内毒素检查.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,细菌内毒素检查,目录,1,、实验原理,2,、实验试剂,3,、试验器具,4,、检查方法概述,5,、供试品溶液的制备,6,、内毒素限值的确定,7,、最大有效稀释倍数（,MVD,）的确定,8,、鲎试剂灵敏度复核,9,、干扰试验,10,、供试品的细菌内毒素检查,实验原理,利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的现象，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。,阳性结果,细菌内毒素的量用内毒素单位,(EU),表示。,实验试剂,细菌内毒素国家标准品,系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。,细菌内毒素工作标准品,系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。,细菌内毒素检查用水,指内毒素含量小于,0.015EU/ml,（用于凝胶法）或,0.005EU/ml,（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。,试验器具,刻度吸管、凝集管（,1075mm,）、三角瓶、小试管（,16100mm,）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。,耐热器皿常用干热灭菌法（,250,、,30,分钟以上）去除，塑料用具应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械（目前多为无热原的一次性用品）,。,试验准备,1,、清洗干净的玻璃容器、注射器、镊子、剪刀等放入金属制容器内密闭加热去热原，达到时间后，关闭电源。待烤箱温度自然降低至室温，在不开启金属容器的情况下，可一周内使用，否则必须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。,2,、塑料制品清洗干净后在,30%,的双氧水中浸泡,4H,，再用无热原水充分冲洗后在,60,烘箱中烘干备用，一般我们会把枪头装入盒中进行湿热灭菌。,3,、试验前应先把水浴锅或恒温器温度调到,37 1,。,检查方法概述,凝胶法,限量试验,半定量试验,光度测定法,浊度法（终点浊度法和动态浊度法）,显色基质法（终点显色法和动态显色法）,凝胶法：最简单、经济、应用最广泛，中国药典的“仲裁”方法,对干扰相对不敏感。,较光度测定法不灵敏,内毒素限值的确定,一般按公式：,L=K/M,式中,L,为供试品的细菌内毒素限值，以,EU/ml,、,EU/mg,或,EU/U,（活性单位）表示。,K,为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量。注射剂,K=5EU/,（,kgh,），放射性药品注射剂,K=2.5EU/,（,kgh,），鞘内用注射剂,K=0.2EU/,（,kgh,）。,M,为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，依据药品使用说明书，,临床用药须知,确定。,例：,某产品,M,为,14.3mg/kg,，,L=5/14.3=0.35EU/mg,假如此产品的浓度为,100mg/ml,，那么，,L=0.35,100=35EU/ml,鲎试剂灵敏度复核,目的,考察鲎试剂的灵敏度是否准确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。,当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。,细菌内毒素标准溶液的准备,1,、,取细菌内毒素工作标准品（或国家标准品）一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，,75%,酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。,鲎试剂灵敏度复核,细菌内毒素标准溶液的制备图示：,鲎试剂灵敏度复核,待复核鲎试剂的准备,取规格为,0.1ml/,支的鲎试剂,18,支，每支加入,0.1ml,检查用水使溶解备用（规格大于,0.1ml,支的鲎试剂，按其标示量加入细菌内毒素检查用水复溶后按,0.1ml/,管分装到凝聚管中，至少准备,18,管）。,加样,将已充分溶解的待复核鲎试剂,18,支（管）放在试管架上，排成,5,列，其中,4,列,4,支，,1,列,2,支。其中,4,支,4,列分别加入,0.1ml,的,2,、,、,0.5,和,0.25,的内毒素标准溶液；另,2,支（管）加入,0.1ml,检查用水作为阴性对照。,鲎试剂灵敏度复核,加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，垂直放入,371,恒温器中，保温,602,分钟。,结果观察,将试管轻轻取出，缓缓倒转,180,，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。,阳性,阴性,鲎试剂灵敏度复核,计算,当最大浓度,2,管均为阳性，最低浓度,0.25,管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果。,c=lg-1,（,X/4,）,式中,X,为反应终点浓度的对数值（,lg,）。,反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。,鲎试剂灵敏度复核,例子：,结果判断,当,c,在,0.5,2,（包括,0.5,和,2,）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度,为该批鲎试剂的灵敏度。,干扰实验,进行干扰试验一般步骤,供试品限值确定,根据鲎试剂的灵敏度确定,MVD,范围,（供试品溶液浓度范围）,预试验（初筛试验）确定样品最大不干扰浓度,正式干扰试验,干扰实验预实验,目的,初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以,EU/mg,或,EU/U,活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以,EU/ml,表示），为正式干扰实验提供依据,避免干扰试验的盲目性,。,干扰实验,操作方法,1,、将无可检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过,MVD=CL/0.03,（,0.03EU/ml,为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度）。,2,、使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做,2,支供试品管和,2,支供试品阳性对照（即该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成,2,浓度）。另取,2,支细菌内毒素检查用水作阴性对照，,2,支加入,2,浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。,例 制备稀释倍数为,4,的供试品阳性对照溶液：,0.3ml4.0EU/ml,的内毒素标准液,+0.3ml,稀释倍数为,2,的供试品稀释液,0.6ml,含,2EU/ml,内毒素标准液的稀释倍数为,4,的供试品稀释液,3,、保温,602,分钟，观察并记录结果。,干扰实验,举例,某注射液限值为,2.5EU/ml,，按,MVD,CL/,计算出灵敏度为,0.03EU/ml,下的,MVD,为,83,倍，将供试品溶液进行一系列稀释，用灵敏度为,0.25 EU/ml,的鲎试剂预实验，结果如下：,稀释倍数,原液,5,10,20,40,80,供试品溶液,供试品阳性对照,+,+,+,由以上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为,20,倍，可在此浓度下进行正式干扰试验。,干扰实验,正式干扰实验,制备内毒素标准对照溶液,取,1,支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成,4,个浓度的标准溶液即,2,、,、,0.5,、,0.25,。,制备含内毒素的供试品溶液,将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将同支细菌内毒素标准品稀释成,4,个浓度即,2,、,、,0.5,、,0.25,的含内毒素的供试品溶液。,鲎试剂的准备,取规格为,0.1ml/,支的鲎试剂,36,支，备用。,干扰实验,实验结果计算,如两组最大浓度,2.0,均为阳性，最低浓度,0.25,均为阴性，阴性对照,4,管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（,Es,）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（,Et,）。,Es=lg-1,（,Xs/4,）,Et=lg-1,（,Xt/4,）,式中,Xs,、,Xt,分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（,lg,）。,干扰实验,当,Es,在,0.5,2,（包括,0.,和,2,）及,Et,在,0.5Es,2Es,（包括,0.5Es,和,2Es,）时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。,当,Et,不在,0.5Es,2Es,（包括,0.5Es,和,2Es,）时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。应使用适宜方法排除干扰，如可将供试品进行更大倍数稀释（,不超过,MVD,）。,建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至少取三个批号的供试品。用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰实验。,供试品细菌内毒素检查,在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做,2,支供试品管和,2,支供试品阳性对照，同时每次实验必须做,2,支阳性对照和,2,支阴性对照。,供试品溶液的制备,根据内毒素限度值，计算,MVD=CL/,。然后将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过,MVD,。,一般稀释至,MVD,；如样品有干扰作用，选择符合干扰试验要求的第二浓度作为日常检查浓度。,阳性对照溶液的制备,用检查用水将内毒素标准品稀释制成,2,浓度的内毒素标准溶液。,供试品细菌内毒素检查,结果判断,当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验方有效。,若供试品,2,管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品,2,管均为均为阳性，应认为不符合规定；如,2,管中,1,管阳性，,1,管阴性，则另取,4,支供试品管复试，,4,管中如有,1,管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于,MVD,而结果出现,2,管均为阳性或,2,管中,1,管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将稀释至,MVD,。,供试品细菌内毒素检查,例,某葡萄糖注射液，其内毒素限值为,0.5EU/ml,，设所用鲎试剂的灵敏度为,0.125EU/ml,。,MVD=CL/=0.5/0.125=4,将样品进行,4,倍稀释，并做,4,倍稀释下的供试品阳性对照。,供试品,供试品阳性对照,阳性对照,阴性对照,+,+,结果是否有效,有效,结果判断,该葡萄糖注射液内毒素含量小于,0.5EU/ml,，符合规定。,注意事项,1,、鲎试剂灵敏度复核。,鲎试剂是一种有生物活性的试剂，其稳定性受多种因素的影响，故药典要求在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验，其意义在于：,1,、验证鲎试剂灵敏度是否准确，,2,、考察实验室条件，,3,、考察实验人员操作技能，,4,、验证细菌内毒素标准品的效价是否准确。,2,、细菌内毒素标准品,标准品溶解后一定要在旋涡混合器上混合,15min,，以后每一步稀释至少混合,30S,，否则可能会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高，阳性对照不凝等不正确的实验结果。,注意事项,3,、,BET,水,BET,水是一种特殊的灭菌注射用水，根据药典要求细菌内毒素含量小于,0.015EU/ml,（凝胶法），而且严格要求,pH,值为,6.0,8.0,，绝不能用注射用水代替使用。,4,、检查法中的各种对照,在进行常规细菌内毒素检查时，规定了阳性对照，阴性对照及供试品阳性对照，阳性对照的目的是证明在实验条件下所用鲎试剂灵敏度是否符合规定，阴性对照的目的是证明所用的,BET,水中不存在可被检测到的内毒素，供试品阳性对照的目的是证明在试验条件下被检测的供试品保证不存在抑制因素，在进行常规细菌内毒素检查时，以上各种对照应同时进行。,结束，谢谢！,