07微生物限度检查法.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,天津市药品检验所 郭艳娟,*,微生物限度检查法,10/23/2026,0,天津市药品检验所 郭艳娟,定义：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料,、辅料受微生物污染的程度。,检验项目:细菌数、霉菌及酵母菌数检查,控制菌检查,微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。,10/23/2026,1,天津市药品检验所 郭艳娟,细菌及,控制菌,培养温度,为3035。,霉菌、酵母菌培养温度为2328。,结果报告：以1g、1ml、10g、10ml 或,10cm,2,为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告,。,10/23/2026,2,天津市药品检验所 郭艳娟,稀释剂：,1.pH7.0无菌氯化钠,蛋白胨,缓冲溶液(供试液制备),2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）,3.pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（结肠溶制剂）,4.0.9%无菌氯化钠溶液（菌液稀释）,10/23/2026,3,天津市药品检验所 郭艳娟,供试液制备,除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：,1.液体供试品,取供试品10ml，加稀释剂至100ml，混匀，作为1：10供试液。,水溶性液体,制剂应用,混合,的供试品原液直接作为供试液。,10/23/2026,4,天津市药品检验所 郭艳娟,2.固体、半固体或黏稠性供试品,称取供试品10g，加稀释剂至100ml，用匀浆仪或其它适宜的方法混匀后，作为1：10供试液。,10/23/2026,5,天津市药品检验所 郭艳娟,3.特殊供试液制备方法,（1）非水溶性供试品 取供试品5g(或5ml),加入含司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌溶化,混合物,（温度低于45）的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入,45,左右的稀释剂至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20供试液（无抑菌作用）。,10/23/2026,6,天津市药品检验所 郭艳娟,取供试品10g，加至含玻璃珠和20ml的无菌十四烷酸异丙酯的,容器,中，充分振摇，使供试品溶解。,准确,加入约45的稀释剂100ml，振摇510分钟，萃取，待油水明显分层，取其水层作为1：10供试液。十四烷酸异丙酯的制法：采用薄膜过滤法 除菌，选用孔径为0.22um的脂溶性滤膜，在140干热灭菌2小时。,10/23/2026,7,天津市药品检验所 郭艳娟,（2）非水溶性膜剂供试品 取100cm,2,，剪碎，加100ml的稀释剂（必要时刻增加稀释液），浸泡，振摇，作为1:10的供试液。,10/23/2026,10,天津市药品检验所 郭艳娟,（3）肠溶及结肠溶制剂供试品,取供试品10g，加稀释剂至100ml，置45水浴中，振摇，使溶解，作为1：10供试液,肠溶制剂供试品：用pH6.8无菌磷酸盐缓冲液溶解。,结肠溶制剂供试品：用pH7.6无菌磷酸盐缓冲液溶解。,10/23/2026,11,天津市药品检验所 郭艳娟,（4）气雾剂、喷雾剂供试品,（5）具抑菌活性的供试品,当供试品有,抑菌活性,时，应消除其抑菌活性后，再依法检查。常用的方法有：(1)培养基量稀释法,(2)低速离心沉淀法：500转/分离心3分。,(3)薄膜过滤法(4)中和法,10/23/2026,12,天津市药品检验所 郭艳娟,（6）贴剂供试品,取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴 在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯 80 或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少 30 分钟，制成供试液。贴剂也可以其他适宜的方法 制备成供试液,。,10/23/2026,13,天津市药品检验所 郭艳娟,供试液制备,注意,供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。,表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。,10/23/2026,14,天津市药品检验所 郭艳娟,细菌、霉菌及酵母菌计数,计数检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。,计数方法：平皿法、薄膜过滤法。,10/23/2026,15,天津市药品检验所 郭艳娟,1,.平皿法,取按已验证方法制备的均匀供试液或原药液，用pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲溶液稀释成110,2,、110,3,等稀释级。,取适宜的连续23个稀释级的供试液。,细菌计数,原液、110、110,2,、110,3,3个稀释级,霉菌及酵母菌计数,原液、110、110,2,2个稀释级,10/23/2026,16,天津市药品检验所 郭艳娟,阴性对照试验,取试验用的稀释剂,1,ml,，,置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备,2,个平板，均不得有菌生长。,10/23/2026,17,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,18,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,19,天津市药品检验所 郭艳娟,培养和计数,除另有规定外，细菌培养,3天,；霉菌、酵母菌培养,5天,；必要时，可适当延长培养时间。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。,10/23/2026,20,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,21,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,22,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,23,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,24,天津市药品检验所 郭艳娟,含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。,10/23/2026,25,天津市药品检验所 郭艳娟,。,一般情况下，营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；,酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。,在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。,10/23/2026,26,天津市药品检验所 郭艳娟,菌数报告规则,细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于 300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告 1g、1mL 或 10cm,2,供试品中所含的菌数。,如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于 1 时，以1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数,。,10/23/2026,27,天津市药品检验所 郭艳娟,（,5,）具抑菌活性的供试品,当供试品有抑菌活性时，应消除其抑菌活性后，再依法检查。常用的方法有：,(1),培养基量稀释法,(2),低速离心沉淀,(3),薄膜过滤法,(4),中和法（磺胺类加对氨基苯甲酸）,10/23/2026,28,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,29,天津市药品检验所 郭艳娟,2.薄膜过滤法,取适宜稀释级的供试液（相当于1g或1ml），直接过滤，或加至100ml稀释剂中，混匀，过滤。,用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“方法的验证”。冲洗后取出滤膜，,菌面朝上,贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。,10/23/2026,30,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,31,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,32,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,33,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,34,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,35,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,36,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,37,天津市药品检验所 郭艳娟,阴性对照试验 取试验用的稀释剂1ml同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。,培养和计数 同平皿法，每片滤膜上的菌落数应,不多于100个,。,10/23/2026,38,天津市药品检验所 郭艳娟,菌数报告规则,以该稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；若各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数,。,10/23/2026,39,天津市药品检验所 郭艳娟,制药用水微生物限度检查方法,灭菌注射用水：无菌,注射用水：,微生物限度,取本品至少200ml,，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（附 J），,细菌、霉菌和酵母菌,总数,每,100ml不得过10个,。,例：,某生物技术有限公司生产的,注射用水,，分别吸取100ml，经薄膜过滤处理，取滤膜依法检查，细菌数33个/100ml；霉菌和酵母菌数100ml小于1个。结果,细菌、霉菌和酵母菌总数33个/100ml,，不符合规定,10/23/2026,40,天津市药品检验所 郭艳娟,纯化水：微生物限度 取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录 J），,细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个,。,例：某生物技术有限公司生产的纯化水，分别吸取1ml，经薄膜过滤处理，取滤膜依法检查，细菌数不可计；霉菌和酵母菌数1ml小于1个。同时吸取10ml纯化水，加,pH7.0无菌氯化钠,蛋白胨,缓冲溶液稀释至100,ml，取1ml薄膜过滤，细菌数150个/ml（滤膜上有15cfu）。结果,细菌、霉菌和酵母菌总数150个/ml,，不符合规定。,10/23/2026,41,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,42,天津市药品检验所 郭艳娟,控制菌检查,大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,沙门菌,大肠菌群,梭菌,白色念珠菌,10/23/2026,43,天津市药品检验所 郭艳娟,控制菌检查检查法,供试品的控制菌检查应按,已验证的方法,进行，增菌培养基的实际用量同验证的用量。,阳性对照试验 进行供试品的控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10-100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验 应检出相应的控制菌。,阴性对照试验 取稀释剂10ml按相应控制菌检查法检查，为阴性对照，应无菌生长。,10/23/2026,44,天津市药品检验所 郭艳娟,菌液制备,用无菌0.9%氯化钠溶液制成每1ml含10-100cfu的菌悬液或10-100cfu的孢子悬液。,菌种,培养基,培养温度（）,培养时间（h）,大肠埃希菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,白色念珠球菌,黑曲霉,肉汤培养基,改良马丁,培养基,35-37,23-28,18-24,24-48,5-7（天）,10/23/2026,45,天津市药品检验所 郭艳娟,接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养 57 天，加入 35ml 含 0.05（v/v）聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05（v/v）聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含孢子数 50100cfu 的孢子悬液。,菌悬液在室温下放置应在 2 小时内使用，若保存在 28可在 24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在 28，在验证过的贮存期内使用,。,10/23/2026,46,天津市药品检验所 郭艳娟,结果判断,供试品检出控制菌或其它致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。,供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。,10/23/2026,47,天津市药品检验所 郭艳娟,结果判断,眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种的规定。,10/23/2026,48,天津市药品检验所 郭艳娟,结果判断,若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种的规定，判供试品不符合规定。,10/23/2026,49,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,50,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,51,天津市药品检验所 郭艳娟,10/23/2026,52,天津市药品检验所 郭艳娟,谢谢！,10/23/2026,53,天津市药品检验所 郭艳娟,