基因工程-4-受体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 基因工程的受体系统,1、大肠杆菌受体系统 基因复制,原核细胞 2、芽孢杆菌受体系统 扩增场所,受体系统 3、其他细菌受体系统 外源基因,表达场所,1、酵母菌受体系统,真核细胞 2、哺乳动物细胞受体系统,受体系统 3、,植物细胞受体系统,受体(宿主)Host:能支持质粒,病毒进行复制的生物体。,受体系统,一、,E.coli,受体系统,大肠埃希氏菌,(,E.coli,)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的,1、,E.coli,受体系统的特点,遗传背景清楚利于研究,繁殖快易于获得大量基因产物,含有质粒利于基因转移,表达非,E.coli,基因，其潜力几乎是无限的,2、,E.coli,受体系统的优点,遗传背景清楚利于研究,繁殖快易于获得大量基因产物,含有质粒利于基因转移,表达非,E.coli,基因，其潜力几乎是无限的,3、E.coli受体系统的缺点,高水平表达的基因产物易发生沉淀，凝聚，,不易折叠，无生物活性,基因产物纯化工艺复杂（大海捞针）,基因产物受污染（内毒素）,基因产物对受体菌有毒害作用,基因产物易被水解,从安全角度并不理想,缺乏基因产物表达后加工机制,基因型：endA1 gyrA96(nalR)thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 FTn10 proAB+lacIq(lacZ)M15 hsdR17(rK-mK+)。,特点：具有四环素抗性和萘啶酮酸抗性。,recA1和 endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。,用途：分子克隆和质粒提取。,Xl1-Blue菌株,endA1=,elimination of non-specific digestion by Endonuclease I,recA1=,For reduced occurrence of unwanted recombination in cloned DNA,基因型：F,ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-)(DE3 lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5)。,特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。,用途：蛋白质表达。,BL21(DE3)菌株,ompT=,mutation in outer membrane protein protease VII,reducing proteolysis of expressed proteins,基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+(lac-proAB)e14-F traD36 proAB+lacIq lacZM15hsdR17(rK-mK+)。,特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达,可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选。,用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。,JM109菌株,基因型：F,-,，mcrA(mrr-hsd RMS-mcrBC)，80，lacZM15，lac74，recA1，ara139(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr)endA1，nupG,用途：高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。,TOP10菌株,第三节 基因工程的受体系统,1、大肠杆菌受体系统,原核细胞,2、芽孢杆菌受体系统,受体系统 3、其他细菌受体系统,1、酵母菌受体系统,真核细胞 2、哺乳动物细胞受体系统,受体系统 3、,植物细胞受体系统,受体系统,二、枯草杆菌受体系统,芽抱杆菌是一类耐高温、高压及低pH值的,有益微生物,1、枯草杆菌（Bacillus subtilis）受体系统特点,最大优点：外分泌,高水平表达，基因产物不发生沉淀,纯化基因产物相对简单,基因产物污染少,基因产物不易被水解,安全,遗传背景仅次于,E.coli,2、缺点：,转化效率相对较低,表达水平较低,1.乳酸杆菌受体系统的独特优势:,乳酸杆菌是食品级微生物,乳酸杆菌本身分泌蛋白较少,Usp45,是迄今已知乳酸杆菌分泌的唯一可检测蛋白,减少了载体微生物的自身蛋白对外源分泌蛋白的干扰,乳酸杆菌不产生任何细胞外蛋白酶,不会引起分泌蛋白发生细胞外的降解。,三、乳酸杆菌受体系统,2.乳酸杆菌作为疫苗载体的优越性：,在呼吸系统、消化系统、泌尿系统定植,对维持微生态平衡很重要。,在发酵食物中应用了几个世纪,被认为是安全的有益微生物。,免疫方便、便宜、安全,不需要注射,无免疫原性,四、酵母菌受体系统,安全性更大,遗传信息和生理状况更适合于真核基因表达,基因产物外分泌,遗传背景较清楚,具基因表达后加工机制,1.酵母菌受体系统的特点,2.常用酵母菌受体系统,酿酒酵母,甲醇酵母,酿酒酵母,酿酒酵母（,Saccharomyces serevisiae,）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的“大肠杆菌”。,1.酿酒酵母表达系统表达外源基因的优点,：,酿酒酵母培养条件普通，生长繁殖迅速，用于表达基因工程产品时，工艺简单，可以大规模生产，有效降低生产成本；,它不会产生毒素，安全可靠。,酿酒酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，特别适合于表达真核生物基因；,外源基因可在酿酒酵母中分泌表达，表达产物分泌至胞外不仅有利于纯化，而且避免了产物在胞内大量蓄积对细胞的不利影响；,酿酒酵母的遗传背景清楚，容易进行遗传操作。,2.甲醇酵母受体系统的优点：,含特有的,AOX,（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可以严格地调控表达。,有完备的发酵方法,可以高密度连续培养，其转化子能够非常稳定地表达外源蛋白质，蛋白产量高。,适应能力强，易于操作，可以在廉价的非选择性培养基中生长。,基因表达产物既可在胞内，又可被分泌到胞外，分泌的异源蛋白质占所有被分泌蛋白的,30%,以上，利于工业规模的生产。,能对要表达的多肤和蛋白质进行翻译后加工处理。,甲醇酵母（毕氏酵母）,3.巴氏毕赤酵母的优点：,对外源蛋白的糖基化等更接近于哺乳动物细胞,表达蛋白水平高出酿酒酵母,10-100,倍。,1.,动物受体系统,优点：,表达外源基因具有后加工系统，基因产物具动物活性,2.动物受体系统,缺点：,较难大规模培养，培养速度慢,五、动物受体系统,具全能性，较易组织培养，可诱导出植株 基因工程植物。也可通过组织培养直接获得基因产物。,六、植物受体系统,