实时荧光定量PCR一般流程.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,*,Date,|,AB CONFIDENTIAL,Step,One,and,Step,One,Plus,Real-Time PCR Systems,2006 Applied,Biosystems,LU Yang,Application Specialist,Gene Company Ltd,实时荧光定量,PCR,一般流程,内容,实验目的,实验方案,实验关键,实验试剂耗材,实验目的,实验方案,实验关键,实验试剂耗材,未知样品中目的基因绝对量：,绝对定量,比较不同样品中目的基因相对表达量：,相对定量,检测未知样品基因型：,SNP,分析,检测未知样品中某种成分的存在与否：,存在,/,不存在分析,实验应用目的,不同实验应用，实验准备不同,未知样品中目的基因绝对量,标准品：,已知确切浓度，分子结构和目的基因类似,梯度稀释：,至少,5,个浓度梯度，必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围,样品重复：,每一个梯度最好,3,个重复，保证统计学意义,标准曲线：,斜率和标准差必须要符合数学意义,不同实验应用，实验准备不同,比较不同样品中目的基因相对表达量,内参基因：用于数据均一化,扩增效率比较：,比较内参基因和目的基因的扩增效率，以确定相对定量的不同定量模式,Slope 0.1,，,使用相对标准曲线法,Slope 0.1,，,使用相对标准曲线法,标准品：内参基因和目的基因，不需知道样品确切浓度,浓度梯度：,至少,5,个浓度梯度，必须覆盖未知样本目的片段所有可能量的范围,样品重复：,每一个梯度最好,3,个重复，保证统计学意义,标准曲线：,斜率和标准差必须要符合数学意义,不同实验应用，实验准备不同,比较不同样品中目的基因相对表达量,Slope0.1,，,使用比较,C,T,值法,内参基因：数据均一化,数学公式：,2,CT,不同实验应用，实验准备不同,检测未知样品基因型,荧光探针：两种不同标记，不用两种不同基因型检测,不同荧光表明基因型的不同,不同实验应用，实验准备不同,检测未知样品中某种成分的存在与否,IPC,：阳性对照，检验反应体系工作与否,目的基因探针：荧光信号有无判断存在与否,实验目的,实验方案,实验关键,实验试剂耗材,实验应用方案：基本流程,目的基因（,DNA,和,mRNA,）的查找和比对,GeneBank,或者文献查找,实验应用方案,引物和探针设计,遵循引物设计的一般规则，特别是多重反应的应用,根据自身情况确定荧光探针的种类,遵循所选探针设计的一般规则,BLAST,比对确认引物特异性,实验应用方案,荧光报告基因的选择,根据自身仪器的性能,根据自身实验条件,尽可能选择相对成熟的荧光报告基团：,FAM,，,VIC,等,选择高品质引物探针合成商,实验应用方案,标准品制备（标准曲线法）,新鲜标准品,遵循所有标准品制备原则,实验应用方案,退火温度,热启动,引物浓度,引物和探针的纯度,镁离子浓度,模板质量,模板浓度,UNG,处理,实验应用方案,PCR,反应体系优化,通常以,3,15,循环的荧光值作为阈值，也可以以阴性对照荧光值的最,高点作为基线,具体实验可以调整,实验应用方案,基线和阈值调节,软件给出标准曲线和未知样品中起始模板的量：绝对定量,通过得到的,C,T,，,套用现成公式进行定量：相对定量,根据软件荧光图谱，判断基因型或者存在,/,不存在,实验应用方案,数据分析,退火温度,热启动,引物浓度,引物和探针的纯度,镁离子浓度,模板质量,模板浓度,UNG,处理,实验应用方案,PCR,反应体系优化,退火温度,热启动,引物浓度,引物和探针的纯度,镁离子浓度,模板质量,模板浓度,UNG,处理,实验应用方案,PCR,反应体系优化,实验目的,实验方案,实验关键,实验试剂耗材,实验应用关键,标准品制备和标准曲线制作,重复样品,PCR,反应体系的优化,荧光基团的正确选择,实验目的,实验方案,实验关键,实验试剂耗材,实验应用试剂耗材,根据自己应用目的选择相应的试剂,选择高质量的试剂耗材供应商,使用配套的试剂盒,使用正确的耗材和试剂：,StepOne,为,0.1ml,光学反应管,Thank you!,