第三章--基因操作的主要技术原理-基因工程-教学.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 基因操作的主要技术原理,第一节 核酸的分离与纯化,核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的方式存在的,真核生物95%DNA存在于细胞核内，5%在细胞器,75%的RNA存在于细胞质，10%在核内，15%在细胞器,rRNA（8085%），tRNA及核内小分子RNA（1015%），mRNA（15%）,一、核酸分离提取的原则,1.保证核酸一级结构的完整性,2.排除其它分子的污染,核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子,将其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染降到最低,排除其它核酸分子的污染,核酸提取的基本要求,尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏,减少化学因素对核酸的降解（过酸、过碱）,减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力、高温）,防止核酸的生物降解,二、质粒,载体的分离与纯化,关键：,如何使质粒,DNA,与宿主染色体,DNA,分开,依据：,质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA提取过程中，染色体DNA断裂成片段(线状)，而质粒DNA仍保持超螺旋构型,变性法提取质粒,DNA,的原理,在变性条件（碱性或高温)下，线状染色体DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。,当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢复天然构型，染色体DNA难以复性，交联形成不溶性网状结构，与变性的蛋白质和RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于上清液中。,碱变性法提取质粒,DNA,的步骤,收集细胞沉淀,加入溶液I(50mM 葡萄糖,25mMTris-HCl,10mM EDTA,45mg/mL 溶菌酶）,加入溶液II(0.2M NaOH,1%SDS),加入溶液III(3M NaAc pH4.8),离心除去沉淀，得含质粒DNA的上清液,苯酚抽提去除蛋白质,乙醇沉淀收集质粒DNA,在强碱性环境中暴露时间过长，cccDNA可发生不可逆变性,CsCl,密度梯度离心,原理：,CsCl,介质密度为,1.7g/cm,3,，超速离心后形成,1,1.9052 g/cm,3,的密度梯度,EB（溴化乙锭）可嵌入DNA两条链的碱基对之间，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应,线性或开环,DNA,分子，因其具有游离的末端而易于解旋，故可结合相当大量的,EB,直到达到饱和,具有,ccc,结构的质粒,DNA,由于负超螺旋的存在阻止,DNA,解链，因而只能结合很少的,EB,DNA,分子中结合,EB,越多，其浮力密度越小，因而形成不同的浮力密度得以区分,关键：,防止内外源,RNase,的作用,四、,RNA,的分离与纯化,解决办法：,外源RNase：高温（干热180，4hrs），焦碳酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者带手套,内源RNase：高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等,五、,核酸的浓缩与贮存,沉淀,是核酸浓缩最常用的方法，其最大的优点是通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调节核酸在溶液中的浓度，可去除溶液中某些可溶性的盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸,沉淀,DNA,的最常用方法是在,DNA,溶液中加入,1/10,体积的,3M NaAc,（或,KAc,）和,2,倍体积的乙醇,，放置,15,30min,，离心收集,DNA,沉淀，倒去上清液，加入,70%,的乙醇洗涤沉淀，去除残余的盐，再离心收集沉淀。,六、核酸的质量评估方法,核酸浓度的测定,ds-DNA,：,1 OD,260,50g/ml,ss-DNA&RNA,：,1 OD,260,40g/ml,单链寡核苷酸：,1 OD,260,20g/ml,核酸纯度的测定,DNA,：,A,260,/A,280,=1.8,若1.8，说明RNA未除尽,1.6，蛋白质或酚未除尽,RNA,：A,260,/A,280,=2.0,2.0，蛋白质或酚未除尽,第二节 凝胶电泳,一、核酸电泳的基本原理,核酸分子中的磷酸基团带负电荷，在电场中将向正极移动，通过凝胶的分子筛作用可以将不同大小和构型的核酸分子分离，分子量小的DNA，具有较紧密的构型，在凝胶中移动快；反之，分子量大的DNA移动慢,琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨,DNA,片段的能力,凝胶类型及浓度 分辨DNA片段的大小范围（bp）,0.3%琼脂糖 500001000,0.7%琼脂糖 200001000,1.4%琼脂糖 6000 300,4.0%聚丙烯酰胺 1000 100,10.0%聚丙烯酰胺 500 25,20.0%聚丙烯酰胺 50 1,DNA,RNA,DNA,蛋白质,核酸电泳的染色剂和指示剂,指示剂,在电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程,琼脂糖凝胶浓度 0.6%1%1.4%2%,溴酚蓝 1kb 0.6kb 0.2kb 0.15kb,二甲苯青蓝 2kb 1.6kb,在常规电泳中，,DNA,移动距离与分子量有关：分子量小的移动快，反之则慢,大于,20kb,的,DNA,大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些,DNA,分子要通过胶孔时必须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消失了。,三、脉冲场凝胶电泳,在脉冲场凝胶电泳中，加在凝胶上至少有两个电场方向，使得,DNA,分子要不断地调整泳动方向，不同分子量大小的,DNA,分子用于改变泳动方向的时间不同，则可以得到分离,脉冲场凝胶电泳,Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE,PFGE,工作原理,DNA,松弛时间：大分子,DNA,改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与,DNA,分子量呈正相关（,Tr,）,DNA,移动时间：,DNA,分子向前移动的时间（,Tm,）,电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（,Tp,）,Tp,小,=Tm,小,+Tr,小,Tp,大,=Tm,大,+Tr,大,Tp,小,=Tp,大,Tr,小,Tm,大,，所以，,S,小,S,大,显然，要使一个,DNA,样品中不同大小的,DNA,分子分离，脉冲时间应选在最大,DNA,分子所需的上限。,第三节 DNA序列分析,1.,双脱氧核苷酸链终止法,Dideoxy-termination sequencing,Sanger法,基本原理：,双脱氧（,2,，,3,）,-,核苷酸可以象,2-,脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的,DNA,链中，但因,3,端不具,OH,基，,DNA,链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个,DNA,分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的,DNA,片段测定出核苷酸序列,过程,：,制备,ss-DNA,与引物退火,分为,4,个反应系统,每个系统中加入,dNTP,（其中,dATP,常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸,DNA,聚合酶定序反应,反应产物变性后电泳,凝胶干燥,放射自显影,DNA Sequencing Reactions,The DNA sequencing run is similar to the PCR run.,The run mix includes the template DNA,Taq,polymerase,dNTPs,ddNTPs,and a primer:a small piece of single-stranded DNA 20-30,nt,long that hybridizes to one strand of the template DNA.,The run is,intitiated,by heating until the two strands of DNA separate,then the primers anneals to the complementary template strand,and DNA polymerase elongates the primer.,4 different DNA synthesis reactions are run,begin synthesis from specific priming point,add components for DNA synthesis,+specific,ddNTP,for,each,of the four reactions,e.g.,ddATP,No 3OH.,ddCTP,A,C,C,C,T,T,G,G,Method from Saenger,Manual sequencing uses radiolabeled dATP(35-S or 33-P)to label the DNA.The sample is then split into four tubes each with an individual ddNTP present.The samples are then subjected to acrylamide gel electrophoresis followed by autoradiography.,DNA全自动测序,Putting It All Together,Using gel electrophoresis to separate each DNA fragment that differs by a single nucleotide will band each fluorescently tagged terminating,ddNTP,producing a sequencing read.,The gel is read from the bottom up,from 5 to 3,from smallest to largest DNA fragment.,屏幕显示的胶图,Raw Automated Sequencing Data,A 5 lane example of raw automated sequencing data.,Green:,ddATP,Red:,ddTTP,Yellow:,ddGTP,Blue:,ddCTP,Sanger：荧光检测,377测序仪,人类基因组计划,测序的主力机型,测序的主要设备,上样走电泳,编写样品清单,全自动的测序仪器：MegaBace,华大基因研究中心,(,北京,),承担了人类3号染色体短臂上的约3000万对碱基的测序任务，使中国成为继美、英、日、德、法之后第六个加入国际测序俱乐部的国家。,中心已建成了基因组学、蛋白质组学、生物信息学研究及产业化平台，拥有,ABI 377-96,平板测序仪,11,台，,MegaBACE1000,毛细管测序仪,70,台,。,TADA!,2001,The HGP consortium publishes its working draft in,Nature,(15 February),and Celera publishes its draft in,Science,(16 February).,2.Maxam-Gilbert化学法,原理：,DNA,链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应，然后发生,12,个碱基的脱落或取代，最后发生链断裂，不同位置断裂的,DNA,分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列,4,种反应体系中，化学试剂特异断裂,DNA,机制,G反应：,硫酸二甲脂使鸟嘌呤N,7,甲基化,AG反应：,甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，使嘌呤环被吡啶取代,C+T反应,：,肼能裂解嘧啶环，进而导致其脱落,C反应：,在一定浓度的NaCl条件下，肼只对胞嘧啶起作用,化学法测序的一大优点是不需要模板，引物和DNA聚合酶。待测DNA链的检测用,32,P末端标记,作 业,A solution contains double-stranded DNA fragments of size 3 kb,6 kb,9 kb,and 12 kb.They are separated in an electrophoresis gel.In the diagram of the gel at the right,match the fragment sizes with the correct bands.,A cloned fragment of DNA was sequenced by using the dideoxy method.A part of the autoradiogram of the sequencing gel is represented here,Deduce the nucleotide sequence of the DNA nucleotide chain synthesized from the primer.Label the 5 and 3 ends,Deduce the nucleotide sequence of the DNA nucleotide chain used as the template strand.Label the 5 and 3 ends,Write the nucleotide sequence of the DNA double helix(label the 5 and 3 ends),第四节,分子杂交技术,核酸杂交,Southern 印迹杂交（Southern blotting）,Northern 印迹杂交（Northern blotting）,Western 印迹杂交（Western blotting,）,Southern杂交,Southern杂交是指以Southern名字命名的DNA转移杂交技术，用于特定DNA序列的检测，包括基因组特定DNA序列的定位，相关片段的同源性测定、从cDNA库、基因组文库中筛选目的基因等。用一种或多种限制性内切酶对基因组DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在互补的核酸序列。该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。,Southern 印迹杂交的用途,确定在克隆片段中基因编码区的大小和位置,确定克隆片段在基因组中的拷贝数,Southern blotting,Southern blotting,Northern Blotting,相对Southern blotting命名的，与Southern blotting不同的是，它检测的对象是RNA分子。,Western Blotting,杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从SDS-PAGE中转移到一固相支持物上，通过与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反应进行检测,主要用于基因的表达产物蛋白质的检测,第五节 PCR技术,一、PCR技术的基本原理,Polymerase chain reaction,PCR,聚合酶链式反应,A method for amplifying specific DNA segments that exploits certain features of DNA replication.,一个DNA经n次扩增后,一个DNA分子可变为2,n,理论上经过30次循环，靶DNA得到10,9,倍的扩增，实际是10,67,倍的扩增,DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物,二、,PCR反应的各种组份及作用,一个标准的PCR反应体系（50100 l）,50 mmol/L KCl,10 mmol/L Tris-HCl（pH=8.4）,1.5 mmol/L MgCl,2,100 g/ml 明胶或牛血清白蛋白（BSA）,2个引物，各0.25 mol/L,dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP）,各200mol/L,模板DNA（人基因组DNA）0.11g,Taq DNA聚合酶 2 U,Denaturation 94,0.5min,Primer annealing 55,1.5mion,Extension 72,1min,30 cycles,变性（模板）退火（引物与模板）延伸（新合成DNA链）,1.模板DNA,用于PCR扩增的模板DNA通常是从细胞中提取的染色体DNA，它们并不需要高度纯化。,待扩增的靶DNA的长度在3kb以下是PCR的有效扩增范围，,采用经改造的Taq DNA聚合酶可扩增出40 kb的DNA 片段,。,2.引物,PCR引物是与待扩增的目的DNA两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段,引物的长度通常为1730个核苷酸,引物太短，可能同非靶DNA杂交，得出非预期的扩增产物；,引物太长，引物与模板的结合效率降低，影响扩增效率。,如,8nt,的引物，平均每,4,8,=65536,bp,就会有一个结合位点，在全长为,310,9,bp,的人类基因组中，大约有,43000,个可能的结合位点，不能得到单一的特异性扩增产物。,如为,17nt,的引物，出现几率为,4,17,=17,179,869,184,bp,，,长度超过人类基因组长度的,5,倍，故在人类基因组中只可能有一个结合位点。,但引物不是越长越好，过长的引物同模板,DNA,的杂交效率反而下降，从而降低,PCR,反应的效率。,简并引物,是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间只有一个或数个核苷酸的差异。如根据氨基酸序列推测出的核苷酸序列。,引物与复性温度,引物与模板结合的特异性与复性温度有密切关系,当复性温度偏低时，引物与模板配对出现错配碱基，导致一些不需要的DNA片段被扩增,复性温度过高，引物与模板不能配对,复性温度常与引物的长度和碱基组成有直接关系，引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些,Tm=4(GC)2(AT)12 below,引物设计的一般原则:,Correspond with the sequences flanking the target region on the template molecule.,引物的长度常为1730,GC含量为40%60%,Tm值高于55,两条引物间配对碱基数小于5个,引物自身配对(特别是在引物的3端)形成的茎环结构,茎的碱基配对数不大于3,通常采用计算机辅助设计,3.,dNTP,浓度为20200mol/L，4种dNTP以等摩尔浓度配制,浓度过高，加快反应速度，但可增加碱基的错误掺入率和成本,浓度过低，反应速度下降，提高实验的精确性,4.,Taq DNA聚合酶,基本特点,:Taq DNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得,具有DNA聚合酶活性、53外切酶活性、逆转录酶活性,最适反应温度为80,最适pH8.0和最佳反缓冲液TrisHCl,最佳二价阳离子Mg,2+,（10 mM）,具良好的热稳定性：在90下连续反应30分钟仍有70%的酶活,扩增产物的可靠性:,评估DNA聚合酶的一个重要指标是它复制DNA的可靠性，即掺入错误碱基的频率,天然复制的DNA分子中错误掺入率为10,-9,在体外实验中，Klenow片段的错误掺入率为10,-4,，Taq DNA聚合酶的错误掺入率为510,-3,，而T4聚合酶的错误掺入率为10,-7,在克隆基因时，应采用高保真的Taq DNA聚合酶（Pfu）（3-5 exonuclease),5.,PCR反应的平台期,反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，出现平台期的原因可能有：,后期循环酶浓度或聚合时间不足；,引物耗尽；,dNTP耗尽；,产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。,三、PCR产物的鉴定,Gel electrophoresis of PCR products,Cloning of PCR products,Sequencing of PCR products,Cloning PCR products,Taq DNA polymerase tends to add an additional nucleotide,usually A,to the end of each strand it synthesizes.,Design primers that contain restriction sites,第六节 DNA芯片技术,DNA芯片或微阵列技术(DNA chip or microarray),DNA芯片（或基因芯片）,是将许多特定的DNA寡核苷酸或DNA片段（称为探针）固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交分析，利用碱基互补配对原理进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面,基因芯片,基因芯片是基因功能研究领域的一次革命,与其他的基因检测技术相比，基因芯片技术最大的特征在于能同时定量或定性地检测成千上万的基因信息,基因芯片技术具有微型化、自动化和网络化等特点，是典型的多学科高技术交叉的结晶,1991年世界第一块原位合成寡核苷酸芯片在美国,Affymetrix诞生,1995年世界第一块cDNA芯片在斯坦福大学实验室诞生,-Science.1995,270:467-470,基因芯片的历史,80年代末期科学家提出杂交法测序的思想，也就是寡核苷酸芯片的基本原理,基因芯片技术流程,制备方法及点样仪器,探针的制备：,标记,方法,杂交：,杂交液、杂交温度、,洗涤条件的选择,扫描仪:激光,CCD,分析软件的开发,基因芯片的制备,杂交,检测,数据分析,基因芯片实验原理,一、基因芯片原理及制备方法,原位合成：寡核苷酸芯片,直接点样：寡核苷酸芯片和cDNA芯片,1.原位合成法,在固相介质表面特定区域合成已知序列的寡核苷酸的一类技术的总称,采用光导化学合成和照相平板印刷技术合成寡核苷酸芯片,2.直接点样芯片,已知基因序列通过在液相中化学合成，或通过PCR技术扩增，或克隆的基因组片段，经纯化及定量分析后，由,点样机器人将靶基因序列直接点到预先经过化学修饰的基片上；然后将未结合的靶基因从基片上洗掉，就得到基因芯片,Microarray Robot,3.原位合成法与直接点样法的比较,原位合成法,直接点样法,直接从DNA数据库得到信息进行寡核苷酸合成,预先制备cDNA样品并进行合成,芯片个体之间差异小,差异大,密度高，400000/1.6cm,2,64 500/6.5cm,2,合成寡核苷酸长度有限，特异性差,靶基因检测特异性高,成本高,成本低,数据分析、寻找差异表达的基因,Cy3标记A组织,Cy5标记B组织,混合探针,以两种波长的激光扫描,杂交,A,B,1.实验样本的制备,常用的基因芯片实验样本是mRNA(cDNA),直接从组织或细胞中提取的mRNA,利用PCR技术扩增出的cDNA,2.探针的标记-荧光标记,用花青素(cyanin)Cy3,Cy5进行双色荧光标记,其激发和发射波长分别是550/570,649/670,当用mRNA作模板时,常用反转录方法进行直接标记,3.芯片杂交,How DNA Microarrays Work,A,T,G,C,A,A,T,T,G,A,C,T,G,C,A,G,T,C,G,T,G,G,T,C,T,G,A,T,T A A G T C G,Gene TEF4:,A G T C,T,A,A,G,T,C,G,图像与数据处理,扫描仪,激光共聚焦扫描,光源：特定波长的光,激发面积：100平方微米,如：,ScanArray 3000,CCD(电荷耦合摄像芯片扫描仪),光源：连续波长的光（如弧光灯）,同时对整张芯片表面进行扫描,DNA Microarray Image,Reference cDNA,Experimental cDNA,Upregulated,Downregulated,Gene GTF4,基因芯片,芯片测序,药物研究,基因图绘制,农林业,表达分析,突变检测,军事、司法,疾病诊断,.,.,.,.,基因芯片的应用,肝 癌 相 关 基 因 的 研 究,See movie,拟 南 芥 对 病 源 菌 防 御 反 应,三、芯片实验室,laboratory on chip,将纳米技术引入生物芯片，在微小的硅材料表面，制造出能够对微量样品进行变性、分离、纯化、电泳、PCR扩增、加样、检测等微小结构，使过去一个实验的各个步骤，微缩于一个芯片上,