsyChni54lyAHASAig1384y/Clh157AngAHASCh154ly/Clh157Ang大，这个改变可能会缩小底物结合口袋，而丙酮酸体积本身就比较小，缩小的口袋就会更契合丙酮酸,推测这也是突变体酶活力提高的原因之一。此外，分析了AHASWT和AHASCln157Ang与底物2-酮基丁酸的结合情况。如图5(c)所示,AHASW与底物2-酮基丁酸之间形成了3个氢键,氨基酸结合位点分别是Ser38、G ln 157 以及Arg138。当157 位氨基酸从Gln突变为Arg后，突变体AHASCh157Am的157位氨基酸残基失去了与2-酮基丁酸的氢键作用(（见图5(d)）,这可能会减弱突变体对2-酮基丁酸的亲的原因，利用蛋白质分子软件对突变体进行解析。首先利用分子对接软件Schordinger将突变后的酶与底物丙酮酸和2-酮基丁酸进行对接,随后将结果导入PyMOL进行相互作用的分析2 4,分析结果如图5所示。由图5(a)可知,AHAS的Gln157在没有突变之前虽然与底物丙酮酸结合位点比较相近，但是与丙酮酸没有直接的相互作用。然而突变体AHASClm157Arg的氨基酸残基Arg157与底物丙酮酸之SSVHVSVHV突变体（b）双突变体相对酶活力比酶活/（mU/mg）724815602754975373893554515855654SVHVVSVHV间多了一个氢键(见图5(b)，氢键对于蛋白质与小分子配体之间起着十分关键的作用，这使得丙酮酸与AHAS之间结合更加稳定，增加了底物亲和性，这可能是突变提高酶活力的重要原因。其次,157 位氨基酸从Gln突变为Arg后氨基酸残基的侧链变动力学参数K./(mmol/L)5.20.24.50.58.20.55.20.42.50.255.43.13.40.37.30.537.42.73.70.25.50.4和力，改变其对底物丙酮酸和2-酮基丁酸的偏好性，从而使更多的碳通量流向L-亮氨酸合成途径，减少副产物L-异亮氨酸的积累。2.4重组菌株的产量测定选择了最优突变体AHASCl17Am，使用谷氨酸棒杆菌双交换同源重组策略将突变位点引入到基因组，菌株构建过程参考1.6 部分。通过测序验证获得重组菌株C.glutamicum XL-3-ilvBINCm1s7Ang（C.g lu t a m i c u m X L-3-1）。将获得的重组菌株C.glutamicum XL-3-1摇