氨基酸发酵机制.pptx

单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,氨基酸发酵机制,氨基酸发酵机制,第1页,新型甜味剂,-,蛋白糖,氨基酸发酵代谢调控,正常情况下微生物本身不能累积氨基酸，所以要打破微生物正常代谢调整路径。,经常采取几个方法：,1,、控制旁路代谢：以,D-,苏氨酸为底物发酵,D-,苏氨酸,L-,苏氨酸,脱氢酶 脱氢酶,a-,酮基丁酸,反馈抑制,L-,异亮氨酸,氨基酸发酵机制,第4页,2,、降低反馈作用物浓度：,谷氨酸,N-,乙酰谷氨酸,N-,乙酰,-Y-,谷氨酰磷酸,鸟氨酸,反馈抑制,瓜氨酸,精氨酸,谷氨酸棒杆菌缺乏将鸟氨酸转化为瓜氨酸酶，消除反馈抑制，可用于生产鸟氨酸。,氨基酸发酵机制,第5页,3,、控制细胞渗透性：,谷氨酸发酵：当细胞内生物素水平高时，谷氨酸不能透过细胞膜，需加入表面活性剂或青霉素，提升细胞膜通透性。,4,、控制发酵环境：,氨基酸发酵是人为控制环境结果，,见表,5-1,5,、促进,ATP,积累以利氨基酸生物合成：,氨基酸合成需要能量，,ATP,积累有利于氨基酸生物合成。,氨基酸发酵机制,第6页,第二节 谷氨酸发酵机制,谷氨酸，学名：,-,氨基戊二酸；其单钠盐：谷氨酸钠，商品名称味精，是主要调味品。,当前我国味精年产量已达,100,万吨，产销量占世界第一位,。,早期生产谷氨酸方法有两种，一是提取法：甜菜厂付产物糖蜜中含有焦谷氨酸，用强碱处理可得到谷氨酸；二是蛋白质水解法：将面筋加酸水解，再分离提纯。,1957,年发酵法生产谷氨酸在日本协和发酵企业投产。,氨基酸发酵机制,第7页,谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量,300,多倍谷氨酸，研究发觉：大量积累并非是当初构想因为特异代谢路径造成，而是：,代谢调整控制；,细胞膜通透性特异调整；,发酵条件适合；,综合调控结果。,氨基酸发酵机制,第8页,一、谷氨酸生物合成路径及调整机制,谷氨酸生物合成路径大致是：,葡萄糖经糖酵解（,EMP,路径）和己糖磷酸支路（,HMP,路径）生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶,A,（乙酰,COA,），然后进入三羧酸循环，生成,酮戊二酸。,酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶催化及有,NH4+,存在条件下，生成谷氨酸。即，谷氨酸生物合成路径包含,EMP,、,HMP,、,TCA,循环、,DCA,循环和,CO2,固定作用等。,氨基酸发酵机制,第9页,氨基酸发酵机制,第10页,氨基酸发酵机制,第11页,一）,EMP,路径、,HMP,路径,谷氨酸生产菌存在着两种代谢路径：,EMP,、,HMP,；,EMP/HMP=90/10,，生物素量增加，,HMP,路径增加（,26%,，,38%,）。,二）,TCA,、,DCA,和,CO2,固定作用,1.TCA,环（三羧酸循环）,KGA,脱氢酶酶活性微弱或丧失,这是菌体生成并积累,KGA,关键，从上图能够看出，,KGA,是菌体进行,TCA,循环中间性产物，在,KGA,脱氢酶作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶,A,，只有当体内,KGA,脱氢酶活性很低时，,TCA,循环才能够停顿，,KGA,才得以积累。在有,NH4,存在下，由谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化生成谷氨酸。,氨基酸发酵机制,第12页,2.DCA,环（乙醛酸循环）,菌体内必须有乙醛酸循环（,DCA,）关键酶,异柠檬酸裂解酶。该酶是一个调整酶，或称为别构酶，其活性能够经过某种方式进行调整，经过该酶酶活性调整来实现,DCA,循环封闭，,DCA,循环封闭是实现,GA,发酵首要条件。,3.CO,2,固定,体系中假如不存在,CO2,固定反应，则有：,氨基酸发酵机制,第13页,则,3/2 C6H12O6 +NH4+=C5H9O4 N+4 CO2,产率：,147/,（,180*3/2,）,=54.4%,氨基酸发酵机制,第14页,体系中存在,CO2,固定反应，则有：,氨基酸发酵机制,第15页,则有：,C6H12O6 +NH4+=C5H9O4 N+CO2,产率：,147/180=81.7%,可见，在,GA,生物合成过程中，,CO2,固定反应对于产率提升有着多么主要作用。,在许多微生物发酵过程中，通常需要检测反应器尾气组成，尤其是尾气中,CO2,含量，其主要目标就在于分析产物合成期间菌体代谢路径，有利于指导生产。,氨基酸发酵机制,第16页,三）氨导入,有三种方式：,酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。,GA,产生菌有强烈,L,谷氨酸脱氢酶活性,KGA+NH4+NADPH=GA+NADP,由天冬氨酸或丙氨酸经过氨基转移作用将氨基转给,酮戊二酸而生成,GA,。不过谷氨酸产生菌中天冬氨酸转氨酶,(GOT),和丙氨酸转氨酶,(GPT),活力很低，转氨路径并不主要。,谷氨酸合成酶路径。谷氨酸合成酶对,NH4,亲和力比谷氨酸脱氢酶强得多，当环境中,NH4,浓度很低时，可由谷氨酸合成酶路径合成谷氨酸。细胞内谷氨酸浓度很高时，反馈抑制谷氨酸脱氢酶活性，但不抑制谷氨酸合成酶。,氨基酸发酵机制,第17页,二 细胞膜通透性控制,细胞膜通透性调整对于,GA,发酵时非常主要，当菌体进入产物合成期时，开始有,GA,产生，这是假如能够大量把产物及时排泄到细胞膜外，能够解除,GA,对,L,谷氨酸脱氢酶活性抑制作用，从而实现由,Glucose,到,GA,高效率转化。可见，改进细胞膜通透性主要性，怎样进行呢？,氨基酸发酵机制,第18页,通常谷氨酸发酵采取菌种都是生物素缺点型，而生物素又是菌体细胞膜合成必须物质，生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需乙酰,CoA,辅酶。生物素缺点型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸合成。所以，能够经过控制生物素浓度，来实现对菌体细胞膜通透性调整。,生物素对细胞膜合成影响主要是经过对细胞膜主要成份,磷脂,(,结构见图,5-8),中脂肪酸生物合成来实现，当限制了菌体脂肪酸合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整菌体。生物体内脂肪酸合成路径以下：,氨基酸发酵机制,第19页,氨基酸发酵机制,第20页,三、菌种选育模型与控制方法,控制磷脂合成,使细胞膜受损（如表面活性剂）,青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜,经过油酸合成,控制磷脂含量,经过甘油合成,直接控制磷脂合成,提升细胞膜,谷氨酸通透性,氨基酸发酵机制,第21页,谷氨酸产生菌选育：,1.,选育生物素缺点型,生物素是脂肪酸生物合成中乙酰,CoA,羧化酶辅酶，生物素促进脂肪酸合成，再由脂肪酸合成磷脂。选育生物素缺点型菌株，阻断生物素合成，最终造成磷脂合成不足，细胞膜结构不完整，提升细胞膜谷氨酸通透性。,所以，控制生物素含量能够改变细胞膜成份，进而改变膜透性、谷氨酸分泌和反馈调整。,表面活性剂对生物素有拮抗作用，阻断不饱和脂肪酸合成，使磷脂合成受阻。,青霉素直接作用在于抑制细胞壁合成。细胞膜失去细胞壁保护而发生继发性改变。,氨基酸发酵机制,第22页,2.,选育油酸缺点型：,不饱和脂肪酸是磷脂组成个别。选育油酸缺点型，阻断不饱和脂肪酸合成，并限制外源供给量，就可限制磷脂合成。,3.,选育甘油缺点型：,该菌株缺失,磷酸甘油脱氢酶，由磷酸二羟丙酮合成,磷酸甘油路径被阻断。,4.,选育温度敏感型突变株：,找到高温下细胞膜合成有缺损突变株。,5.,其它，如营养缺点型；药品抗性突变株；敏感型突变株等。表,5-5,，表,5-6,氨基酸发酵机制,第23页,第三节 赖氨酸发酵机制,一、行业介绍：,Lys,是人体所必需,8,种氨基酸之一，（,Thr Val Leu ILe Phe Met Lys try,，苏、颉、亮、异亮、苯丙、蛋、赖、色），,Lys,主要来自于动物蛋白质,。,发酵法赖氨酸生产最早起源于日本，我国,80,年代中期相继有赖氨酸发酵生产厂家。,80,年代赖氨酸食品曾经非常盛行。,此突变株高丝氨酸脱氢酶活性仅为野生株,1/30,，于是合成苏氨酸少，不足以与赖氨酸共同对天冬氨酸激酶活性产生协同反馈抑制作用，就能够过量积累赖氨酸。需要注意，活性很低高丝氨酸脱氢酶轻易受苏氨酸抑制和蛋氨酸阻遏，对应地造成苏氨酸或蛋氨酸缺乏，而抑制生长。,氨基酸发酵机制,第35页,切断支路代谢选育营养缺点型,诱变选育高丝氨酸缺点型（高丝氨酸脱氢酶缺失），切断通向苏氨酸、蛋氨酸代谢流，同时控制培养液中高丝氨酸（或苏氨酸蛋氨酸）量，降低苏氨酸浓度，解除赖氨酸苏氨酸对天冬氨酸激酶协同反馈抑制作用，从而过量积累赖氨酸。,氨基酸发酵机制,第36页,选育抗结构类似物突变株,经过诱变使编码天冬氨酸激酶结构基因发生突变，使天冬氨酸激酶对赖氨酸及其结构类似物（,S-2-,氨基乙基,-L-,半胱氨酸，,AEC,）不敏感，即使在过量苏氨酸存在时，该酶也不与赖氨酸或其结构类似物结合，但酶活性中心不变。,这种突变株遗传性地解除了终产物对本身合成路径酶调整控制，不受培养基中所要求物质浓度影响。,只有抗性菌株其赖氨酸产量不高，而含有抗性兼有营养缺点型菌株，赖氨酸产量大为提升。,氨基酸发酵机制,第37页,解除代谢互锁,在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸生物合成与亮氨酸生物合成之间存在代谢互锁。赖氨酸生物合成份支路径第一个酶,二氢吡啶二羧酸（,DDP,）合成酶合成受亮氨酸阻遏，使丙酮酸通向赖氨酸代谢受阻，而流向丙氨酸、缬氨酸。,解除这种代谢互锁方法有：选育亮氨酸缺点型菌株；选育抗亮氨酸结构类似物（,2,噻唑丙氨酸）突变株；选育对苯醌或喹啉衍生物敏感株（即亮氨酸渗漏缺点型菌株）。,氨基酸发酵机制,第38页,增加前体物合成和截断副产物生成：,增加天冬氨酸浓度，天冬氨酸激酶与底物亲和力协同性增大，能够抵消变构抑制剂影响，使前体物（丙酮酸、草酰乙酸、天冬氨酸等）充分地用于合成赖氨酸。增加前体物合成可采取方法有：,A.,选育丙氨酸缺点型；,B.,选育抗天冬氨酸结构类似物（天冬氨酸氧亏酸，,ASPHX,）突变株；,C.,选育适宜,CO2,固定酶,TCA,循环酶活性比突变株。,改进细胞膜透过机理,氨基酸发酵机制,第39页,选育温度敏感突变株：假如突变位置发生在为亮氨酸合成酶系编码基因中，使翻译出来酶对温度敏感，则高温时就不能合成亮氨酸，即成为亮氨酸缺点型，可解除代谢互锁。,有实用价值赖氨酸高产菌株多为营养缺点、敏感性、结构类似物抗性等性状双重、三重或多重标识突变株。,应用细胞工程和遗传工程育种,把依靠诱变技术取得优良特征经过重组,DNA,技术加以组合和应用。,氨基酸发酵机制,第40页,预防高产菌株回复突变,预防菌株回复突变至关主要。其方法除了经常进行菌种纯化、检验遗传标识、降低传代次数、不用发酵液作为种子外，还可采取以下方法：,A.,选育遗传性稳定菌株；,B.,定向赋加生产菌多个遗传标识。反抗性菌株，尽可能育成多重抗性，增加抗回复突变，使生产性能稳定；,C.,菌种培养和保藏时，培养基要丰富，尤其有足够要求营养物。反抗性菌株，应添加所耐类似物；,D.,在培养突变株时添加抗生素（如红霉素、氯霉素），抑制恢复突变株生长，使其到达分离纯化目标。,氨基酸发酵机制,第41页,第四节 芳香族氨基酸发酵机制,芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分子中都含有苯环结构，所以称作芳香族氨基酸。这三种氨基酸在结构上另一个共同点，是其直链都是丙氨酸。,氨基酸发酵机制,第42页,人体酪氨酸是由苯丙氨酸转化而得。苯丙氨酸、色氨酸是必需氨基酸，用作氨基酸输液。因为色氨酸是玉米中所缺乏氨基酸，故又用于饲料添加剂，另外，苯丙氨酸是二肽甜味剂原料。,氨基酸发酵机制,第43页,DAHP,合成酶（,DS,）,氨基酸发酵机制,第44页,分支酸变位酶（,CM,）,氨基酸发酵机制,第45页,芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成调整机制：,1,、,DAHP,合成酶（,DS,）：有三种同功酶，,DS1,受苯丙氨酸反馈控制，,DS2,受色氨酸反馈控制，,DS3,受酪氨酸反馈控制。图,5-21,酶,1,。,2,、分支酸变位酶（,CM,）：有两种同功酶，,CM1,受苯丙氨酸反馈控制，,CM2,受酪氨酸反馈控制。图,5-21,酶,13,。,氨基酸发酵机制,第46页,第四节 分枝氨基酸,分枝链氨基酸（异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸）：有甲基侧链。,图,5,25,分支链氨基酸生物合成路径,P94,氨基酸发酵机制,第47页,第四节 精氨酸发酵机制,精氨酸族氨基酸（鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸）：以谷氨酸为前体。,鸟氨酸,瓜氨酸,氨基酸发酵机制,第48页,精氨酸是含有胍基碱性氨基酸，它和组氨酸一起，称为半必需氨基酸，在幼小动物营养上，有主要价值。瓜氨酸是西瓜和柿子中游离氨基酸。鸟氨酸以肽形式，存在于细菌中。在医药上，除作试剂和输液以外，通常，精氨酸和鸟氨酸一起，用作保肝、强身、解毒剂之类药剂原料。瓜氨酸有利尿作用。,氨基酸发酵机制,第49页,瓜氨酸,+,可由转氨基,作用提供,*,天冬氨酸,精氨酸代琥珀酸合成酶,Mg,2+,ATP,AMP+PPi,精氨酸代琥珀酸,精氨酸合成,氨基酸发酵机制,第50页,精氨酸代琥珀酸裂解酶,精氨酸,+,延胡索酸,氨基酸发酵机制,第51页,氨基酸发酵机制小结,1,、掌握谷氨酸生物合成路径及调整机制。,2,、了解赖氨酸生物合成路径及调整机制。,3,、了解芳香氨基酸、分支氨基酸及精氨酸生物合成路径,。,氨基酸发酵机制,第52页,思索题,1,、柠檬酸发酵过程中有哪几个控制关键点，怎样控制？,2,、简述二氧化碳固定反应对于提升柠檬酸产率意义。,3,、写出谷氨酸发酵最理想路径，说明,CO2,固定化反应主要性。,4,、谷氨酸产生菌之所以能够合成、积累并分泌大量,GA,，其菌种内在原因有哪些？,5,、谷氨酸发酵过程中，生物素（,VH,）作用表现在那几个方面？,氨基酸发酵机制,第53页,