食用菌生产技术-84-菌种的生产与保藏.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章 菌种的生产与保藏,菌种，好比农作物的种子，是食用菌生产的根本，其优劣直接影响食用菌的产量和质量。因此，从事食用菌菌种工作的单位都必须认真做好菌种的培育和保藏工作。,菌种：,实质上就是经过人工培养并进一步繁殖的食用菌的纯菌丝体。,第三章 食用菌的菌种生产,菌种生产的意义,1好种结好果，好种出好菇,2技能技巧多，技术含量高,3生产周期短，资金回收快,4菌种价格高，经济效益高,食用菌的制种程序,组织分离,接种母种（一级）,接种 原种（二级）,接种栽培种（三级）,种菇,孢子分离,经过这样三级培养，食用菌菌丝数量大大增加。,一般1支试管菌种可繁殖46瓶原种，每瓶原种又可扩大繁殖60100瓶栽培种。,培养,培养,母 种,原种、,栽培种,栽培种,食用菌的制种程序,超净工作台,(一)菌种生产常用的设备和用具,2、灭菌设备,1）手提式：,容量小，适于斜面试管及玻璃器皿等；,2）立式,：容量大，投资大；,3）卧式,：容量大，投资大；,4）家用24或26 cm压力锅：,母种、原种培养基。,高压蒸气灭菌锅,优点：省时、省燃料、效果好,2）、3）一般在菌种场或研究所应用。,灭菌设备,高压蒸气灭菌锅,(一)菌种生产常用的设备和用具,2、灭菌设备,常压灭菌锅,目前农村生产栽培种的必备设备，实际上是一种大型蒸笼式煮灶。底部为铸铁大锅，上部为圆形木桶，桶内装数层供放培养基的格架。桶盖装有活络搭及密闭的橡皮圈，由于锅内温度最高是100，所以灭菌时间需维持,1012h,，才能达到灭菌效果。,(一)菌种生产常用的设备和用具,3、培养设备,培养室,大小：,不宜过大，一般以2025，培养50006000瓶菌种为宜，太大不易保温和管理。,要求：,干净、通风、保温，应设有调温设备，使室温保持在2025。门窗应设铁纱，以防鼠、虫为害。,生化培养箱,是专业工厂生产的恒温电器设备，用于培养母种或少量原种，可以根据需要任意温度调节。,母种-试管,原种、栽培种菌种瓶或塑料袋,(一)菌种生产常用的设备和用具,5、接种工具,移植菌种于培养基上的工具称接种工具，主要有以下几种：,接种针、环、刀、钩、铲、锄、枪等；,(一)菌种生产常用的设备和用具,6、常用的消毒药品,70%酒精：,一般用于手、种菇表面消毒；,0.1%升汞：,常用于玻璃器皿、非金属器械及种菇表面消毒；,0.1%KMnO,4,：,一般用于用具、器皿消毒；,(一)菌种生产常用的设备和用具,(二)母种生产技术,1、母种培养基,食用菌母种培养基的种类繁多，由于不同营养类型的食用菌对营养物质的要求不同，所以，在培养不同食用菌母种时，应选择适宜该菌种的培养基。,母种培养基要求营养丰富、完全、氮源、维生素的比例应高。,现将食用菌常用的母种培养基列举如下,：,(一)菌种生产常用的设备和用具,(二)母种生产技术,配方,马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）,马铃薯200g、葡萄糖（或蔗糖）20g、琼脂20g、H,2,O 1000mL、pH 6.5。,适用于一般食用菌母种分离与培养，但草菇、猴头菌等在此培养基上生长不良。,(二)母种生产技术,综合马铃薯培养基,马铃薯200g、葡萄糖（或蔗糖）20g、KH,2,PO,4,2g、MgSO,4,0.5g、维生素B,1,10mg、琼脂20g、H,2,O 1000mL、pH自然。,适合培养草菇、猴头菌、灵芝及各种食用菌菌种分离、保藏。,(二)母种生产技术,玉米粉培养基,玉米粉40g、葡萄糖（或蔗糖）10g、琼脂20g、H,2,O 1000mL、pH自然；,适用于大多数食用菌菌丝的生长。,马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、琼脂培养基,马铃薯200g、葡萄糖（或蔗糖）20g、蛋白胨10g、琼脂20g、H,2,O 1000mL、pH自然；,适用于培养和保藏多种食用菌。,(二)母种生产技术,黄豆芽、松针培养基,黄豆芽250g、松针50g、葡萄糖（或蔗糖）20g、琼脂20g、H,2,O 1000mL、pH 55.5。,将松针、黄豆芽按量称好，加水煮30min，取滤液，加入葡萄糖、琼脂，充分搅拌，使琼脂熔化，补水至1000ml，即分装试管。,主要用于培养竹荪母种。,(二)母种生产技术,苹果汁培养基,苹果100g、蛋白胨2g、蔗糖20g、琼脂20g、H,2,O 1000mL；,主要用于草菇培养,（配制方法同PDA）,配方,配制方法（以PDA为例）,马铃薯（去皮、去芽眼）切成片称取200g1000mL H,2,O煮沸双层纱布过滤取滤液并补足1000mL琼脂熔化其它营养物质调节pH（用HCl或NaOH）分装试管灭菌（高压蒸气灭菌15-30min）制成斜面检查灭菌效果（即2830培养23d）,其它天然培养基或综合培养基，如：玉米粉、黄豆粉、胡萝卜、麸皮等原料，加适量水煮汁过滤，取滤液与其它成分混合。,(二)母种生产技术,2、母种分离,母种分离方法,孢子分离,组织分离,基质分离,有性,无性,孢子分离法,利用孢子在适宜培养基上形成菌丝来获得纯菌种的方法。,孢子分离法,1）单孢子分离法：,培养基上只接种1个担孢子，使它萌发成菌丝体而获得纯菌种的方法。如：双孢蘑菇、草菇单个孢子分离得到菌丝便能结实。,（一个孢子萌发菌丝体纯种）,2）多孢子分离法：,许多孢子接种于同一培养基上，使它们萌发自由交配来获得纯菌种的方法。如：香菇、平菇、金针菇、毛木耳等。（多个孢子萌发菌丝体纯种）,(二)母种生产技术,下面先解释二个基本概念,1）同宗配合：,同一担子孢子萌发产生的两条菌丝之间进行结合便能生育（自交亲合、可孕，类似于高等植物自花授粉），可用单孢子分离。,如：双孢蘑菇、草菇,2）异宗配合：,同一性别菌丝之间不亲合，只有两条性别不同的菌丝交配才能产生子实体。,大多数食用菌属此类型，需用多孢子分离法。,(二)母种生产技术,担子菌亚门中，约10%菌类属同宗结合，90%以上是异宗配合，所以单孢子分离对大多数食用菌不适用，只有育种时才采用。,此法技术复杂，生产上很少采用，在此不作详述。,(二)母种生产技术,多孢子分离简单易行，生产上经常采用，多孢子分离的具体操作方法有以下几种：,整菇插种法,：伞菌常用此法采得孢子。,即选择成熟度适当的优良种菇，在无菌操作下，插入无菌孢子采集器内，置适温下让其自然弹散孢子。用接种环取少量孢子，放入试管斜面上培养。,种菇选择：,菌丝生长健壮，无病虫杂菌，出菇均匀，转潮较快，菇形圆整，菌盖肥厚，达八九成熟。,参见P48,(二)母种生产技术,孢子采集器是用来采集食用菌孢子的一种装置。,孢子采集器,搪瓷盘（大号培养皿）,培养皿,种菇支架,玻璃钟罩（大漏斗）,参见P48,悬钓法,此法主要用于耳类（黑木耳、毛木耳、银耳等）孢子的采集。,耳片（表面消毒）悬挂于培养基上方培养 取出挂钩与耳片培养挑取先端菌丝转管纯化母种,1224h,培养基,耳片,参见P48,组织分离：,指通过菇体组织分离纯种。,优点：,操作简便、取材广泛、不易变异，保持原菌种优良种性。,方法：,选择种菇（出菇早、无病虫害、柄短、肉厚、大小适中、56分成熟）,组织分离,组织分离法,参见P45,选择种菇表面消毒（75%酒精或0.1%升汞）撕成两半取菌柄菌盖交界处小块菌肉移入PDA培养观察转管纯种,上述分离物在25下，经3d5d可看到分离物表面长出白色绒毛状丝，每隔1d2d检查1次，随时淘汰霉菌、细菌污染的培养物，培养10d15d，再作1次转管即得到纯种。,组织分离法,参见P45-46,注：,取组织块不要贪大，因组织块小易定植;,有些食用菌不易用组织分离法获纯种；,不同的食用菌切取部位和消毒方法不同。,如：1）红菇、乳菇等，因它们菇体细胞已泡囊化，再生能力极弱；,又如：2）银耳和木耳等胶质菌，它们子实体中菌丝含量极少，组织分离法不易成功。而只能取其生长的基质即菇木、耳木分离。,组织分离法,概念：,由菇木、耳木、培养料等食用菌生长基质中的菌丝分离培养而成。这是利用潜在于寄主组织内的菌丝体获得纯种的方法。,（常用于银耳及木耳菌种分离）,基内菌丝分离法（基质分离法）,参见P46-47,段木内菌丝分离法：,取12cm菇木、耳木（子实体着生部位）去皮消毒（75%酒精或0.1%升汞浸泡1min）切去四周木块切成火柴杆粗细，0.5 cm长的小木梗取1根放入试管斜面上培养取菌丝转管纯化,基内菌丝分离法（基质分离法）,参见P46-47,(二)母种生产技术,3、菌种提纯与扩大繁殖,用孢子、组织或基质分离法得到的菌种，一般不宜直接用于生产，必须经过提纯方可应用。,提纯：,选稀疏单菌落边缘取菌接种试管斜面（35支）培养纯菌种。,扩大繁殖,：提纯的母种或从有关单位引进的母种，数量均很少，应扩大繁殖后再用。,在母种繁殖时，最好一次多移些，不易多次转管，以免影响出菇率，降低产量和质量。,一支斜面母种可移接40支左右斜面试管。,4、质量检验,对分离、引进或转管扩大的菌种，应经过质量鉴定，选优去劣，方可使用。,1）检验方法,外观鉴定,优良菌种：,菌丝浓白、粗壮、富有弹性，则生命力强。如有子实体或茶褐色被膜，只要除去仍可使用。,老化菌种：,菌种已收缩、干燥或菌丝体自溶产生了大量红褐色液体，说明生活力弱，不可使用。,(二)母种生产技术,显微镜检验,挑取少许菌丝于载玻片上，加蒸馏水1滴，盖上盖玻片，观察菌丝形态是否为培育的菌种。,菌丝生长速度,将其接种到适宜斜面培养基上，在适温下培养。凡菌丝生长较快、整齐、浓密而健壮的就是优良母种。,参见52,(二)母种生产技术,显微镜检验,菌丝生长速度,出菇试验,进行子实体产量和品质评比。,经以上检验，通过综合评比，选出菌丝生长速度较快，子实体生长健壮、品质好、产量高的母种，即可供生产上使用。,参见52,(二)母种生产技术,(二)母种生产技术,2）检验标准,首先要辨认分离或引进的是不是所需要的菌种；,有无杂菌污染，是否老化。,简 答 题,1、食用菌生产中常用的设备和用具有哪些？,2、什么叫组织分离法？写出组织分离法的步骤和注意事项。,3、写出PDA培养基配方及配制方法。,(二)母种生产技术,(三)原种和栽培种的生产技术,原种和栽培种的生产，无论是培养基成分，配制方法和灭菌方法基本上是相同的。,1）原种：是由试管斜面培养基培养的母种作种源接种而成，主要用于繁殖栽培种，也可直接用于生产。,（母种原种）,2）栽培种：由原种作种源扩大而成，只能用于生产。,（原种栽培种),(三)原种和栽培种的生产技术,1、常用培养料的配方和配制方法,培养料,木屑米糠培养料：,木生菇类，如：木耳、银耳、香菇；,草茎或草粪厩肥培养料：,草生菇类，如：蘑菇、草菇；,棉籽壳米糠培养料,：多种菇类。,粪草培养基（适用于蘑菇）,稻草或麦秸20kg、粪肥（干）30kg、石膏500g、水适量。,方法：稻草切成2cm长粪肥混合发酵石膏调水装瓶灭菌,稻草麸皮培养基（草菇）,干稻草78%、麸皮或米糠20%、蔗糖1%、过磷酸钙1%、水适量,方法：稻草切成2cm长发酵蔗糖麸皮过磷酸钙,1、常用培养料的配方和配制方法,木屑米糠培养基,（香菇、木耳、猴头、平菇等）,木屑78%、麸皮或米糠20%、石膏1%、蔗糖1%、水适量。,木屑、麸皮、黄豆粉培养基（银耳）,木屑50kg、麸皮15kg、黄豆粉1kg、蔗糖0.75kg、MgSO,4,0.25kg、水7075kg。,棉籽壳培养基（平菇、猴头、金针菇）,棉籽壳99.7%、蔗糖0.1%、石膏0.2%、水适量。,1、常用培养料的配方和配制方法,(三)原种和栽培种的生产技术,2、培养基（料）配制原则,掌握碳氮比例,食用菌对碳和氮的需要有一个比例，简称碳氮比（C）。,菌丝体生长阶段：C=201；,子实体形成阶段：C=30401；,C 过高，菌丝体生长过旺，而子实体小、产量低。,2、培养基（料）配制原则,选好培养材料,首先选不含杀菌物质的木屑,杉、松、樟等树种，含酚、酯、精油等杀菌物质，会抑制食用菌生长。要用必须经过处理，如：蒸煮、晒等。,根据食用菌的喜好选木屑,如：培养香菇用桦木屑就比椴木屑好；,培养金针菇用构，楮等木屑就比用榆、槐等木屑好。,注意物理性状,培养原料要注意颗粒粗细、质地软硬程度，以及持水性能等物理性状。,调节酸碱度,各种食用菌需要的pH值不同，配制培养料时，应选用NaOH、石灰、盐酸或过磷酸钙等物质调节pH值。霉菌比食用菌喜欢更低的pH值，生产上有时为了控制这类杂菌的发生，往往将pH值适当调高0.51。,2、培养基（料）配制原则,3、原料选择的注意事项（几点说明）,木屑：,树种：,除松树、杉树、柏树、樟树、芸香属、按属等树种之外，绝大多数阔叶树和木屑都可以利用。（因其中含有酚、酯、精油等杀菌物质）,粗细：,不宜过细，以免培养基过湿或通气不良。,3、原料选择的注意事项（几点说明）,木屑：,选择：,根据食用菌分解能力选择，分解能力较强的食用菌采用硬质阔叶树木屑，反之采用软质树种木屑。,如：金针菇分解能力较弱，以含单宁较少木屑为宜，木屑越陈越好；,茯苓菌分解能力较强，可采用颗粒粗的松木屑或松木钉。,米糠、麸皮作用,作用：补充氮源和维生素。,稻草、麦秸、木屑、棉籽壳等纤维素原料，含氮量低。如：木屑含氮量0.03%以下。,麸皮：,含氮量比米糠多，但维生素不如米糠。,米糠：,含氮量比麸皮少。,用量：一般,10%20%,，过多易引起污染。,3、原料选择的注意事项（几点说明）,加糖的作用,初期补充碳源，用量1%5%。,诱导胞外酶的产生。,纤维素原料，食用菌利用缓慢。加入少量白糖作为食用菌初期补充碳源，促进菌丝快速生长，同时诱导纤维素酶的产生，更好地利用纤维素。,3、原料选择的注意事项（几点说明）,Ca,2,作用,提供食用菌钙离子：原料中加石膏、CaCO,3,或过磷酸钙、骨粉提供食用菌钙离子；,钙不断中和食用菌产生的有机酸；,钙还能中和单宁；,减少过量K、Mg对菌丝中毒，促进菌丝生长。,3、原料选择的注意事项（几点说明）,(三)原种和栽培种的生产技术,4、原种、栽培种的制作方法,按配方称取原料拌料装瓶（袋）打洞（孔径1cm深至瓶底）灭菌（1.5kgcm,2,，1.52h）冷却接种（接入黄豆大小一块）培养（25 27）菌丝长满瓶（袋）培养7d8d扩大成栽培种。,(三)原种和栽培种的生产技术,5、杂菌检查（菌种检查）,接种后的原种，一般在3d5d左右菌丝恢复生长，应每天全面检查杂菌情况，如有污染及时剔除。（正常为白色，若混有其它色泽，应及时处理）；如发现接种块无新菌丝萌发，则认为是死菌，应及时补种。,正常：菌丝白色,杂菌：黄、红、绿、黑,死菌：补种,二、菌种保藏,菌种是食用菌栽培成败的关键。分离筛选一株优良的菌种是一项艰苦的任务，而长期保持优良菌种的性能，也是一项极为重要的工作。食用菌与其他,微生物,一样，都是有遗传性和变异性。,遗传性,：保证了优良菌种的性能相对稳定，能传给下一代，为菌种保藏提供了良好的条件。,变异性,：使高产优质的菌种，逐渐衰退，给菌种保藏带来了困难。,菌种保藏的目的：,保持菌种的优良性状；,降低衰退速度。,确保菌种纯洁，长期在生产上应用。,（不衰退、不死亡、不污染杂菌）,二、菌种保藏,原理：,降低菌种代谢活动。,降低代谢活动方法：,（创造各种条件）,低温,干燥,缺氧等,在这些条件下，食用菌可处于“休眠”状态或处于微弱的代谢活动。,常用的保存方法有以下几种。,二、菌种保藏,（一）斜面低温保藏法,这是一种较好的简易保藏法，目前应用最多。,方法：,将培养好的斜面菌种，放入4冰箱内保藏。,保存期：,36月,适用范围：,多数食用菌,注：不适于草菇。由于草菇对低温的耐受力较差，其菌丝在5下易死亡，所以保藏草菇菌种的温度需提高至1012或在草菇斜面菌种上加34mL 10%甘油防冻。,二、菌种保藏,（二）石蜡封藏法（隔绝空气法）,方法：,用注射器注入灭菌的石蜡。注入量以高出斜面尖端1cm为宜，然后塞上棉塞或无菌橡皮塞，用蜡封好，保藏在冰箱或低温干燥处。,（菌丝体与空气隔绝，降低其代谢活动，防止培养基干燥）,保存期：,6年,适用范围：,可用于保藏所有不宜用冷冻或干燥保藏的真菌。,石蜡,培养基,菌丝体,二、菌种保藏,（三）担孢子保藏法（干燥）,食用菌的孢子，可用滤纸条、河砂、氯化硅胶作吸附剂，干燥后进行保存。,1、滤纸片保藏法,将食用菌的孢子吸附在无菌的滤纸条上，干燥后进行保存，一般可保存35年。,方法：,滤纸片（剪成40.8cm小条灭菌）收集孢子（让孢子弹射到滤纸条上）将有孢子的滤纸条放入试管中（含硅胶）封口冰箱中保存,（三）担子孢子保藏法（干燥）,1、滤纸片保藏法,2、砂土管保藏法,砂土（21）装管灭菌接入孢子干燥保存。,（四）冷冻、真空、干燥保藏法,这种方法是利用低温、干燥、缺氧等条件保存菌种，一般可保存10年左右。,二、菌种保藏,三、制种、保藏中易碰到的问题及处理方法,1、母种污染处理,细菌污染,底部取菌：,可根据细菌只发生在,培养基表面,，而真菌菌丝能穿透到培养基内部的特点，用无菌操作法敲破试管取出培养基，在培养基的底部挑取一小块带有菌丝的培养基，移植到另一试管中培养，可得到纯正的母种。,二、菌种保藏,三、制种、保藏中易碰到的问题及处理方法,1、母种污染处理,细菌污染,底部取菌,覆盖培养：,将熔化培养基冷却到40，倒在已污染细菌的斜面上，使之形成厚约20 cm的覆盖层，当食用菌菌丝透过培养基形成新的菌落时，即可挑取转管纯化。,三、制种、保藏中易碰到的问题及处理方法,1、母种污染处理,细菌污染,真菌污染,若污染的是青霉、黄霉、木霉等真菌，只要母种菌丝与这些杂菌没有相联或尚有一部分菌丝没有相联，并且这些杂菌的菌丝还没有产生孢子时，可以用无菌方法仔细挑取没有相联的一部分菌丝，移植到另外的试管中继续培育，就能得到纯正的母种。,三、制种、保藏中易碰到的问题及处理方法,1、母种污染处理,2、原种、栽培种被杂菌污染的原因有哪些？怎样鉴别？,根据杂菌开始发生的部位，大致有以下几种污染原因：,若杂菌同时在培养基的,上、中、下,部位发生，主要是由于,培养基灭菌不彻底,造成的。,若杂菌开始发生在,接种块,上，这很可能是母种或原种已经感染了杂菌；或者是由于,接种工具不严格,（消毒），把杂菌带入。,2、原种、栽培种被杂菌污染的原因有哪些？怎样鉴别？,若杂菌先在,培养基表面,发生，这是由于接种过程中,无菌操作不严,而引起的。,若杂菌是在,接种后若干天才,发生的，而且是发生在瓶口往下挂的，这说明杂菌是从棉花塞侵入培养基的。引起的原因是,培养室湿度过大、棉塞受潮，造成霉菌滋生所致,。,三、制种、保藏中易碰到的问题及处理方法,3、为什么母种不能多次转管移植？,母种转管次数多了会削弱菌丝的生活力，降低出菇率，甚至造成菌丝不孕而不能形成子实体。因此母种培育可以一次多培育几支试管，不要反复多次分离转管，以确保菌丝旺盛的生活力。,（发生变异）,4、优良菌种的标准是什么？,各种食用菌菌种，既有特定的质量标准，也有共同的质量标准。这些共同的质量标准主要是,纯、壮,两条。,纯：,除银耳菌种，其余各种栽培食用菌均是一种菌丝体的纯培养物，不得混入杂菌或纯培养物以外的其它菌种。,例如：香菇7925菌种，只能是7925菌株菌丝体的纯培养。,4、优良菌种的标准是什么？,第一、不得混入毛霉、根霉、曲霉、木霉等任何霉菌或细菌、病毒；,（杂菌）,第二、也不得混入平菇、金针菇等其它食用菌的菌丝体；,（其它食用菌）,第三、也不得混入香菇7925菌株以外的任何一种香菇菌株。,（其它菌株）,壮：,菌种长相正常、长势旺、再生能力强。,1、培养料中麸皮、米糠的主要作用有（）。,A 补充维生素 B 提供碳源,C 提供氮源 D 提供矿质元素,一、选择题,2、培养料中加石膏、CaCO3等的作用主要有（）。,A 提供Ca+B 中和有机酸,C 补充碳源 D 提供能源,1、菌种袋内出现了绿色、黑色、黄色、红色等颜色，原因是（1），若此现象同时发生在菌种袋的上、中、下部位，其原因可能是（2）。防止此现象发生通常可用（3）、（4）等处理。,（1）杂菌污染，（2）培养料灭菌不彻底，,（3）15%的石灰水，（4）,0.3%多菌灵,14、食用菌栽培常用的消毒药品有（5）、（6）、（7）等。,（,5）70%酒精、（6）0.1%升汞、（7）0.1%KMnO4,二、填空题,三、简答题,1、优良菌种的标准是什么？,2、菌种保藏的原理和常用的保藏方法？,