HPV培训课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,HPV,分型检测在宫颈疾病检查中的应用及亚能,HPV,基因,分型检测,HPV,发展进程,70,年代德国人哈拉尔德,楚尔,豪森提出,人乳头瘤病毒与宫颈癌有关系,1995,年国际癌症学会确定：人乳头瘤,病毒是宫颈癌的主要病因。,2008,年,10,月,6,号哈拉尔德,楚尔,豪森获,得诺贝尔奖。,宫颈癌生物学病因研究的进程,子宫颈癌,唯一病因明确,唯一可以早期发现和治疗,唯一可望消灭,HPV,感染，特别是高危性、持续性感染引起子宫颈癌前病变，子宫颈上皮内瘤变，,CIN,和宫颈癌,预防,HPV,感染就可以预防宫颈癌,没有,HPV,感染就可以不罹患宫颈癌,我国宫颈癌流行现状,我国妇女患宫颈癌的比例,15/10,万，是仅次于智利的宫颈癌高发国家,目前患者约,40,万，每年新增,15,万，据女性生殖道肿瘤首位,我国的宫颈癌死亡率为,11.34%,，据女性癌症死亡率第二位，特别在西部地区，宫颈癌居女性癌症死亡率之首,我国已婚女性,HPV,感染率在,10%,左右。我国需惊醒宫颈癌相关筛查的适龄女性，,不少于,1,亿,HPV,病毒学基础知识,小,环状双,链,DNA,病毒,2.,直径,50-55nm,3.,癌基因,E6E7,14,66,低危型,HPV,高危型,HPV,HPV16,L1:,主要衣壳蛋白，是疫苗的主要成分,L2:,次要衣壳蛋白，是市售抗体的主要识别位点,E4,：结合并破坏细胞角蛋白网，形成挖空细胞的外观,E2,：负性调节,E6,和,E7,，维持凋亡和细胞周期的调控。,通常在病毒发生整合（病毒整合时会破坏,E2,基因的结构）时失活,HPV,的主要致癌基因,E6,通过抑制,p53,而阻断凋亡,E7,通过抑制,pRB,使细胞周期失控,X,生殖道,HPV,感染,高危型,HPV,感染通常没有症状，为一过性并可自愈。,90%,以上的病人两年内可痊愈。,常见,其他,亚型,继发或并发感染,多重,HPV,亚型感染极为常见,自然免疫力差,感染后只有,50%-60%,的女性产,生抗,HPV,抗体，因此,对同种基因型的,HPV,可再度,感染！,E6&E7,E2,良性湿疣,在上皮分化的终末阶段,L1&L2,开始表达，并组装形成病毒衣壳,最后完整的病毒颗粒从细胞内释放出来,大量,E4,聚集溶解细胞骨架蛋白 呈现挖空细胞的外观,低水平,表达，以维持病毒基因组和细胞的生长,负,性调节,E6&E7,保持,细胞的,分,化,和成熟,确保,能够,产生,完整,的病毒,颗,粒,一过性,HPV,感染,E6&E7,在细胞发生恶变时,丧失分化的能力,不同程度的 细胞不成熟性,DNA,多倍体的出现 核的非典型性,持续的增生能力 分裂相增多,高级别,CIN,蛋白表达水平增高,凋亡被阻断、细胞周期失控,细胞开始发生恶变,在病毒整合时被破坏,持 续 性,HPV,感 染,E2,宫颈癌防治现状,宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，也是严重影响,妇女身心健康，威胁妇女生命的重要原因之一。,流行病学的调查显示，从,50,年代以来，由于子宫,颈细胞学的广泛应用，全球子宫颈癌的发病率明显下降，但在发展中国家仍居妇科恶性肿瘤首位调查数字显示：,我国,25,岁以上的妇女中，有超过,70,的人,数从未做过宫颈防癌检查！,筛 查 的 重 要 性,宫颈癌筛查不只是医师行为，更是政府的职责，是艰难的,系统工程,我国目前不可能做到像美国、澳大利亚那样建立规范化的,筛查制度,可以根据各地情况做区域性筛查，定点筛查，机会性筛查,所有到妇产科门诊就诊者和各种体检者，都应做子,宫颈细胞学检查,/HPV,检查，这需要妇产科医生的工,作之一,高危人群者更应行定期的检查和随诊,筛查的目的是,识别和检出子宫颈癌前病变，而不是子宫颈癌,；,子宫颈癌多半有症状，是及时诊断问题,子宫颈癌在癌前病变未被诊断，是没有进行检查和筛查：,1/4,患者从未进行细胞学检查,1/4,患者子宫颈癌前,5,年未进行细胞学检查,筛查的准确性取决于：,筛查方法的敏感性、特异性,细胞学和,HPV,检查质量,子宫颈癌合并妊娠，是非常棘手的妊娠合并症。,准备怀孕时仍要按照规范进行定期的细胞学检查。,如孕前有高危因素，建议孕期及产,后定期做宫颈细胞学检查。,怀孕过程中若出现异常症状至医院,就诊，由医生根据情况决定是,否进行细胞学检查以及如,何处理。,妊 娠 期 也 应 进 行 宫 颈 癌 筛 查,筛 查 应 从 何 时 开 始？,性生活开始后,3,年左右,不晚于,21,岁,Practice Guidelines in Oncology,2004,NCCN,何 时 终 止 筛 查？,年龄,70,岁，在,10,年内已有,3,次以上之满意的细胞学检查,正常者，可停止筛查。,但若无上述筛查历史，或有不正常者，则建议继续筛,查。有宫颈癌历史、雌激素暴露、免疫功能障碍,（,HIV,），应继续长期筛查。,Practice Guidelines in Oncology,2004,NCCN,筛 查 的 时 间 间 隔,传统细胞涂片检查 每年一次,TCT,每2年一次,30岁以后，连续3次正常者，每2,-3,年一次,FDA,批准,HPV DNA,检测用于30岁以上的妇女联合细胞学检查,同时使用,细胞学和,HPV DNA,检测同时为阴性，筛查间隔可以,3年一次,注意对,HPV,感染的评估,Practice Guidelines in Oncology,2004,NCCN,HPV,检 测 应 用 于 宫 颈 癌 筛 查,HPV,病毒的发现,明确高危型,HPV,病毒持续感染为宫颈癌治病因,高危型,HPV,感染通常为一过性感染并,可自行清除,但如自身免疫力较差，则会造成持续感染,不同地区人群的宫颈癌患者中感染的,HPV,型别,不同,不同,HPV,型别致病类型及强弱不同,HPV,检 测 的 临 床 应 用,细胞学结果为,ASC,的病例管理,宫颈病变手术的术后随访,与细胞学联合，应用于,30,岁以上,女性的宫颈癌筛查,指导,HPV,疫苗的使用（两种疫苗：,4,价、,2,价疫苗针对,16/18,）,现有的,HPV,疫苗只能对,HPV16,、,18,、,6,、,11,型这四种型别的,感染进行预防，且都以国外的研究数据进行研发,对于中国女性的,HPV,感染型别的研究，有助于研发适合于,中国女性的,HPV,疫苗,美国,ASCCP 2006,年版,HPV,（,+,）及细胞学正常,HPV 16/18(+),其他高危型阳性,阴道镜,重复细胞学和,HPV,检测,（间隔,12,个月）,两者均阴性,细胞学阴性,HPV,（,+,）,阴道镜,细胞学异常,HPV,（,）,参照,ASCCP,指南,常规筛查,（,3,年后）,美国,ASCCP,：,30,岁妇女的宫颈筛查中联合筛查更为重要,HPV(-),TCT(-),HPV(+),1,年重复,TCT,和,HPV,检查,都为,(-),TCT(-)HPV(+),TCT(+),不管,HPV,是否正常,3,年常规筛查,阴道镜,3,年常规筛查,TCT,结果为,ASCUS,及其以上病变,按,ASCCP,指南处理,TCT,与,HPV,检测的联合应用于宫颈癌筛查,TCT与HPV检测联合,使用几乎可以,100%,防止漏诊，,同时也可监测HPV感染,的,转归,现有,HPV,疫苗仅针对四种型别,HPV,病毒的感染，更多的,HPV,型别感染仍需通过定期的联合筛查来防治,临床处理仍需遵循,TBS诊断结果和三阶梯诊治流程,TCT联合HPV检测有助于宫颈病变的个,体化处理,美国,ACOG,2009,年版,2009,年,11,月,20,日,美国妇产科大学（,ACOG,）发表关于宫颈癌筛查的最新指南意见,对于,30,岁以上的妇女，最佳的筛查方式是同时进行细胞学筛查（,TCT,）和宫颈,HPV,DNA检测,如果两项结果都正常，属于宫颈癌的低危人群，筛查的间隔最好在三年以上,HPV,分 型 检 测,分,型才能区分持续或,反复感染,分,型才能区分单一和多重感染 后者危险更,大,不,同型别不同的患病风险 致病性,差异,不,同型别不同的处理,方案,相同细胞及组织学类型,HPV,阳性与阴性要区别对待,不同,HPV,感染型别要区别对待,根据,ASCCP,指南，细胞学阳性，,HPV16,、,18,阳性可选择阴道镜检,不,同型别不同的致病,类,不,同型别转归和愈后不同,Pap,阴性,HPV,阳性,HPV,阴性,三年内复检双相检查,16/18,基因分型,阳性,阴性,阴道镜检查,一年内复检双相检查,*,美国,ASCCP2006,版,HPV,分,型检测应用（,1,）,-,筛查,WHO,建议,HPV-DNA,检测不能用于,30,岁以下的女性。,HPV DNA,检测虽然对,HPV,很敏感，但是并不能预测它的病程和发展，,要预测高危,HPV,是否,可,致癌，需要作,基因分型测试,虽然,复查显示同型,HPV,阳性，,但,不能,预,料,这个,女性,的宫颈,疾,病病程,。,仅增,加,了危险性,23 890(,筛查人数,),细胞学,(-),HPV(-),21 409,细胞学,(+),HPV(-),488,细胞学,(-),HPV(+),370,细胞学,(+),HPV(+),523,阴道镜检查,533,无病例,发现,发现,3,例,发现,59,例,发现,114,例,HPV,分,型检测应用（,1,）,-,筛查,北美和欧洲的筛查研究显示，在,35,岁的,女性人群中，,HPV,试验检测,CIN2,病变的,敏感性和特异性分别为,95%,和,93%,。,细胞学检查发现,ASCUS,的敏感性和特异,性分别为,60%,和,97%,联合使用,HPV,检测和细胞学检查的敏感性,比单独使用任何一种都显著提高，阴性预,测值达,99%-100%,HPV,分型检测应用（,1,）,-,筛查,HPV,分型检测应用（,2,）,-,阴道镜,适应征,30,妇女，细胞学未见上皮内病变和恶性细胞，,HPV16,，,18,建议阴道镜。,2006 consensus guidelines for management of women with abnormal cervical cancer screening tests www.AJOG.ORG,Pap,阴性,HPV,阳性,HPV,阴性,三年内复检双相检查,16/18,基因分型,阳性,阴性,阴道镜检查,一年内复检双相检查,波特兰的一项研究表明，,30,岁细胞学阴性的女,性中，,HPV16,或,18,阳性的女性在,10,年随访中出,现,CIN3,的比率分别为,21%,和,18%,。与此相比，,其他高危型,HPV,阳性的女性中，,CIN3,的风,险性仅,1.5%,。,HPV,分型检测应用（,2,）,阴道镜,适应征,Plummer et al,10058,例宫颈癌，,8550,宫颈鳞癌,，,1508,宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌,HPV16,感染与宫颈癌的相关具有普遍意义,宫颈,鳞癌,：,HPV16,占,46-63%,；,HPV18,占,10-14%,宫颈,腺癌和宫颈腺鳞癌,：,HPV18,占,37-41%,；,HPV16,占,26-36%,。,HPV,分型检测应用（,2,）,阴道镜,适应征,CIN23,HR-HPV:94.0%,常见亚型,：,HPV16,、,33,、,58,、,31,和,52,型,Logistic Regression,分析,：,HPV16,、,33,和,31,与,CIN23,相关，是主要致病型,国家十五科研攻关项目,HPV,分型检测应用（,2,）,阴道镜适应征,四,种,HPV,亚型在,30,岁妇女宫颈癌筛查中的作用,HPV16,亚型在,30,岁妇女宫颈癌筛查中的作用,2009,年（,ASCCP,）最新,HPV,检测指南,HPV,阳性及细胞学正常,HPV 16/18(+),其他高危型阳性,阴道镜,重复细胞学和,HPV,检测,（间隔,12,个月）,两者均阴性,细胞学阴性,HPV,（,+,）,阴道镜,细胞学异常,HPV,（,）,参照,ASCCP,指南,常规筛查,（,3,年后）,HPV,分型检测应用（,3,）,-ASCUS,分层,ASC,病例的管理,(2006ASCCP),大于,20,岁人群,6,个月后重复细胞学检查,高危,型,HPV,检测（可以用残留的液基做）,阴道镜检查,（,40-60%,）,2006 consensus guidelines for management of women with,abnormal,cervical cancer screening tests www.AJOG.ORG,HPV,分型检测应用（,3,）,-ASCUS,分层,316,例,ASCUS,患者中,CIN,级以上的阳性检出率为,18.99%,（,60,316,）,宫颈,细胞学诊断为,ASCUS,中,HR-HPV,阳性率,为,68.99,%,（,218,316,），,ASCUS,组中,HR-HPV,阳性患者,CIN,级,以上,宫颈,病变的检出率高于,HPV,阴性者，,差,异,有统计学意义（,P0.001,）,HPV,分型检测应用（,4,）,-,绝经期妇女,LSIL,2006,consensus guidelines for management of women with,abnormal,cervical cancer screening tests www.AJOG.ORG,“reflex”HPV,检测,6,和,12,个月时细胞学,阴道镜,HPV,阴性,或,阴道镜未发现,CIN,12,个月时细胞学,是推荐的,HPV,阳性,或,细胞学,ASC-US,阴道镜是推荐的,HPV,阴性或,连续,2,次细胞学“阴性”,常规细胞学筛查是推荐的,消融或切除治疗,CIN,失败的比率在,1%25%,之间。系统性的综述表明，不同方法的整体失败率为,5%15%,，不同方法间无显著差异。大多数失败发生在治疗,2,年后。,一个系统性综述报道，在治疗后,20,年内女性浸润癌的罹患率约,10,万分之,56,，高于美国普通人群（,5.6,每,10,万人年）,。,HPV,分型检测应用（,5,）,-,宫颈病变的随访,治疗后随访中应用,HPV DNA,检测的系统性综述,表明，其性能优于细胞学随访方法。,治疗后,6,个月,HPV,检测鉴别复发,/,持续性,CIN,的敏感,性达,90%,，而且保持这种水平到,24,个月。与,此相比，细胞学的敏感性大约为,70%,。,一些研究（不是所有研究）中，联合使,用,HPV,检测和细胞学可以增加敏感性。,HPV,分型检测应用（,5,）,-,宫颈病变的随访,对细胞学,ASC-US,、,ASC-H,或,LSIL,的,CIN1,推荐的管理方案是，,12,个月时,HPV DNA,检测,或,6,个月、,12,个月时重复细胞学检测,对,CIN2,、,3,女性治疗后的管理方法包括,6-12,个月时进,行,HPV DNA,检测、,单独,6,个月采用细胞学或联合使用,细胞学和阴道镜,HPV,分型检测应用（,5,）,-,宫颈病变的随访,AIS,的管理方案,6,个月时联合使用,细胞学,HPV,检测,宫颈管采样,阴道镜,HPV,分型检测应用（,5,）,-,宫颈病变的随访,HPV,分型检测应用（,6,）,-,指导疫苗的使用,疫苗是,模拟,HPV16/18,的,L1,蛋白衣壳,（一种病毒样颗粒,-,病毒脂蛋白）,给,HPV,阴性的女性接种这两种疫苗后，有,90%,以上的人不,会产生由,HPV16/18,型引起的癌前病变,到目前为止，这种高浓度，长效抗,HPV,持续感染的预,防疫苗才开展了六年,如果接受预防者在接种时已经,HPV16/18,阳性，,是否有治疗作用,尚未明了,下生殖道,HPV,感染的干预治疗,HPV,的感染是非系统性感染，,只局限于最初的感染的部位，,感染部位的局部细胞因子和非特异性的效应细胞，如单核细胞、巨噬细胞和,NK,细胞是阻止感染的第一道防线。,宣讲,相关知识，调动患者免疫功能,增强,生殖道局部免疫力，可加速对,HPV,的清除,用,避孕套控制,HPV,在性伴间传播是有效和必要的,HPV,是人类癌瘤发病中唯一可以完全确认的致癌病毒。现今的研究甚至可以证实：,预防,HPV,感染就可以预防宫颈癌，,没有,HPV,感染就可以不罹患宫颈癌。,HPV DNA,检测常用技术,HPV,DNA,检 测 技 术,常用,方法：,其他,方法：,普通,PCR,，原位杂交，,SPR,，,DNA,测序,等,基因,芯片技术,二代杂交捕获,荧光定量,PCR,(,一,),基因芯片技术,玻璃芯片,膜芯片,流式荧光杂交法（液态芯片）,固相芯片,玻璃芯片与膜芯片（固相芯片）,玻璃,芯片,应用,领域,：,主要,用于,科研,领域，如,基因表达谱分析、基因多态性分析,、大,规模,序列分析、药物筛选、基因诊断的研究,等,目前,仅极少数用于,临床检验,等领域,局限,：制作工艺相对复杂,信号检测,需专门的仪器设备（激光扫描仪）,阅读,设备的成本局限（费用高昂）,应用领域,：,高密度,芯片,目前仍主要用于,科研,领域,低,密度芯片,已经用于,临床检验,领域,低密度芯片的,特点：,工艺,相对简便,信号检测,简便,投入,费用较低,现状,：,目前临床检测中，往往还不需要使用到大规模探针阵列,，,从,实用性、使用,成本、方便性,等,角度考虑，,低密度,芯片,（,十几个至几十个探针）更易于被接受,膜芯片,亚能,HPV,基因芯片检测系统,PCR,扩增结合,DNA,反向点杂交技术灵敏度更高,实验室设置及操作流程应当符和规范,PCR,的检测结果是可靠的,检测通量大，可同时检测,15,种,HPV,亚型，包括,13,种高危型,探针设计，特异性强,膜条显示检测结果，读取更方便,采用,dUTP-UNG,防污染体系，有效避免假阳性结果,检测数量随需而变，单人份、多人份检测任选,有力的临床试验数据证明,WHO,国际癌症研究所在中国的研究项目显示，亚能对于高度病变,的检测灵敏度达,100%,、阴性预测值达,99.7%,，特异性、准确性和阳性预测值和都很高。,对约,3000,人份的临床数据显示，普通人群的,HPV,高危型感染率,为,11%,左右，医院高危人群的,HPV,高危型感染率为,20%,左右，这,与文献报道相当。,亚能,HPV,基因分型技术原理（,PCR-,反向点杂交法）,一次杂交反应可以检测多种靶序列,PCR,技术,Kary B.Mullis,（穆利斯）,聚合酶,链式反应（,PCR,）：,利用,DNA,碱基互补配对原则及半保留复制的特性，,将,目的,DNA,在体外进行,大量复制,美国,PE Cetus,公司的,Kary Mullis,于,1983,年创建,1989,年美国,Science,杂志将,PCR,列为,十余项重大科学发明之首,1993,年度诺贝尔化学奖,Polymerase Chain Reaction,PCR,技术原理,高温,变性,低温,退火,中,温,延伸,PCR,三步曲：,PCR,产物的生成量,以指数方式增加,PCR,技术特点,-,高度的灵敏性,PCR,产物的生成量是以指数方式增加的,35,轮循环，,扩增量理论上达,2,35,个拷贝（,680,亿！）,核酸分子杂交,核酸分子杂交是指具有一定同源性的两,条,核酸,单链在一定的条件下可按,碱基互补,原,则,退火形成双链的过程。分子杂交具有,高,度,的,特异性,。,探针,杂交体,亚能,HPV,基因分型检测流程,结果判读,HPV16,HPV6,52,阴性样本,单一感染,多重感染,亚能,HPV,产品卖点,详见,F:,英硕力,（三）亚能,HPV,产品卖点,.ppt,HPV,检测耗材列表及示意图,详见,F:,英硕力,HPV,基因分型检测常用耗材图示,.doc,实验室仪器设备清单,详见,F:,英硕力,实验室仪器设备清单,-20101227.xls,HPV,主要竞争产品介绍,PCR-,反向点杂交法特点,高灵敏度,-PCR,高特异性,-,核酸,分子杂交,高通量,-,膜,上固定多种探针,安全无毒,-,生物素标记,流式荧光杂交法,-,液态芯片,首先,PCR,扩增待测样品,，得到的,PCR,产物和微球上交联,的探针杂,交，加入,荧光标记反应,，最后在,流式,荧光检测仪上检测,荧光信号,。,如果,PCR,产物和探针配对，则微球上相应探针捕获到标有,Biotin,的,PCR,产物，加入荧光标记,StrepAvidin-PE,后，形成,微球,-,探针,-PCR,产物,-Biotin-StrepAvidin-PE,复合物,。在检测仪上即可检测到对应微球的荧光信号。,如果,PCR,产物与探针不配对,，,则,对应微球的荧光信号为,背景,信号,。,流式,荧光杂交法操作流程,PCR,扩增,DNA,提取,编码微球与探针混合,向检测板中加入微球,-,探针杂交液，,加入,PCR,产物,PCR,产物变性,杂交，,48,，,30min,加入链霉亲和素标记的藻红蛋白，,15 min,Luminex 100,多功能流式分析仪检测,代表厂家,：上海透景,人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒,检测的,基因型：,19,种高危型：,16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,73,83,，,26,55,61,66,种低危,型：,6,11,40,42,44,53,54,认证：,国食药监械,(,准,),字,2009,第,3400020,号,进口专用仪器,(,美国,Luminex,多功能流式点阵分析仪）,流式荧光杂交法,HPV 61,型为低危型！参照：,N Engl J Med 2003;348:518-27,Luminex 100,TM,多功能流式点阵仪,流式荧光,杂交法,-,不,定量,流式荧光杂交法总结,结合,普通,PCR,技术，核酸分子杂交技术和,荧光标记,技术,尚不成熟，灵敏度和特异性有待提高,无,洗涤步骤,，无法去除非特异性杂交，且有背景,荧,光信号干扰,技术,难点为探针与微球的交联，产品性能上,存在不,稳定性,只,分型，不定量,需,价格昂贵的流式荧光检测仪,（二）,二代杂交捕获,Hybrid,Capture 2,HC2,基本原理,：利用对抗体捕获信号的放大,和化学发光信号的检测,检测,通量,：,13,种高危,HPV,基因型,不能,提示具体的基因型,计算机,判读,15 min,杂交,60 min,抗体,捕获,60 min,第二抗体结合，,化学发光,30 min,DNA,变性,45 min,HC2,实验步骤图示,吸取变性剂于对照和样本管中,旋涡振荡,10,秒,65,孵育,45,分钟，采用,Microplate heater I,HC2,操作步骤,-DNA,变性,将已变性的样本混匀，吸取,75 ul,于,“杂交微孔板”,中,20-25,孵育,10,分钟,加入,25 ul,高危,HPV,探针于微孔板中,65,孵育,60,分钟,置于,Rotary Shaker I,中，,1100 rpm,，,32,分钟,准备,HPV,探针混合物,HC2,操作步骤,-,杂交,将杂交产物转移至,“捕获微孔板”,相应的小孔中,20-25,孵育,30-45,分钟,20-25,孵育,60,分钟，,1100 rpm,加入,75 ul Detection Reagent 1,（碱性磷酸酶偶联的抗体）,于“捕获”微孔板相应的小孔中,HC2,操作步骤,-,抗体捕获及酶标,洗涤微孔板：采用,Automated Plate Washer I,或进行手动洗板，,重复洗,6,次,加入,75 ul Detection Reagent 2,（化学显色底物）,于“捕获”微孔板相应的小孔中,20-25,孵育,15-30,分钟,采用,Digene microplate luminometer,(DML2000),读数,HC2,操作步骤,-,洗板及化学显色,HC2,如何进行结果判读,?,1,、阴性,对照,每次实验必须同时做,3,份阴性对照,。阴性对照的结果必须为,10-250 RLU,（相对光单位）。,变异系数（,%CV,）,应该,25%,，如果,25%,，那么去掉偏离平均值最远的一个阴性对照，用剩下的两个阴性对照计算平均值以及变异系数。,%CV,必须,25%,，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出,报告,2.,标准品,每次实验必须同时做,3,份高危,HPV,标准品,。,%CV,应该,15%,，如果,15%,，那么去掉偏离平均值最远的一个标准品，用剩下的两个标准品计算平均值以及变异系数。,%CV,必须,15%,，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告,3.,用标准品平均值（,M,HRC,）以及阴性对照平均值,M,NC,计算,M,HRC,/M,NC,比值,.,2.0M,HRC,/M,NC,15,。如果,2.0,或,15,，本次实验结果无效，必须重做。,4,.,如果符合以上的标准，检测结果是可靠的。,此时的,Cutoff,值,（阳性标本评判的标准）就是,M,HRC,阴性对照（,NC,）,高危,HPV,标准品,(HRC),97,312,101,335,91,307,平均值,96,318,%CV,4.9,4.7,HRC/NC,3.31,Cutoff,值,=318,，,所有标本的相对光单位（,RLU,）应该转换为与,Cutoff,值的比值，,比值大于,1,为阳性，比值小于,1,则为阴性,阳性,结果的判定,质 控,对照,HPV,基因型,预期的结果（,RLU/Cutoff,值）,最小值,最大值,QC1-LR,HPV 6,0.001,0.999,QC2-HR,HPV 16,2,8,HC2,技术总结,技术上，采用核酸分子杂交，抗体捕获（吸附杂交体），化学显色,不分型,不能检测,HPV,多重感染,不定量,有交叉杂交反应,每次需要消耗,8,个参考品，试剂成本高,手动操作很多，步骤繁琐,需价格昂贵的基因杂交信号放大系统,(,三,),荧光定量,PCR,技术,原理,：,在,PCR,反应体系中,加入荧光,基团,利用荧光信号的积累,实时监控整个,PCR,过程,最后通过标准曲线对起始模板量进行定量分析,.,定量,，不分型,荧光基团的分类,化 学 原 理,荧光定量,PCR-,基于,Taqman,探针,化 学 原 理,荧光定量,PCR,技术总结,能定量检测,HPV,拷贝数,灵敏度高,不分型,不能检测,HPV,多重感染,检测通量有限，目前最多检测,13,种高危型,需价格昂贵的荧光定量,PCR,仪,（四）原位杂交,采用,荧光、生物素、地高辛等标记的探针，,依据碱基互补配对原理，与,组织切片,、细胞,涂片,等标本中的靶序列特异杂交,，经,信号放大及显色后,，,显微镜,下观察结果,原位杂交试剂盒,代表厂家：北京中杉金桥生物技术有限公司,原位杂交实验步骤,以地高辛标记,HPV DNA,探针为例,4-6mm,切片，用处理过的玻片捞片。,56-60,烤片，,2-16,小时,。,新鲜二甲苯脱蜡，,10,分钟,2,次,。,100%,乙醇,5,分钟,2,次，空气干燥。,加入,50ml,胃酶工作液，,37,消化,30,分钟,。,弃去胃酶工作液，逐级酒精脱水,1,分钟,3,次，空气干燥。,加,10-20ml,探针，加盖玻片。用橡胶水泥将盖片周围密封（目录编号,ZLI-9601,）。,变性,95 5-7,分钟。,杂交,37,2-16,小时,。,揭去橡胶水泥，将切片插入,PBS/TBS,缓冲液中以便去掉盖玻片，约,5-10,分钟,。,每张切片加入,2-3,滴杂交后洗液，,37,孵育,15,分钟,。,PBS/TBS,缓冲液洗，,1,分钟,3,次。,每张切片加入适量辣根酶标记抗地高辛抗体，,37,孵育,30,分钟,。,PBS/TBS,缓冲液洗，,1,分钟,3,次。,滴加适量,DAB,工作液，镜下观察显色结果，约,3-10,分钟。,弃去显色液，蒸馏水或自来水冲洗。,选择：每张切片加入,1,滴复染剂，,5-10,秒钟。,蒸馏水或自来水冲洗。,脱水、透明、封片。,原位杂交技术总结,灵敏度,低（无,PCR,扩增）,特异性,高,检测,通量低,不能,分型,不能,定量,操作,步骤繁琐,非常,费时，需要两天,HPV,检测产品无注册证，仅仅用于科研,（五）表面等离子体,谐振,（,SPR,）技术,93,表面等离子谐振现象,Surface Plasmon Resonance,，,SPR,入射光,(,单波长偏振光,),在,玻片,-,金膜,界面全反射，激发金膜中的自由电子产生,表面等离子体,。,当光波激发频率与表面等离子体的,振动频率相等,时，二者发生谐振，光能被吸收,反射光几乎完全消失,此时入射光的角度被称作,SPR,角（谐振角,）。,分析,SPR,曲线,谐振角变化,芯片表面质量改变,(,折射率变化,),分子相互作用,SPR,检测核酸原理示意图,反应曲线,Time(s),SPR,角,(m),S,S,S,S,传感芯片,寡核苷酸探针,PCR,产物,变性,dsDNA,ssDNA,杂交,1,）,核酸提取试剂,2,）,PCR,反应试剂,3,）,SPR,检测试剂和芯片,北京金菩嘉,-,HPV,分型检测试剂盒组成,HPV,基因检测芯片，共,26,个通道，一个阴性，一个,IC,，,24,个,hpv,探针,通道,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,类型,51,81,68,35,6,11,42,70,44,43,54,40,阴性,通道,217,：高危,HPV;,通道,1825,：低危,HPV,SPR,检测芯片探针点阵,通道,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,类型,IC,16,18,31,33,52,58,56,59,66,45,53,39,SPR HPV,检测芯片,SPR,技术,检测,H P V,流程图,样品制备,DNA,PCR,扩增产物,线上检测,输出报告,成品芯片,包被,分型探针固定,包被芯片,芯片基片,SPR,设 备 简 介,W2600,型生物传感芯片阅读仪,W2600,工作流程,开始,检测后系统自动进行以下动作：,清空机器内部样品匣,更换样品匣,更换芯片匣,清洗采样针、,buffer,针,扫描芯片,注入系统,buffer,注入系统,buffer,扫描芯片,采样,等待,30,min,（杂交,）,扫描芯片,输出检测结果,SPR,技术检测,HPV,总结,同样需要,DNA,提取,采用普通,PCR,扩增，核酸分子杂交,采用,SPR,技术（物理手段）检测杂交信号,无临床应用文献,无注册证,（六）,HPV DNA,序列测定,经典方法,:,Sanger,双脱氧链终止法,(Sanger,1977),Maxam-Gilbert DNA,化学降解法,(Maxam&Gilbert,1977),与,PCR,反应类似,反应体系中包含,：,模板,DNA,Taq,酶,dNTPs,ddNTPs,和,测序,引物,反应过程：,变性,复性延伸,终止,Sanger,双脱氧链终止法,Dideoxynucleotides,（双脱氧核苷酸）,ddNTPs,是,反应,终止剂,可以,当作正常,碱,基,参与复制,，一,旦掺入,DNA,中，,其后延伸反应就,不能继续。,*,少一个,OH,脱氧,核甘,酸与,双脱氧核甘,酸结构,比较,双脱氧链终止法,测序原理,反应体系中含有,ddNTPs,因此，在复制的延伸过程中，在,DNA,任何碱基位置都可能出现终止反应，从而形成不同长度的寡核苷酸混合物。,所以，每条寡核苷酸都有固定的起点，但有不同的终点，长度由,ddNTPs,掺入的位置决定。,在高分辨率的电泳条件下（如毛细管电泳），,能够将长度相差一个碱基的寡核苷酸分离开。,ddNTPs,包含,4,中双脱氧核苷酸，分别带有不同的荧光标记，当带有不同荧光标记的寡核苷酸依据长度大小先后通过荧光检测仪时，检测仪可以自动读取,DNA,上的核苷酸顺序,凝 胶 电 泳,DNA,在电泳,中,的,迁移率,与其,片段,长度有关,，,片段,小的跑,得,快,，片段大,的,跑,得慢，,因而,彼此,分离开,。,双脱氧链终止法测序原理示意图,DNA,全自动分析仪,ABI 3100,遗传分析仪,3700,型全自动遗传分析仪,安玛西亚,DNA,序列分析系统,377,型遗传分析仪,DNA,提取,PCR,扩增,PCR,产物纯化（电泳或专用试剂盒）,读取序列及分析,测序仪检测,产物纯化,测序反应,HPV DNA,测序流程,测序法检测,HPV,的局限性,首先必须对待测,样,本,进行,PCR,扩增,，,由于,事先不知道,是,哪,一种,HPV,基因,型,的感染，所以,必,须,采用,通用引物,进,行,PCR,扩增,单一感染,（如,HPV 16,）,多重感染,（如,HPV 16,，,18,，,52,，,58,）,鉴定,无法,鉴定基因型！,DNA,测序技术总结,测序,之前必须做对待测样本进行,PCR,扩增或,DNA,克隆,测序,技术的准确性依赖于,引物的特异性,难以对,HPV,多重感染进行测序鉴定,操作复杂，耗时,测序仪价格昂贵,国内开展基因测序的机构或企业非常少,无注册证，仅仅用于科研,各种,HPV DNA,检测技术总结,膜芯片,流式荧光杂交法,杂交捕获二代,荧光定量,PCR,原位杂交,SPR,测序,原理,PCR+,反向点杂交,+,化学显色,PCR+,杂交,+,荧光标记,杂交,+,抗体捕获,+,化学显色,PCR+,荧光标记,杂交,+,化学显色,PCR+,杂交,+,光学检测,PCR+,双脱氧链终止法,探针固定方式,固定于膜芯片上,固定于微球上,不固定,无,不固定,金膜,无,能否分型,分型,分型,不分型,不分型,不分型,分型,分型,能否鉴定多重感染,能,能,不能,不能,不能,能,难,信号检测手段,化学显色,荧光扫描,化学显色,荧光扫描,化学显色,SPR,角,荧光扫描,灵敏度,高,低,低,高,低,无文献,高,特异度,高,低,交叉反应,高,高,无文献,高,检测通量,高,高,低,低,极低,高,低,仪器设备要求,低,很高,很高,高,低,高,很高,有无注册证,有,有,有,有,无,无,无,基因芯片技术特点,高,灵敏度,-PCR,高,特异性,-,核酸,分子杂交,高,通量,-,膜,上固定多种探针,安全,无毒,-,生物素,标记,二、,HPV,主要竞争,产品,基因芯片技术,代表厂家：亚能、凯普、达安,二代杂交捕获,代表厂家：,Qiagen,（凯杰）,荧光定量,PCR,代表厂家：港龙，达安，凯普，复星，,匹基,流式荧光杂交法,代表厂家：上海透景,三、亚,能,HPV,与竞争产品的对比,1,、亚,能和凯普,HPV,基因分型产品对比,2,、亚,能基因芯片技术与二代杂交捕获对比,3,、亚,能基因芯片技术与荧光定量,PCR,对比,4,、亚,能基因芯片技术与流式荧光杂交法对比,亚 能,凯 普,技术原理,PCR+,反向点杂交,PCR+,导流杂交,（实质也是反向点杂交）,经典杂交方法,导流杂交是通过外力抽吸,加压，人为缩短杂交时间,杂交操作,时间,1,份 标本,70min,15,份,75min,25,份,80min,48,份,90min,96,份,100min,样本量越多，时间优势越明显！,1,份 标本,40min,15,份,60min,1630,份,60min2,3145,份,60min3,4660,份,60min4,6175,份,60min5,7690,份,60min6,96,份,60min7,基本设备,离心机、,PCR,仪、,普通杂交仪（价格低廉）,离心机、,PCR,仪、,专用杂交仪（价格较贵）,样本来源,宫颈脱落细胞，疣体组织，病理石蜡切片，液基细胞学样本,宫颈脱落细胞、,疣体组织,（一）亚能和凯普,HPV,基因分型产品对比,亚能,凯普,DNA,提取,提取试剂通过国家认证,提取试剂只含裂解液一种成分,提取试剂盒未通过国家认证,提取试剂分溶液,PCR,PCR,反应液已分装,扩增体系未分装，人工配制反应液,杂交,杂交前准备工作简单,常规杂交，常态性碰撞接触，多次接触，反应充分,杂交仪中空气传导加热，温度均匀、准确，更高特异性,独立杂交管内杂交，无交叉污染,仪器运转中操作者可休息,杂交前准备工作复杂，要通过一系列步骤人工分隔反应室,导流杂交，人为外力作用，,一过