医学复和修复医学知识宣讲.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,复和修复医学知识宣讲,I consider,molecular biology,to be the study of,genes and their activities at the molecular level,including,transcription,translation,DNA replication,recombination,and,translocation,.,Molecular Biology,-Robert Weaver,分子生物学在,分子水平,上研究,核酸与蛋白质的,功能,1.,基因组在细胞和世代中的维持,DNA,的,复制,、修复和重组,2.,基因的表达与调控,基因的,转录,和,翻译,、蛋白质的修饰，原核与真核基因,表达调控,3.,基因表达与,细胞信号,的偶联,4.,分子生物学技术及其应用,DNA,操作技术、基因工程、基因诊断、基因治疗,分子生物学发展简史,奠基时代,（,1869,1952,）,物理学与生物学的融合,遗传物质化学本质（,DNA,）的确定,黄金时代,（,1953,1972,）,DNA,双螺旋结构和复制机制的发现,分子生物学所有基本原理于此诞生,基因工程时代,（,1973,今）,基因工程的诞生与发展,分子生物学技术进入生命科学所有领域,迈向“组学”时代,（,2000,）,兼顾“假说导向”与“发现导向”的科学研究方法,实验室为主体,规模化平台组合,策略性强,战略性强,常规投入、随时启动,持续投入、长期规划,总费用低、单位费用高,总费用高、单位费用低,研究形式为假说驱动为主,研究形式为发现驱动为主,科学前沿问题,科学前沿重大方向性问题,规范管理机制,创新管理机制,依赖领军科学家,依赖团队,主学科聚焦,多学科交叉,实验技术组合,技术平台组合,依赖技术积累,依赖技术更新,医学分子生物学的研究主题是健康与疾病的分子机制,人类发育调控和功能调控的分子基础,疾病的分子机制,生物工程与生物制药,预防医学,基因诊断与基因治疗,分子生物学在医学领域的应用,用基因敲除技术探讨发育的分子机制,单个抑癌基因的突变即可导致肿瘤的发生,重组蛋白技术用于药物生产,这些金色的转基因大米里含有,b,-,胡萝卜素,食用这种大米可以预防维生素,A,缺乏症。,RFLP,技术在法医学中的应用,Defendantsblood,Blood fromdefendantsclothes,Victimsblood,DNA,的合成及重组,DNA Biosynthesis and Recombination,第十六章,DNA,生物合成,DNA,复制,（,DNA,指导的,DNA,合成,）,逆转录,(,逆转录病毒,RNA,指导的,DNA,合成,),校正复制中可能出现的错误，并修复受到损伤的,DNA,细胞中酶促修复系统,自然界,DNA,重组和基因转移的基本方式,基因组复制的主要特点,The General features of Genome Replication,第一节,一、基因组是细胞或病毒全部遗传信息的总和,含有一种生物的一整套遗传信息的遗传物质，称为,基因组（,genome,）,。在真核生物体中，基因组是指一套完整单倍体,DNA,（染色体,DNA,）和线粒体,DNA,的全部序列。,核基因组,线粒体基因组,人类基因组包括,人类基因,组（,Genome,）,人类基因组,包含,22,条常染色体,和,X,、,Y,两条性染色体,上的遗传物质（,核基因组,）和,线粒体,的遗传物质（,线粒体基因组,）。,人类染色体的,RxFISH,图谱,基因,假基因,重复序列,人类基因组,7,号染色体,-TCR,基因座的某,50kb,区域,基因片段,全长,16,569bp,，含,37,个基因,。,其中,13,个基因,编码,蛋白质,，,其余,24,个编码,rRNA,和,tRNA,。,人线粒体基因组图谱,人类基因组各成分所占比例,二、基因组,DNA,复制具备一些共同特征,复制是,半保留,的,在复制的生长点形成,复制叉,复制是,双向,的,复制是,半不连续,的,复制起点,由多个短重复序列组成,DNA,的复制必须有,引物,复制需要多种,酶,和,蛋白因子,的参与,基因组复制是,高保真,的,1.DNA,复制是,半保留复制,DNA,双螺旋中的每一条链都作为合成互补链的模板，,其结果就使得两条子代的双螺旋都和母本完全一致。,Meselson-Stahl,实验,2.DNA,复制的生长点形成,复制叉,复制叉,复制叉,复制泡,复制起点,3.DNA,复制是,双向复制,4.DNA,复制是,半不连续复制,冈崎片段,两个原因造成了,DNA,的半不连续复制：,DNA,双链是,反向平行的,；,DNA,合成的方向只能是,5-3,。,在一条模板上，,DNA,能进行连续的合成，,DNA,聚合酶简单地尾随着复制叉，此模板所指导合成的新,DNA,链称为,前导链,。,在另一条模板上，,DNA,聚合酶与复制叉做反向运动，此模板指导合成的是,后随链,。,后随链上形成的新链,DNA,片段，称为,冈崎片段,。,5.,复制起点,有特殊的结构,复制的起始并非一个随机的过程，它总是在,DNA,分子上的同一个或多个位置开始的，这些位点被称为,复制起始点,（,Origin of Replication,）。,环状的细菌基因组只有一个复制起点，这意味着每一个复制叉要复制几千,kb,的,DNA,。,酿酒酵母约有,300,个复制起点，每一个起点对应,40kb,；而人类有,20,000,个起点，每个起点对应约,150kb,的,DNA,。,GATTNTTTATTT,GATCTNTTNTATT,GATCTCTTATTAG,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-,-TTATACACA-,-,TTTGGATAA-,-,TTATCCACA,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,E.coli,复制起始点,oriC,真核生物有多个复制起始点,酿酒酵母的第三号染色体是已知最小的真核生物染色体，它包含,180,个基因和,9,个复制起点。,真核生物复制起始点的结构,复制起点（,OBR,）由一些,短重复序列,组成。,酵母,OBR,结构已被阐明，哺乳动物,OBR,精细结构尚在研究中。,结合,OBR,并启动复制的,蛋白复合物,称为,复制起点复合物,（,ORC,）。,6.DNA,复制需要,引物,多数,DNA,复制使用,新合成的短,RNA,引物。,个别,DNA,复制以,DNA,、,tRNA,或蛋白质做引物。,7.,复制需要多种,酶,和,蛋白因子,的参与,原核生物,真核生物,引物酶,DnaG,DNA,聚合酶,DNA,解螺旋酶,DnaB,Mcm2-7,SSB,SSB,RPA,拓扑异构酶,拓扑异构酶,II,拓扑异构酶,I,、,II,8.,基因组复制是,高保真,的,DNA,聚合酶每添加,10,5,个核苷酸中，仅掺入一个不正确的核苷酸；,校正外切核酸酶使不正确配对的的概率降低到,10,-7,；,错配修复系统使最终的出错机率降低到,10,-10,。,这相当于每复制,1000,个细菌基因组，仅出现一个错误的核苷酸。,三、不同基因组,DNA,通过不同的模式,进行复制,（一）真核生物基因组,DNA,复制过程涉及反转录,（端粒的复制）,（二）单链,DNA,病毒基因组通过复制中间体复制,（三）,HBV,基因组通过,RNA,中间体进行复制,（四）双链环状,DNA,也有不同的复制方式,DNA,复制过程,Process of DNA Replication,第二节,一、细菌的,DNA,复制,复制的起始,复制叉上的,DNA,复制,复制的终止,E.coli,复制起始点,oriC,GATTNTTTATTT,GATCTNTTNTATT,GATCTCTTATTAG,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-,-TTATACACA-,-,TTTGGATAA-,-,TTATCCACA,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,E.coli,DNA,复制起始和复制叉的形成,在,E.coli,复制起始过程中，,DnaA,、,DnaB/C,（,解螺旋酶,）、,DnaG,（,引物酶,）和,DNA,聚合酶,III,依次加入，形成最初的复制叉。,DNA,聚合酶催化的复制反应,复制叉上的,DNA,合成,（一）,DNA,聚合酶催化的,复制反应,DNA,复制反应的底物是,dNTP,和,引物,-,模板连接处,反应由,DNA,聚合酶,催化,聚合酶,活性中心,外切核酸酶,活性中心,所有的,DNA,聚合酶都有,相似的空间结构,与,DNA,聚合酶结合的,金属离子,催化核苷酸的添加,DNA,聚合酶能分辨,正确,与,错误的碱基,DNA,聚合酶能分辨,dNTP,与,NTP,DNA,聚合酶具有,延伸能力,DNA,聚合酶的,延伸能力,（,processivity,）定义为每次酶与引物,-,模板接头结合时所添加核苷酸的平均数；,每种,DNA,聚合酶都有其特征性的延伸能力，从几个到,50000,个核苷酸不等；,DNA,聚合酶与完全包围,DNA,的“,滑动夹,”蛋白之间的相互作用，可进一步提高延伸能力。,外切核酸酶活性,校正,新合成的,DNA,影响,DNA,聚合酶精确度的主要因素是碱基变成“错误”的互变异构体（亚氨基或烯醇基）；,错配的核苷酸,激活,3-5,外切核酸酶活性,；,错配核苷酸去除后，构象恢复，,DNA,聚合反应继续进行。,（二）复制叉上的,DNA,合成,前面我们讨论了引物,-,模板接头处,DNA,的合成，然而在细胞内，,DNA,的双链是同时复制的。这就必须解决：,半不连续复制,；,RNA,引物,的合成和去除；,解开复制叉,及相关的拓扑学问题。,复制叉上,DNA,的合成是半不连续的,前导链,后随链,合成方向与解链方向,相同,合成方向与解链方向,相反,RNA,引物的合成与去除,所有的,DNA,聚合酶都不能从头合成,DNA,链；,RNA,聚合酶,具有从头合成核苷酸链的能力；,细胞利用一种特殊的,RNA,聚合酶来启动复制：,引物酶,，能在单链,DNA,模板上合成,5-10,个核苷酸长度的,短,RNA,引物,，,DNA,聚合酶随后延伸这些引物。,E.coli,的引物酶是,DnaG,蛋白,，真核生物的引物酶是,DNA,聚合酶,的,p48,亚基。,原核与真核生物,RNA,引物的合成,聚合酶转换,RNA,引物的去除,RNase,H,可去除,DNA:RNA,杂交链中的,RNA,；,DNA,聚合酶（,E.coli,中是,DNA,聚合酶,I,，真核生物中目前认为是,DNA,聚合酶,或,）填补去除引物后留下的空隙（,gap,）；,DNA,连接酶,连接两个相邻的核苷酸。,在复制叉上有多种蛋白质协同解开双螺旋,DNA,聚合酶本身不能解开双螺旋，因此还需要多种酶和蛋白因子的协同作用，它们完成以下三项任务：,将,DNA,双螺旋分开,以形成两条单链,DNA,模板；,保证复制前单链,DNA,保持伸直状态,；,解决分开,DNA,双螺旋而引起的,拓扑学问题,。,解螺旋酶,解开,DNA,双螺旋,DNA,解螺旋酶通常是,六聚体,蛋白，环绕着,DNA,，因此有很高的,延伸能力,；,解螺旋酶利用,ATP,的能量解开双螺旋；,所有解螺旋酶都有,极性,（,polarity,），即特异性地结合,DNA,双链中的一条。,E.coli,的解螺旋酶是,DnaB,蛋白,，它本身是六聚体，又与六个,DnaC,蛋白,共同组成解螺旋复合物；,人类的解螺旋酶目前认为是,Mcm2-7,复合物，同样是六聚体；,DnaB,解螺旋方向为,5-3,，即结合,后随链的模板,。,单链结合蛋白,使单链,DNA,稳定,DNA,解螺旋酶打开双螺旋后，新生成的单链,DNA,必须保持碱基未配对的状态，直至成为模板。,单链,DNA,结合蛋白,（,SSB,）结合到单链,DNA,上，使单链模板保持伸直的状态。,人类的单链结合蛋白是,RPA,蛋白，它是异三聚体，三个亚基分别是,p70,、,p34,、,p11,。,拓扑异构酶,除去解螺旋时产生的超螺旋,DNA,复制中的拓扑学难题：,在解链过程中伴随着,DNA,分子的旋转：双螺旋中每,10bp,形成一周；,以人的,1,号染色体为例，,1,号染色体长,250Mb,，复制时就必须旋转,2500,万次；,细菌和噬菌体等环状基因组，则不可能以旋转的方式解螺旋。,解链过程中正超螺旋的形成,拓扑异构酶,切断,DNA,双链中,一股,链，使,DNA,解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，,DNA,变为松弛状态。,反应,不需,ATP,。,拓扑异构酶的作用机制,拓扑异构酶的作用机制,拓扑异构酶,切断,DNA,分子,两股,链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。,利用,ATP,供能，连接断端，,DNA,分子进入负超螺旋状态。,本图显示,拓扑异构酶,II,除去由复制叉所产生的正超螺旋：,通过“,断裂,-,再连接,”的方式，将未复制的,DNA,的一部分通过未复制区域的断裂点以消除正超螺旋。,该反应使连环数减少,2,，因此每复制,20bp,将会发生一次。,复制叉酶扩大了,DNA,聚合酶的底物范围,DNA,聚合酶本身只能延伸已合成的引物，但是引物酶、解螺旋酶和拓扑异构酶的加入极大地扩大了,DNA,聚合酶可能的底物范围：,引物酶,使得,DNA,聚合酶能复制任何,单链,DNA,；,DNA,解螺旋酶,和,拓扑异构酶,使得,DNA,聚合酶能复制任何,双链,DNA,。,没有这些酶的参与，复制叉是不可想象的。,DNA,聚合酶是,高度特化,的,细胞内有多种,DNA,聚合酶，它们为执行不同的生物学功能而高度特化了：,E.coli,有,5,种,DNA,聚合酶，其中,Pol III,是复制酶；,真核生物有超过,10,种,DNA,聚合酶，其中,DNA,聚合酶,有引物酶活性，,DNA,聚合酶,和,是复制酶,。,TLS,1,Rev 1,TLS,，体细胞高变,1,Pol,相对准确的,TLS,（穿越环丁烷二聚体）,1,Pol,TLS,1,Pol,体细胞高变（,somatic hypermutation,）,1,Pol,减数分裂相关的,DNA,损伤修复,1,Pol,TLS,1,Pol,DNA,交联损伤修复,1,Pol,DNA,复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复,4,Pol,DNA,复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复,23,Pol,线粒体,DNA,复制和损伤修复,3,Pol,碱基切除修复,1,Pol,合成引物,4,Pol,功能,亚基数目,真核生物,TLS,（,translesion synthesis,）,3,Pol (UmuC,UmuD),DNA,损伤修复，穿越损伤合成（,TLS,）,1,Pol (Din B),染色体,DNA,复制,9,Pol,全酶,染色体,DNA,复制,3,Pol,核心酶,DNA,损伤修复,1,Pol,去除,RNA,引物，,DNA,损伤修复,1,Pol,功能,亚基数目,原核生物（,E.coli,）,延伸能力差，只能延伸,20,个核苷酸左右。,功能：切除引物，填补冈崎片段间的空隙、,DNA,损伤的修复。,DNA pol I,（,109kD,）,323,个氨基酸,小片段,5,核酸外切酶活性,大片段,/Klenow,片段,604,个氨基酸,DNA,聚合酶,活性,5,核酸外切酶活性,N,端,C,端,枯草杆菌蛋白酶,DNA pol I,Klenow,片段,是实验室合成,DNA,，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,2,个,核心酶,（,、,3,种亚基）,1,个,复合物,（,、,、,、,、,、,6,种亚基）,可滑动的,DNA,夹子,（含,1,对,-,亚基）,DNA,聚合酶,III,的结构,全酶结构包括：,一次延伸达,500000,个核苷酸，催化速度达,1000bp/s,，有校对功能，,是细菌复制延长中真正起催化作用的酶,。,亚基,有聚合酶活性,亚基,有,3-5,校正核酸酶活性,亚基,协助核心酶固定在,DNA,模板上,复合物,连接两个核心酶,细菌复制叉上,DNA,的合成（小结）,复制叉上的前导链和后随链同时合成；,DNA,聚合酶,III,全酶同时复制,DNA,的双链；,前导链迅速复制。后随链进行不连续的合成；,引物酶、解螺旋酶、拓扑异构酶和,SSB,蛋白协助,DNA,聚合酶,III,完成复制过程。,以上统称“,长号模型,”。,E.coli,基因组的复制终止,E.coli,基因组复制由,oriC,开始，到,ter,终止；,Tus,蛋白,识别复制终点使复制终止；,复制完成还包括去除引物和连接冈崎片段；,拓扑异构酶解开套在一起的两个,DNA,分子。,复制受到,DnaA-ATP,水平和,SeqA,的调控,E.coli,基因组的,oriC,的,GATC,序列（双链）的,A,通常是,甲基化,的，只有甲基化的,oriC,可启动复制。新合成链,oriC,的,GATC,在未甲基化之前，可与,SeqA,蛋白结合，而丧失启动复制的能力；,DnaA-ATP,蛋白在复制过程中转变为,DnaA-ADP,，而丧失启动复制的能力；,以上机制共同使,E.coli,在,oriC,的新拷贝上启动新一轮复制的能力显著降低。,虽然如此，但这并不意味着,E.coli,的,oriC,在一轮复制周期中就只起一次作用；,E.coli,每,20,分钟就分裂一次，而基因组的复制时间就需要,40,分钟，在快速生长期，基因组,在上一轮复制完成之前就要启动下一轮复制,，而使染色体上出现,6,个复制叉；,所以，确切的说法是：,每一轮细胞分裂只有一轮自,oriC,的复制起始,。,真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等；,DNA,复制从引发进入延伸阶段发生,DNA,聚合酶,/,转换；,切除冈崎片段,RNA,引物的是核酸酶,RNase H,和,FEN1,等。,二、真核生物的,DNA,复制,真核生物与原核生物,DNA,复制的差异：,(,一,),常见的真核细胞,DNA,聚合酶有,5,种,A,家族,与大肠杆菌,Pol,同源，包括,Pol,和,Pol,B,家族,与大肠杆菌,Pol,同源，包括,Pol,、,、,和,C,家族,与大肠杆菌,Pol,同源，仅在真菌中发现,X,家族,与大肠杆菌,DNA,聚合酶并无同源性，却与末端转移酶同源，成员包括,Pol,、,、,Y,家族,（,UmuC/DinB,超家族），近年发现一个特殊的真核及原核,DNA,聚合酶家族，成员包括,Pol,、,、,和,Rev1,Pol,负责合成引物,Pol,负责,DNA,复制、核苷酸切除修复和碱基切除修复,Pol,的功能与,Pol,相似（其确切功能尚待定）,Pol,可能和碱基切除修复有关,Pol,负责线粒体,DNA,复制和损伤修复,常见的真核,DNA,聚合酶有,5,种：,拓扑异构酶,，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正超螺旋,Tol,和,Tol,DNA,双螺旋解链,，参与组装引发体,DNA,解旋酶,连接冈崎片段,DNA,连接酶,核酸酶，切除,RNA,引物,RNase H,核酸酶，切除,RNA,引物,FEN1,DNA,复制,，核苷酸切除修复，碱基切除修复,Pol,/,合成,RNA-DNA,引物,Pol,/,引发酶,夹子装载器,，促使,PCNA,结合于引物,-,模板链，有依赖,DNA,的,ATPase,活性，结合于引物,-,模板链，激活,DNA,聚合酶,RFC,可滑动的,DNA,夹子,，激活,DNA,聚合酶和,RFC,的,ATPase,活性,PCNA,单链,DNA,结合蛋白,，激活,DNA,聚合酶，使解旋酶容易结合,DNA,RPA,功 能,蛋白质,真核,DNA,复制叉主要蛋白质的功能,(,二,),真核,DNA,复制叉主要蛋白质的类型和功能与原核基本相似,DNA,聚合酶,（,Pol,）分子含有,4,个亚基：,1.DNA,聚合酶,/,引发酶复合物合成,RNA-DNA,引物,p180,：催化亚基,p48,：具有,引物酶,活性,p58,：,p48,的稳定性和活性所必需的,p70,：与组装引发体有关,功能,：合成,RNA,引物,反应过程,：,调节,：磷酸化的调节作用,Pol,/,引发酶复合物,首先，合成,RNA,引物；,其次，利用,DNA,聚合酶活性将引物延伸，产生起始,DNA,（,initiator DNA,，,iDNA,）短序列，形成,RNA-DNA,引物；,最后，,Pol,/,引发酶脱离模板链,DNA,，发生,DNA,聚合酶转换（,switch,）。,原核与真核生物,RNA,引物的合成,聚合酶转换,结构：,p70,、,p34,和,p11,组成异源三聚体,功能：,2.RPA,的功能与,E.coli,的,SSB,相似,复制蛋白,A,（,replication protein A,，,RPA,）,结合单链,DNA,促使双螺旋,DNA,解旋,激活,Pol,/,引发酶活性,为,Pol,依赖复制因子,C,（,RFC,）和增殖细胞核抗原（,PCNA,）合成,DNA,所必需,RPA,三聚体与,SV40 T,抗原结合，组装引发体复合物所必需,RPA,参与,DNA,重组和修复,p140,结合,PCNA,p40,、,p37,和,p36,组成稳定的核心复合物，具有依赖,DNA,的,ATPase,活性,p38,可能在,p140,和核心复合物之间起连接作用,3.RFC,与,E.coli DNA,聚合酶,的,-,复合物,功能相似,复制因子,C,（,replication factor C,，,RFC,）,结构：,有,p140,，,p40,，,p38,，,p37,、,p36 5,个亚基,促使可滑动的,DNA,夹子,PCNA,结合于引物,-,模板链,，是,Pol,在模板,DNA,链上组装并形成具有持续合成能力全酶所必需的。,RFC,的功能：,PCNA,是,Pol,的进行性因子，使,Pol,获得持续合成能力。,PCNA,是协调,DNA,复制、损伤修复、表观遗传和细胞周期调控的核心因子。,PCNA,水平是检测细胞增殖的重要指标。,PCNA,能激活,Pol,。,4.PCNA,是,可滑动的,DNA,夹子,增殖细胞核抗原,（,proliferating cell nuclear antigen,，,PCNA,）,结构：,功能：,同源三聚体，可形成闭合环形的可滑动,DNA,夹子。,不同生物的,夹子结构相似,E.coli,的,亚基二聚体,T4,噬菌体,PCNA,蛋白三聚体,gp45,蛋白三聚体,p125,：催化亚基，具有,DNA,聚合酶活性和,3,5,核酸外切酶活性，其,N,端区与,PCNA,相互作用,p50,：辅助,PCNA,激活,p125,5.,DNA,聚合酶,合成前导链和后随链,结构：,Pol,分子是异源二聚体（,p125,和,p50,）,功能：,Pol,合成前导链和后随链,DNA,聚合酶,FEN1,（,flap endonuclease 1,）具有核酸内切酶和,5,3,核酸外切酶活性。,FEN1,参与去除冈崎片段,5,端的,RNA,引物。,6.FEN1,和,RNAse H,切除,RNA,引物,DNA,复制需要,DNA,解旋酶,Mcm2-7,打开,DNA,双螺旋，使复制模板链得以暴露,。,7.DNA,解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板,8.,真核复制叉有,1,个,Pol,和,2,个,Pol,复合物,真核,DNA,复制叉模型,(,三,),引发和延伸发生,DNA,聚合酶,/,转换,识别染色体,DNA,复制起点和,DNA,局部解旋后，,Pol,/,引发酶复合物结合于复制起点，这一步叫做,引发体组装,。,引发体组装,包括,DNA,解旋酶,与,Pol,/,引发酶,相互作用。,1.,解旋酶与,Pol,/,引发酶相互作用组装引发体,前导链：出现在引发后期,后随链：发生于每个冈崎片段合成之际,发生,DNA,聚合酶,/,转换的原因是,Pol,不具备持续合成能力,DNA,聚合酶,/,转换的,关键蛋白是,RFC,2.,DNA,聚合酶,/,转换,真核,DNA,聚合酶转换和后随链合成,(,四,),切除,RNA,引物有两种机制,RNAse H/FEN1,Dna2/FEN1,(,五,),真核染色体在每个细胞周期只能复制一次,真核基因组复制仅发生在,S,期，在此期间，所有的,DNA,都,必须,且,只能复制一次,，这意味着所有的复制器都仅被利用一次；,真核生物的复制起始子是,复制起点识别复合物,（,ORC,），它募集相关蛋白因子，形成,前复制复合体,（,pre-RC,）；,对,pre-RC,形成和激活的调控使每个细胞周期内仅有一轮复制发生。,真核细胞的细胞周期,pre-RC,的形成,ORC,是起始子；,Cdc6,和,Cdt1,是解旋酶装载蛋白；,Mcm2-7,是解螺旋酶。,pre-RC,虽然,只在,G1,期形成,，但,只在,S,期才激活,。,对,pre-RC,的调控使得每个细胞周期只有一轮复制,(,六,),端粒酶确保染色体末端复制完整,前导链,产生,完整,的子染色单体。,后随链,3,端留下缩短的,未复制的,ssDNA,区,。,端粒（,telomeres,）,由富含,TG,的重复序列组成。,人的端粒重复序列为,5-TTAGGG-3,。,这些重复序列多为双链，但每个染色体的,3,端比,5,端长，形成单链,ssDNA,。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题。,端粒酶的结构,端粒延长机制（爬行模型）,端粒酶对端粒,3,端的延长解决了末端复制,DNA,的反转录合成,Reverse transcription,第三节,RNA,肿瘤病毒,DNA,原病毒（或前病毒）,RNA,肿瘤病毒,Temin,等提出，原病毒（,provirus,）,DNA,是,RNA,肿瘤病毒在复制过程中的中间物。,*,反转录的发现发展了中心法则,Crick,：,我本人的思想是基于,两个基本原理，,序列假说,和,中心法则,。,sequence hypothesis,：,核酸片段的特异性完全由其,碱基序列,所决定，而且这种序列是某一蛋白质氨基酸序列的密码。,central dogma,：,遗传信息只能,从核酸传向蛋白质,，而不能从蛋白质传向核酸。,反转录病毒,（,retroviruses,）,：,RNA,病毒，,含有反转录酶,反转录,：在反转录酶的作用下以,RNA,为模板合成,DNA,的过程。,RNA,指导的,DNA,聚合酶活性；,DNA,指导的,DNA,聚合酶活性；,RNase H,的活性是指它能够从,5,3,和,3,5,两个方向水解,DNA-RNA,杂合分子中的,RNA,。,一、,反转录酶以,tRNA,为引物合成双链,cDNA,反转录酶有,3,种酶的活性：,反转录酶的结构,反转录病毒的,基因组结构,反转录病毒,RNA,基因组转变为双链,cDNA,的途径,二、反转录病毒在宿主细胞内的主要活动,（一）,反转录合成双链,cDNA,（二）,双链,cDNA,插入宿主染色体形成原病毒,原病毒或前病毒：,存在于真核染色体中和反转录病毒,RNA,基因组相对应的双链,DNA,序列。,gag,基因,编码几种病毒核心蛋白（衣壳蛋白）,;,pol,基因,编码,3,种酶：反转录酶、蛋白酶和整合酶,;,env,基因,编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白。,（三）原病毒,DNA,转录产生病毒,RNA,具有自我复制能力的反转录病毒基因组含有,3,个基因：,初级转录产物多蛋白,Gag-Pol,，经过蛋白酶水解，可产生反转录酶、蛋白酶和整合酶。,多蛋白,Gag,经过加工，生成,4,种病毒衣壳蛋白。,env,基因编码的,Env,蛋白，经过加工以后插入病毒外膜磷脂双层。,这些病毒蛋白和病毒,RNA,基因组可以迅速组装成许多新的反转录病毒颗粒。,（四）病毒,RNA,经翻译和包装形成反转录病毒颗粒,反转录病毒的,生活周期,DNA,损伤修复,DNA Damage and Repair,第四节,DNA,的可突变性与修复,遗传物质保持代代持续依赖于,把突变概率维持在低水平,上：生殖细胞的高突变率将摧毁物种；体细胞的高突变率将摧毁个体。,要使后代有很好的存活机会，,DNA,必须保持低的突变率。,如果遗传物质具有绝对的忠实性，进化将失去动力，新物种（包括人类）不可能出现。,生命和生物多样性依赖于,突变和突变修复之间的良好平衡,。,一、多种因素可引起,DNA,损伤,碱基开环和糖苷键断裂引起碱基丢失,辐射或氧化损伤等引起碱基改变,化学因素可引起核苷酸插入或缺失,辐射和化学损伤可引起,DNA,链断裂,物理和化学因素可引起,DNA,链间或链内交联,胞嘧啶脱氨基,鸟嘌呤脱落,5-,甲基胞嘧啶脱氨基,鸟嘌呤损伤的形式,UV,导致嘧啶二聚体形成,烯醇式结构的,5-BrU,与,G,配对,吖啶类化合物可插入,DNA,双链导致双链结构改变,几个概念：点突变、转换、颠换,点突变：,DNA,序列上单个碱基的改变称为点突变，可分为转换与颠换两种。,转换（,transition,）：同型碱基的取代称为转换，有,4,种形式。,颠换（,transversion,）：异型碱基的取代称为颠换，有,8,种形式。,转换,颠换,点突变,缺失,插入,倒位,重排,突变可能导致基因功能的改变,如果突变发生在基因的蛋白编码区，则可能引起蛋白质结构改变,如果突变发生在基因调控区，则可能引起蛋白质表达水平改变,正常,mRNA,正常 蛋白质,同义突变,错义突变,无义突变,框移突变,当突变发生在,蛋白质编码区,启动子突变：基因表达水平降低,剪接位点突变：错误的剪接,加尾信号突变：,mRNA,稳定性下降,当突变发生在,转录调控序列,结构基因突变导致的蛋白质功能降低和丧失：,镰刀型红细胞贫血是由基因突变导致的“分子病”。,结构基因突变导致的蛋白质功能增强,癌基因,Ras,的突变导致其活性的异常增加,基因表达过高导致的蛋白质过量,癌基因,c-myc,的,基因扩增,导致活性异常增加；,病毒增强子的插入,导致基因表达增强,基因突变导致蛋白质产生过少而功能缺失,b-,地中海贫血症的突变导致珠蛋白产生减少,二、,DNA,损伤,修复系统有多种类型,DNA,聚合酶（,Y-,家族），如,E.coli,：,UmuC,嘧啶二聚体、无嘌呤位点,跨损伤,DNA,合成,E.coli,：,RecA,和,RecBCD,双链断裂,重组修复,E.coli,：,UvrA,UvrB,UvrC,UvrD,人：,XPC,XPA,XPD,ERCCI-XPF,XPG,嘧啶二聚体，碱基烷基化,核苷酸切除修复,DNA,糖苷酶（即,DNA,糖基水解酶）,碱基损伤,碱基切除修复,嘧啶二聚体,直接修复,E.coli,：,MutS,MutL,MutH,人：,MSH,MLH,PMS,复制差错,错配修复,酶,损伤,修复系统的类型,修复对象：,将,DNA,中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解,。,机制：,细胞内光裂合酶（,photolyases,）分子中生色基团次甲四氢叶酸吸收光子并将,FADH,2,激活生成的激发型,FADH,2,，再将电子转移给嘧啶二聚体，使其还原。,分布：,分布广泛，除哺乳动物外均有之。,（一）,直接修复（,direct repair,）利用修复酶简单地逆转,DNA,损伤,光复活修复系统,光复活修复系统,修复对象：,DNA,中被甲基化修饰的鸟嘌呤（,O,6,-,甲基鸟嘌呤，与,T,配对）。,机制：,将甲基转移到酶蛋白活性中心的,Cys,残基侧链上，使鸟嘌呤复原，避免发生突变。,特点：,DNA,甲基转移酶一旦接受甲基就不再具有催化活性，修复代价高昂。,O,6,-,甲基鸟嘌呤,DNA,甲基转移酶修复,O,6,-,甲基鸟嘌呤,DNA,甲基转移酶修复,（二）碱基切除系统修复切除受损碱基,糖苷酶（,glycosylases,）,识别、切除受损碱基，产生,AP,位点（,apurinic or apyrimidinic site,）。,AP,内切酶,在,AP,位点的,5,端切断磷酸二酯键。,AP,外切酶,再切割,AP,位点的,3,端。,DNA,聚合酶,填补产生的缺口。,最后,DNA,连接酶,连接。,碱基切除修复（,base excision repair,BER,）,对象：,受损的碱基,修复系统：,E.coli,碱基切除修复系统,切除胞嘧啶自发脱氨基产生的尿嘧啶,胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶；,氧化的鸟嘌呤（,oxoG,）；,脱氨基的腺嘌呤；,开环碱基；,碳原子之间双键变成单键的碱基等。,DNA,糖苷酶识别的异常碱基包括：,碱基切除修复系统切除鸟嘌呤氧化产物,oxoG,的错误配对碱基,A,DNA,聚合酶,和,连接酶,以未损伤的,DNA,链为模板修补缺口。,（三）核苷酸切除修复系统,识别,DNA,双螺旋,变形,核苷酸切除修复（,nucleotide excision repair,NER,）,系统识别,DNA,双螺旋形状的变形。,E.coli,的,NER,主要由,4,种蛋白质组成：,UvrA UvrB UvrC UvrD,UvrA,识别,DNA,双螺旋结构变形,UvrB,负责解链，募集核酸内切酶,UvrC,UvrC,在损伤部位的两侧切断,DNA,链,UvrD,去除这两个切点之间的,DNA,片段,DNA,聚合酶,和连接酶填补缺口,核苷酸切除修复系统,XPC,蛋白负责发现,DNA,双螺旋中的变形,XPA,和,XPD,蛋白具有解旋酶活性,核酸酶,ERCC1-,XPF,切割损伤部位,5,侧，,XPG,切割,3,侧,DNA,聚合酶和连接酶负责填补产生的缺口,高等真核生物,的,NER,作用：,NER,不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的,RNA,聚合酶，即参与,转录偶联修复,（,transcription-coupled repair,）,。,作用方式：,NER,蛋白质被募集于暂停的,RNA,聚合酶。,转录偶联修复的意义：,将修复酶集中于正在转录,DNA,，使该区域的损伤尽快得以修复。,转录耦联修复,一、在核苷酸切除修复（包括转录偶联修复）时起,DNA,解旋酶的作用；,二、在转录过程中打开,DNA,模板。,真核转录偶联修复的核心是,TFH,。,TFH,分别参与两个独立过程：,着色性干皮病,科凯恩氏综合征,其他与,DNA,损伤修复相关的疾病：,对于,DNA,双链断裂（,double-strand break,，,DSB,）损伤，细胞采用双链断裂修复，即,重组修复（,recombinational repair,）,，通过与姐妹染色体,正常拷贝的同源重组,来恢复正确的遗传信息。,（四）重组修复系统能够修复双链断裂损伤,正在复制的,DNA,聚合酶可能遭遇尚未修复的,DNA,损伤，细胞自动防故障系统能够使复制体绕过损伤部位，这一机制就是,跨损伤,DNA,合成,。,E.coli,跨损伤,DNA,合成由,UmuC-UmuD,复合物,进行。,（五）,跨损伤,DNA,聚合酶能够跨越损伤部位合成,DNA,E.coli,跨损伤,DNA,合成,重组修复和,SOS,修复都需要一种重要的蛋白：,RecA,在真核生物中，这种蛋白是,RPA,，它相当于细菌的,SSB,蛋白,真核生物通过细胞周期检查点控制对,DNA,损伤做出应答；,当细胞基因组,DNA,受到严重损伤时，细胞可产生以下三种应答：,诱导修复基因转录,；,阻断细胞周期,；,诱导细胞凋亡,。,Checkpoint,控制是真核生物修复的主要机制,抑癌基因,p53,在,DNA,损伤应答中起关键作用，当基因组,DNA,遭受严重损伤时，其表达上调，并启动以下通路：,上调,P21,表达，使细胞阻滞于,G1,期；,上调,Bax,表达，启动线粒体凋亡途径；,上调,Gadd45,（,growth-arrest,and DNA damage inducible,）、,P48,等表达，促进修复，阻滞细胞周期。,DNA,重组,DNA Recombination,第五节,DNA,重组的类型,同源重组,位点特异性重组,转座重组,一、同源重组是最基本的,DNA,重组方式,同源重组,(homologous recombination,，,HR),是指发生在同源序列间的重组，它通过链