苯硫脲尝味遗传大实验.pptx

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,www.,*,单击此处编辑母版标题样式,LOGO,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,www.,苯硫脲尝味的遗传学调查,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第1页,遗传学大试验注意事项,1,试验每一步都要详细地统计操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询。,2,对任何自己不熟悉试验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器）。在操作过程中发觉任何意外现象都要及时向任课教师汇报。,3,在试验过程中制造任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己桌面一角），禁止随地投弃！尤其注意对废弃细菌杀灭和有毒垃圾定点投放。,4.,试验结束后要把用过器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开试验室。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第2页,1.,试验目标,（,1,）测定人群中,PTC,尝味基因表现型和基因型，了解孟德尔遗传基因型与表现型对应关系。,（,2,）了解酶切扩增多态序列（,cleaved amplified polymorphic sequence,，,CAPS,）,（又称为,PCR-RFLP,）技术原理，学会用,CAPS,技术检测单核苷酸多态性,（,SNPs,）。在分子水平上测定,PTC,尝味基因型。,（,3,）计算群体中,PTC,尝味基因频率，判断群体是否到达,Hardy-weiberg,平衡。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第3页,2.,试验原理,2.1,苯硫脲尝味遗传形式,苯硫脲（,phenylthiocarbamide,，,PTC,）是硫脲 苯基衍生物（图,2.1,），为白色结晶粉末，因含有硫代酰胺基（,N-C=S,）官能团而有苦涩味。能尝,1/750,0001/50,000 PTC,浓度溶液味道人（苦涩味，少数人感到甜味）称为苯硫脲“尝味者（,taster,）”；只能尝出,PTC,浓度大于,1/24,000,溶液味道（甚至对,PTC,结晶物也尝不出苦味）人称为苯硫脲“味盲者（,nontaster,）”。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第4页,PTC,尝味能力是受单基因控制孟德尔遗传性状，是由位于,7,号染色体上（,7q35-7q36,）一个苦味味觉感受器基因,TAS2R38,决定，属于常染色体不完全显性遗传。尝味者中显性基因,T,纯合子,(TT),能尝出,1,750,000 1,6,000,000,PTC,溶液苦味，杂合子,(Tt),只能尝出,1,480,000,l,380,000,PTC,溶液苦味。所以能够利用对,PTC,尝味能力测定家族中基因传递和人群中基因频率。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第5页,2.2,人类苯硫脲尝味基因,人类,PTC,尝味基因,Homo sapiens taste receptor,type 2,member38(TAS2R38)(NM_176817),，又名,PTC,、,T2R38,或,T2R61,。绝大多数尝味者与味盲者区分在于三处单核苷酸多态性（,single nucleotide polymorphisms,，,SNPs),：,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第6页,第一处：,145,位，味盲者为,G145,（编码丙氨酸,ala,），尝味者为,C145,（编码脯氨酸,pro,）；,第二处：,785,位，味盲者为,T785,（编码缬氨酸,val,），尝味者为,C785,（编码丙氨酸,ala,）；,第三处：,886,位，味盲者为,A886,（编码异亮氨酸,ile,），尝味者为,G886,（码缬氨酸,val,）。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第7页,所以味盲者,PTC,多肽中三处对应氨基酸分别是,ala49,、,val262,和,ile262,，被称为,AVI,等位基因，而尝味者三处是,pro49,、,ala262,和,val262,，被称为,PAV,等位基因（图,2.2,，,2.3,）。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第8页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第9页,图,2.2,味盲者,PTC,尝味基因编码区（,CDS,）序列,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第10页,图,2.3,味盲者,PTC,多肽,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第11页,味盲者,PTC,编码区有五个限制性内切,Fnu,4H1,识别位点（识别序列,5-GCNGC-3,），假如是尝味者，则其第,785,位,SNP,恰好形成了一个额外,Fnu,4H1,识别位（,GCTGC,）。所以能够利用这个,SNP,造成限制性位点多态性，设计引物扩增包含,785,位,SNP,位点,PTC,基因编码区一部分，然后用,Fnu,4H1,切割扩增产物，依据是否能把扩增产物切开而判定是某个人单倍型（,haplotype,）。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第12页,4.,试验步骤,（,1,）讲解试验目标、试验原理、试验技术路线。,（,2,）讲解口腔上皮细胞总,DNA,快速提取、基因,PCR,扩增、,DNA,电泳、,PCR,产物纯化、,DNA,酶切、遗传学分析等试验方法及注意事项。,（,3,）讲解高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、电泳仪、水平电泳槽、涡旋振荡器、磁力搅拌器、电子天平、,PCR,仪、微波炉、紫外分光光度计、电磁炉、恒温水浴锅、恒温干热议、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、通风橱、恒温振荡摇床、,37,培养箱、,pH,计、微量移液器、冰箱、,-80,超低温冰箱等主要仪器设备以及必须电脑软件使用方法、注意事项；,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第13页,4.2.1,试验材料,4.2.1.1,主要仪器设备,高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净工作台、恒温水浴锅、冰箱。,洁净、经,121,高压灭菌,20min,容量瓶、量筒、烧杯、螺口试剂瓶，一次,性医用无菌,PE,手套、乳胶手套、塑料滴管，一次性纸杯，记号笔。,4.2 PTC,尝味能力测定,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第14页,4.2.1.2,试剂和材料,（,1,）材料：受试者为全体修读遗传学大试验学生。,（,2,）试剂：苯硫脲（,PTC,）结晶，娃哈哈纯净水。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第15页,4.2.1.3,溶液配制,（,1,）原液（,1,号液）：称取,PTC,结晶,0.65 g,，加娃哈哈纯净水,500 ml,，在室温,(20,左右,),下溶解,l2d,（经常摇摆）（或,60,水浴中,1 h,充分溶解），,PTC,浓度约为,1,750,，过滤灭菌。,（,2,）稀释液：用娃哈哈纯净水逐层稀释原液,214,倍，编为,2-14,号（表,4.1,）。将配好,14,种浓度,PTC,溶液，过滤灭菌，分别置于灭菌过,100 ml,螺口试剂瓶中。另取娃哈哈纯净水作为第,15,号液。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第16页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第17页,4.2.2,试验方法,（,1,）让受试者正坐，仰头张嘴伸舌，用滴管滴,2,3,滴,15,号液于受试者舌根部，让受试者慢慢咽下重复咂嘴品味液体尝味，然后用纯净水做一样试验，交替给,受试者尝味，防止受试者臆意猜测而影响结果准确。,（,2,）问询受试者能否判别此两种溶液味道。,（,3,）若不能判别或判别不准，则依次用,141,号溶液 重复试验，直到能明确判别出,PTC,苦味为止。,（,4,）复尝味,3,次，,3,次结果相同时，才是可靠。,（,5,）统计所品出苦味液体编号和稀释浓度。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第18页,注：统计民族、生源地是想调查,PTC,味盲分布与民族和地理位置是否有相关性。（此生源地统计不是受试者户籍所在地，而是其家族或家庭组员长久生活地方）,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第19页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第20页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第21页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第22页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第23页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第24页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第25页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第26页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第27页,4.3,人口腔上皮细胞总,DNA,提取,4.3.1,试验材料,4.3.1.1,主要仪器设备,高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净,工作台、恒温水浴锅、涡旋振荡器、高速离心机、,恒温振荡摇床、微量移液器、电磁炉、冰箱、,-80,超低温冰箱、计时器、,pH,计。洁净、经,121,高压灭菌,20min,量筒、烧杯、螺口试剂,瓶、牙签、,1.5 mL,灭菌微量离心管、微量移液器,吸头（枪头），离心管架，一次性医用无菌,PE,手套、乳胶手套、口罩，记号笔。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第28页,4.3,人口腔上皮细胞总,DNA,提取,4.3.1.2 试剂和材料,（1）材料：每试验小组选取 1 名受试者，用灭,菌牙签刮取口腔上皮细胞。,（2）试剂：灭菌水，pH 标准液，细胞基因组,DNA 提取试剂盒,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第29页,4.3,人口腔上皮细胞总,DNA,提取,4.3.2 试验方法,（1）在 1.5 ml 灭菌微量离心管中加入 100 L,灭菌水。,（2）受试者用无菌牙签轻刮口腔腮内侧，刮下来,细胞在灭菌水中漂洗。,（3）涡旋振荡器涡旋振荡混匀 10 s，,（4）离心机瞬时离心 10 s。,（5）沸水浴中煮沸 5 min。,（6）离心机 13200rpm 离心 2 min。,（7）基因组 DNA 4C 保留备,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第30页,4.5 PTC 基因PCR扩增产物电泳检测,4.5.1.主要仪器设备,高速离心机、小型瞬时离心机、电泳仪、水平电泳槽、电子天平、微波炉、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、通风橱、微量移液器、冰箱、-80超低温冰箱。,洁净、经121高压灭菌20min、微量移液器吸头（枪头），离心管架，PCR管架，三角瓶，一次性医用无菌 PE手套，记号笔，保鲜袋，微波炉用手套，三角瓶，搪瓷盘。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第31页,4.5.2.试剂和材料,（1）材料：受试者PTC 基因PCR 产物,（2）试剂：Tris 碱，冰乙酸，Na,2,EDTA.2H,2,O,溴化乙锭，琼脂糖，Marker I,4.5.3.溶液配制,（1）50 TAE 电泳缓冲液（储存液，pH约8.5）：Tris 碱 242g，57.1ml 冰乙酸，37.2g Na,2,EDTA.2H,2,O，去离子水定容至1L,（2）1 TAE 电泳缓冲液（工作液）：取50TAE 电泳缓冲液，去离子水稀释50倍,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第32页,(3）0.5mg/ml 溴化乙锭（EB）（1000 储存液）：50mg 溴化乙锭溶于100mL dd water，4C 避光储存）。(4)溴化乙锭（EB）工作液：0.5mg/ml EB（1000 储存液），去离子水稀释 1000倍。（注：EB为扁平分子，能够嵌入DNA，为潜在诱变剂，接触时须带一次性医用无菌PE手套，但也不是洪水猛兽，不小心溅到皮肤上时，不会被皮肤吸收只是停留在表面，用大量流水冲洗即可）。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第33页,（1）配制 1.2%琼脂糖凝胶：称取 0.6g 琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml 1 TAE电泳缓冲液，放入微波炉中加热，并不停取出混匀，注意观察烧瓶中琼脂糖粉末，直至完全熔解（烫，戴手套）。50ml 恰好倒一块大胶（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。（2）将胶液置桌面上室温冷却致热但不烫手（约50-60）。,4.5.2,试验方法,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第34页,（3）把梳子插到凝胶灌制模具正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具矮边缘相平即可。在桌面上静置10-20 分钟待胶完全凝固.（剩下胶溶液封口后留待以后再熔化使用），小心拔出梳子，凝胶没入电泳槽电泳液中，凝胶上有样品孔一侧要朝向电泳槽负极。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第35页,（4）取 1 片光面纸，点 5,u,L 灭菌水、2,u,L 6,加样缓冲液，再加入 5,u,L PCR 产物制成10,u,L DNA 样品。,（5）在凝胶上选择相邻加样孔。用10,u,l 吸液头,分别依次加入5,u,L Marker I,对照，各小组12,u,L PCR 产物电泳样品（相互比较）,（6）依据电泳槽长度把电泳仪电压调至120V,(10V/cm)，电泳2030min。（注意正负电极位置连,接正确）。,（7）把凝胶小心放入盛有 EB搪瓷盘中，染色 10分钟,后，取出用自来水浸泡10min。,（8）放入凝胶成像系统中拍照。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第36页,4.6.1,试验材料,4.6.1.1,主要仪器设备,高压蒸气灭菌锅、高速离心机、小型瞬时离心机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、恒温水浴锅、恒温干热议、制冰机、紫外分光光度计、微量移液器、冰箱、,-80,超低温冰箱。,洁净、经,121,高压灭菌,20min,1.5 mL,灭菌微量离心管、微量移液器吸头（枪头），离心管架，一次性医用无菌,PE,手套，塑料饭盒，记号笔。,4.6 PTC,基因,PCR,产物酶切,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第37页,4.6.1.2,试剂和材料,（,1,）材料：受试者,PTC,基因,PCR,产物,（,2,）试剂：限制性内切酶,Fnu,4H1,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第38页,4.6.2,试验方法,（,1,）提前,2 h,将恒温水浴锅或恒温干热仪,(,或恒温水浴锅,),电源打开，调整工作温度稳定至,37 C,。,（,2,）从制冰机中盛取碎冰（,0C,），从冰箱中取出所需试剂，在碎冰中解冻,（,3,）将试剂在涡旋振荡器上涡旋振荡混匀,10 s,（,4,）瞬时离心,10 s,。,（,5,）取,1L,受试者,PTC,基因纯化,DNA,，用紫外分光光度计测定其,260nm,、,280nm,下紫外吸光光度值，进行,DNA,定量分析。,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第39页,（,6,）在碎冰上按照配方和次序在,1.5 mL,微量离心管中配制酶切缓冲液（为保持酶活性及,DNA,切割效率，一直在低温下配制）：,灭菌超纯水 补足,15L,10,酶切缓冲液,1.5L,5 units/L,Fnu,4H1 1L,PTC,基因纯化,DNA 1g,（依据,DNA,定量结果加入适当体积溶液）,总体积,15L,（,7,）,37C,恒温酶切过夜,（,8,）酶切产物,4C,保留备用,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第40页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第41页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第42页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第43页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第44页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第45页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第46页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第47页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第48页,苯硫脲尝味遗传大实验专家讲座,第49页,