细胞凋亡分子机制及检测.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,细胞发生代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即,细胞死亡,。细胞死亡包括,坏死和凋亡,两大类型。相比起细胞坏死，,细胞凋亡是更常见的细胞死亡形式,。,在,20,世纪,70,年代，科学家们发现了细胞凋亡，这一研究成果获得了,2002,年诺贝尔生理,/,医学奖。,有丝分裂 细胞增多,动态平衡,细胞凋亡 细胞减少,新生细胞出现，产生相应功能 机体,正常生,原有的、不必要的、有害的细胞除去 长发育,细胞程序性死亡,的概念是,1956,年,提出的，,PCD,是个功能性概念，描述在一个,多细胞生物体,中某些细胞死亡是,个体发育,中的一个,预定的，并受到严格程序控制,的正常组成部分。,特征,:,即散在地、逐个地从正常组织中死亡和消失,机体无炎症反应，而且对整个机体的发育是有利和必须的。,细胞程序性死亡是一个,发育学,概念，而细胞凋亡则是一个,形态学,概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。但是一般认为凋亡和程序性死亡两个概念可以交互使用，具有同等意义。,凋亡概念的形成,1965,年澳大利亚科学家发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些,散在的死亡细胞。,这些细胞的溶酶体并未被破坏，显然不同于细胞坏死。这些细胞体积收缩、染色质凝集,从其周围的组织中,脱落并被吞噬,机体无炎症反应,。,1972,年,Kerr,等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念，宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始，在此之前，关于胚胎发育生物学、免疫系统的研究，肝细胞死亡的研究都为这一概念的提出奠定了基础。,细胞凋亡的,形态学及生物化学,研究阶段,（,1972-1987,）,1,）利用,光镜和电镜,对形态学特征进行了详细的研究。,2,）,染色体,DNA,的降解：细胞凋亡的一个显著特征就是细胞染色质的,DNA,降解。,3,）,RNA/,蛋白质,大分子的合成。,4,）,钙离子,变化，细胞内钙离子浓度的升高是细胞发生凋亡的一个重要条件。,5,）,内源性核酸内切酶,：细胞发生凋亡是需要这种核酸内切酶参与的。,细胞凋亡的,分子生物学,研究阶段,1,）细胞凋亡相关,基因,及其调控,2,）细胞凋亡的,信号转导,3,）细胞凋亡各种分子相互作用及相互关系,4),细胞凋亡的临床应用基础研究阶段,细胞凋亡的研究，其生命力在于最终能够有利于疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。,细胞的生长发育、增殖、分化和死亡是细胞的,4,大特点，细胞死亡分为,细胞凋亡和细胞坏死,。,细胞凋亡,(apoptosis),是由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程,是细胞生理性死亡的普遍形式。凋亡过程中,DNA,发生片段化，细胞皱缩分解成凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发生炎症。,第一节 概述,一、细胞凋亡概念和特征,细胞坏死（,necrosis,）,是在各种致病因素（如缺氧、物理、化学和生物学因素）的剧烈刺激下的,病理性死亡。,其,特点,是,:,引起死亡的因素剧烈，死亡迅速。表现为能量代谢下降,膜通透性增加,细胞水肿,细胞器破裂，细胞溶解，,DNA,不断裂,内含物释放,引起炎症反应。,细胞凋亡,:,细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,结束其生命的生理性死亡，是受基因严格调控的细胞自杀现象。凋亡过程中，细胞骨架蛋白分解,细胞和细胞器浓缩而不裂解,染色体,DNA,断裂和形成凋亡小体,细胞内含物不外泄，不引起炎症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识别和吞噬。,细胞凋亡,Apoptosis,和细胞坏死,Necrosis,细胞凋亡的形态学特征,细胞：,首先变圆，体积缩小，与邻近细胞的连接丧失，失去微绒毛，胞浆浓缩，细胞膜结构仍保持完整。,细胞核的变化,：胞核内染色质浓缩形成密集颗粒，位于核被膜下。,细胞器：,线粒体：保持完整呈正常状态,溶酶体：保持完整，内容物不外泄,形成,凋亡小体,：内质网、高尔基复合体及核被膜膨大,形成泡状结构与细胞膜融合，以出泡方式离开正在死亡的细胞，将所包含的完整细胞器和核碎片等细胞内容物以细胞质膜包被成,凋亡小体,(apoptosis bodies,）,释放到细胞外。凋亡小体很快被周围邻近,间质细胞或巨噬细胞,吞噬，而不引起周围组织的炎症反应。,胸腺细胞,正常,凋亡,生物化学方面：,核酸内切酶,活化与,DNA,电泳呈梯子状,改变是,apoptosis,的,生物化学标志,。,核酸内切酶在核小体连接处将,DNA,链切断，从而最终产生,寡聚核小体,。这些寡聚核小体的大小均是,DNA,长度为,180-200,个碱基对,(bp),的倍数，因此用琼脂糖凝胶电泳测定细胞,DNA,时出现特征性的,“,梯状,”,（,ladder,）带纹,。,Ladder Pattern of Apoptotic Cells,二、细胞凋亡的生理意义,1.,维持组织器官,细胞类型和细胞总量的基本平衡,：清除衰老损伤的细胞,：皮肤、粘膜细胞的更新等。,2.,在,胚胎发育,中起重要作用,a,手指和脚趾的形成等。,b,大脑神经元之间形成连接时多余的神经细胞通过凋亡清除掉。,c,在淋巴细胞发育成熟中起重要作用。,d,心脏发育过程中左右心室、房的形成以及左右心室的厚度，通过细胞凋亡调节。,3.,细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等,疾病,。,未成熟,B,细胞,（,immature B cell,）完成骨髓发育阶段后，进入血液循环。尽管它表达,膜表面抗原受体,，但,不具备免疫活性,。因此，在结合抗原后，细胞不被激活，而是通过凋亡被清除。,只有经过不同阶段的过渡期，分化为成熟,B,细胞，才具有免疫活性。,过渡期,B,细胞的发育、成熟是受复杂的调控。,一方面,，细胞的生存机制促进未成熟,B,细胞的存活与发育，保证了,B,细胞成熟的顺利完成。,另一方面,，,70%,的细胞凋亡，消除潜在自身反应性,B,细胞,，实现了对自身组织的免疫耐受。,由,HIV,感染引起的艾滋病有一个重要特征是随着病情的发展，,CD4T,细胞数进行性减少，其主要原因是：,1,，,HIV,感染细胞后产生一些调控性基因产物，这些产物使,未被感染细胞,对,CD95,介导的,凋亡高度敏感,（即通过,Fas-FasL,应答而使未被感染的细胞凋亡）；,2,，被,HIV,感染的,CD4T,细胞大量复制子病毒，导致细胞死亡，同时又使更多的细胞被感染。随感染时间的延长造成免疫系统进行性损伤和崩溃。,由此可见,:HIV,即,可引起细胞凋亡也可引起细胞坏死,.,一、半胱天冬酶（胱冬酶，,caspase,，,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，,cysteine-containing aspartate-specific protease),第二节 细胞凋亡相关基因和蛋白质,Caspase,的含义表现在两个方面（）它们为半胱氨酸蛋白酶类，并且把半胱氨酸作为对底物裂解时的亲核基团；（）它们为天冬氨酸蛋白酶类，切割天冬氨酸的羧基与下一个氨基酸的氨基形成的肽键。,Asp,特异性半胱氨酸蛋白酶,.,caspase,能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但不完全降解一种蛋白质。,是一类促进细胞凋亡的,蛋白水解酶,，在诱导细胞凋亡中起关键作用，成为细胞凋亡的,“,中心处理器,”,，即各种细胞凋亡信号通过传递最终激活胱冬酶，胱冬酶通过水解不同的蛋白质引起细胞凋亡。,1 Caspase,的结构和功能,Caspase,共有十多种，结构相似，都以,酶原,的形式分泌。酶原水解激活后产生,前结构域，大亚基和小亚基,三部分，然后大小亚基聚合形成有活性的四聚体。,N,端结构域,参与酶功能激活调节,;,大、小亚基,提供与底物,结合及催化,所需的氨基酸。,Caspase,可专一、高效地特异性水解一系列蛋白质底物,并导致蛋白质功能丧失或改变。,caspase,酶原,前结构域,+,大亚基,+,小亚基,大,异二聚体,小,大 大,异四聚体,活性形式,小 小,活化,Caspase,为四聚体，两个小亚基相邻排列，两个大亚基围绕在小亚基的周围；每一大小亚基形成一球状分子，球状分子的核心为个,螺旋环绕的,6,个,片层样结构。两个异二聚体以小亚基相连。每一活化,Caspase,分子含有两个酶活性中心，这两个活性中心可能独立发挥作用。,Crystal Structures of Human Caspases,Structure of Caspase-7 with Inhibitor,Caspase,作用：,是一类,蛋白水解酶,，可特异水解底物蛋白分子中,天冬氨酸残基,羧基侧,的肽键，从而激活该蛋白质或改变蛋白质的活性，从而促进细胞凋亡。,N,A-B-C-D-X,C,不同的,Caspase,对,ABCD,种类要求不同。,Caspase,是细胞凋亡的执行者，引起细胞凋亡的各种因素通过凋亡信息传递途经最终激活,caspase,，,caspase,通过水解不同的蛋白质改变细胞特性，引起细胞凋亡。其中,caspase 3,的作用最重要。但并非所有的凋亡过程都有,caspase,的参与。,2 Caspase,的分类,（,1,）上游,/,启动型,caspase:2,、,8,、,9,、,10,，,12,处于细胞凋亡信号传递途径的上游，在凋亡信号的刺激下首先被激活，然后再水解激活下游的,caspase.,（,2,）下游,/,执行型,caspase:3,、,6,、,7,处于细胞凋亡信后传递途径的下游，被上游,caspase,激活后直接水解与细胞凋亡有关的底物蛋白，引起细胞形态学和生物化学改变以及,DNA,的断裂。,3 Caspase,的底物,1,、,细胞骨架蛋白,：核纤层蛋白、肌动蛋白、核分裂相关蛋白等十几种蛋白。,2,、,与,DNA,损伤修复相关的蛋白质和酶,，阻止,DNA,损伤的修复。,如：,DNA,依赖性蛋白激酶、,DNA,复制相关蛋白。,3,、,激活,DNA,酶,，促进,DNA,断裂。,二、死亡受体及相关蛋白,是一类参与外源性细胞凋亡途经的蛋白质：,*,死亡配体（细胞外）死亡受体（细胞膜）相关蛋白（中介蛋白，细胞内）激活,caspase,诱导细胞凋亡,1,死亡受体,(death receptor,DR),死亡受体,是一类跨膜蛋白，与其配体结合后可把凋亡信号传递到细胞内部。,主要的死亡受体是,TNF-R,超家族；,配体 死亡受体,TNF-TNF-R1,FasL Fas,（,CD95/APO-1,）,APO-3L DR-3,（,WOL-1,）,APO-2 DR-4,（,TRAIL-R1,）,TRAIL DR-5,（,TRAIL-R2,）,（,TNF,相关的凋亡诱导配体，,TNF-related apoptosis-inducing ligand,）,Death Domain-,细胞凋亡,Fasassociated protein with,death domain,TNF receptor-1associated,death domain protein,Apoptosis,caspase,激活的,DNA,酶（,caspase,activated deoxyribonuclease,，,CAD,）,ICAD,（,inhibitor of CAD,）,死亡受体相关蛋白（中介蛋白,/,接头蛋白）,是连接死亡受体和,caspase,的中介蛋白，把凋亡信号从死亡受体传递给,caspase,。,(1),FADD,（,Fas,相关的死亡结构域蛋白,，,Fas associated death domain protein),由两部分构成,介导,Fas,和,TNFR,1,两种受体的细胞凋亡信号,:,A,死亡结构域：与,Fas,的,DD,相互作用,B,死亡效应区：与启动型,caspase2,、,8,、,9,、,10,作用,(2)TRADD,（,TNFR-1,相关死亡结构域蛋白,）,从,TNFR-1,接受死亡信号，然后传递给,FADD.This protein can also interact with receptor FAS,and is involved in the Fas-induced cell death pathway,三、,凋亡蛋白酶激活因子类,（,apoptosis protease activation factor,Apaf,）,一类促进细胞凋亡的蛋白因子，参与细胞凋亡的线粒体信息传递途经。,细胞凋亡与,线粒体膜电位,及,通透性,改变有关。凡是诱导细胞凋亡的因素，都可使线粒体的,膜电位下降，膜通透性增加,，,线粒体膜通透性转运孔（,MPT,）开放,，释放出多种可激活,caspase,的蛋白因子，包括细胞色素,c(Cytc),，凋亡诱导因子,(AIF),。,1,细胞色素,c,（,Cytc,）,细胞色素,c,是呼吸链的重要成员，是由线粒体,DNA,编码的蛋白质。,细胞凋亡信号 线粒体膜通透性增加，,Cytc,释放到胞浆,与,Apaf-1,和,caspase-9,结合成复合体,，诱导凋亡。,2,凋亡蛋白酶激活因子,-1,（,Apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1,）,在正常情况下,Apaf-1,以无活性的单体存在于细胞质，在凋亡信号的作用下，其,N-,端与,Caspase-9,结合，其,C,端与细胞色素,C,结合。形成,Cytc-Apaf-1-Caspase-9,复合体,-,凋亡酶体（,apoptosome),。首先激活,caspase-9,，然后激活下游的,caspase 3,，,6,，,7,等，诱导细胞凋亡。,3,凋亡诱导因子（,Apoptosis inducing factor,AIF,）,凋亡诱导因子是一类存在于线粒体内外膜间隙的保守的黄素蛋白，具有,双重功能,。在细胞正常的生理状态下，,AIF,作为,线粒体氧化还原酶,，能催化细胞色素,c,（,Cyt-c,）和,NAD,之间的电子传递，当细胞受到凋亡的刺激时，线粒体膜通透性改变，,AIF,从线粒体转位到核内，与线粒体蛋白质,endonuclease G(Endo G),一起,引起细胞染色体的凝聚和,DNA,大的片段化,。,apoptosis-inducing factor,四、,Bcl-2,家族,Bcl-2,家族成员都含有,1-4,个,Bcl-2,同源结构域,（,BH1-4,），并且通常有一个羧端,跨膜结构域,(transmembrane region,TM),。其中,BH4,是抗凋亡蛋白所特有的结构域，,BH3,是与促进凋亡有关的结构域,。根据功能和结构可将,Bcl-2,基因家族分为两类，一类是,抗凋亡的（,anti-apoptotic,），,如：,Bcl-2,、,Bcl-xl,、,Bcl-w,、,Mcl-1,；一类是,促进凋亡的（,pro-apoptotic,），,如：,Bax,、,Bak,、,Bad,、,Bid,、,Bim,，在促凋亡蛋白中还有一类仅含,BH3,结构，如,Bid,、,Bad,。,（一）,Bcl-2,和,Bcl-xl,1,为膜结合蛋白,2,降低线粒体膜通透性，抑制,Cytc,、,AIF,等释放。,4,抑制自由基的产生，抑制氧化剂对细胞凋亡的诱导作用。,5,许多抗癌药物如紫杉醇可使,bcl-2,磷酸化而失活。从而诱导肿瘤细胞凋亡。,6 HIV,病毒蛋白水解酶可水解,Bcl-2,诱导,T,淋巴细胞凋亡。,虽然,Bcl-2,蛋白存在于,线粒体膜、内质网膜以及外核膜,上，但主要定位于,线粒体外膜,，它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多数促凋亡蛋白则主要定位于细胞质，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道，或者开启线粒体的,PT,孔，从而导致线粒体中的凋亡因子释放，激活,caspase,，导致细胞凋亡。,（二）,Bax,、,Bcl-xs,、,Bad,1 Bax,在线粒体外膜形成寡聚体，形成通道使线粒体膜的通透性增加，促进,CytC,、,Apat-1,等的释放，激活,caspase,，促进凋亡。,2,当细胞内,Bax,含量远大于,Bcl-2,和,Bcl,xl,时，,Bax,自身形成的二聚体,Bax,Bax,，可诱导细胞凋亡。,3,在凋亡信号作用下，,p53,表达升高，,p53,进一步诱导,Bax,表达增加，诱导细胞凋亡。,bcl-2,二聚体抑制凋亡，促进细胞增殖,bax,二聚体促进凋亡,p53,促进,bax,蛋白的合成,BcL-2,家族抑制和促进细胞凋亡两类蛋白的比例决定了细胞,在受到凋亡信号刺激时是否发生凋亡,第三节 细胞凋亡通路,目前发现细胞凋亡有,3,条通路：死亡受体通路线粒体通路内质网通路,第三节 细胞凋亡通路,1,死亡受体通路（外源性凋亡途经）,过程：配体（,TNF/FasL),死亡受体 接头蛋白（,FADD/TRADD,）,caspase-8(caspase-10),凋亡酶体（,apoptosome)caspase-8(caspase-10),自身切割激活 激活,caspase-3,细胞凋亡。,一、细胞凋亡的三条通路,Death Domain-,细胞凋亡,Fasassociated protein with,death domain,TNF receptor-1associated,death domain protein,Apoptosis,2,线粒体通路（内源性凋亡途经）,过程：活性氧（氧自由基）,/DNA,损伤,Bax,穿入线粒体膜,cyt C,漏出线粒体,cyt C +Apaf-1 +caspase-9 +ATP,凋亡酶体（位于细胞液）,caspase,9,自身切割激活 水解激活,caspase-3,细胞凋亡,线粒体,-,细胞凋亡,3,内质网通路,过程：,内质网（,ER),内,Ca,2+,错误折叠的蛋白质积累,ER,膜上,Bax,和,Bak,聚集 激活膜上的,caspase-12,（自我切割）水解激活,caspase-3,细胞凋亡,二、细胞凋亡通路的调节,1,P53,是一种很重要的抑癌基因，其蛋白产物是转录因子，是一种很强的细胞凋亡诱导因子。诱导,p21,表达、抑制细胞增殖。,p53,对死亡受体通路和线粒体通路均有调节作用。,p53,Bax bcl-2 ,线粒体膜通透性增加,细胞凋亡,Fas,表达增加，,Fas-FADD,复合物增加细胞凋,亡。,2.,Bcl-2,家族对线粒体通路和内质网通路有调节作用。,Bcl-2,家族：（,1,）在线粒体外膜形成寡聚体，影响膜通透性，影响凋亡；（,2,）聚集在内质网膜上，影响膜通透性降低，影响内质网内钙离子积累，影响细胞凋亡。,第四节 细胞凋亡的检测,一、细胞凋亡的形态学检测,1,、,光学显微镜和倒置显微镜,（,1,）,未染色细胞,：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。,（,2,）,染色细胞,：常用,姬姆萨染色、瑞氏染色,等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。,（放线菌素,D,）,姬姆萨染色（肝组织）。,A,：对照组；,B,：处理组，凋亡细胞核染色质致密分布于核膜下。,A,B,图,1,光学显微镜所见：箭头所示细胞膜皱缩，细胞核裂解成大小不一的核片段。瑞氏染色,400,图,2,透射电子显微镜所见：箭头所示大量凋亡小体形成，其内可见致密染色质和完整细胞器。透射电子显微镜,8000,2,、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜,(,一种高级的荧光显微镜,),一般以,细胞核染色质形态学改变,为指标来评判细胞凋亡的进展情况。,常用的,DNA,特异性染料,有：,Hoechst 33342,，,Hoechst 33258,DAPI,。三种染料与,DNA,的结合是非嵌入式的，主要结合在,DNA,的,A-T,碱基区,。紫外光激发时发射明亮的,蓝色荧光,。,结果评判：细胞凋亡过程中,细胞核染色质的形态学改变,分为三期：,期的细胞核呈波纹状（,rippled,）或呈折缝样（,creased,），部分染色质出现浓缩状态；,a,期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；,b,期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。,3,、透射电子显微镜观察,结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡,期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（,cavitations,）的空泡结构；,a,期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；,b,期细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。,（人外周血白血病,T,细胞）,二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（,Annexin V,法）,磷脂酰丝氨酸（,Phosphatidylserine,PS,）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，,PS,可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。,Annexin-V,是一种分子量为,3536KD,的,Ca,2+,依赖性磷脂结合蛋白,，能与,PS,高亲和力特异性结合。将,Annexin-V,进行荧光素（,FITC,、,PE,）或,biotin,标记,，以标记了的,Annexin-V,作为,荧光探针,，利用,流式细胞仪或荧光显微镜,可检测细胞凋亡的发生。,Annexin V/PI,双染色法,PS,转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。,两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。,因此，可以建立一种用,Annexin V,结合在细胞膜表面作为凋亡的指示,并结合一种染料以检测细胞膜完整性的检测方法。,碘化丙啶,(propidine iodide,PI),是一种,核酸染料,，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中,晚期细胞和死亡细胞,，,PI,能够透过细胞膜而使,细胞核红染,。因此将,Annexin-V,与,PI,匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及坏死细胞区分开来。,结果判断,：在双变量流式细胞仪的散点图上，,左下象限,显示活细胞，为（,FITC-/PI-,）；,右上象限,是非活细胞，即坏死细胞，为（,FITC+/PI+,）；而,右下象限,为凋亡细胞，显现（,FITC+/PI-,）。,三、线粒体膜势能检测,线粒体跨膜电位,的下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、,DNA,断裂）出现之前，一旦,线粒体跨膜电位,崩溃，则细胞凋亡不可逆转。,JC-1,染料在,正常细胞,内聚集在线粒体内，形成多聚体，,发红色荧光,；而在,凋亡细胞,内，由于线粒体膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，以单体的形式存在于胞质内,发绿色荧光,。荧光显微镜或流式细胞仪检测。,用凋亡诱导剂诱导,P388,细胞凋亡，在,37,，,5%CO,2,培养箱培养,46h,，利用细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒（,JC-1,）进行检测，通过流式细胞仪分析。,四、,DNA,片断化检测,细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质,DNA,在核小体单位之间的连接处断裂,形成,50300kbp,长的,DNA,大片段,或,180200bp,整数倍的寡核苷酸片段,。,大分子染色体,DNA,片段的测定,细胞凋亡的早期,染色体断裂成为,50300kbp,长的,DNA,大片段。其,不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。,通常采用,脉冲电泳技术。,180200bp,整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱,(DNA ladder),。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯,DNA,，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的,DNA ladder,。如果细胞量很少，还可在分离提纯,DNA,后，用,32,P-ATP,和脱氧核糖核苷酸末端转移酶,使,DNA,标记,，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中,DNA ladder,的形成。,五、末端转移酶标记技术,-TUNEL,法,细胞凋亡中,染色体,DNA,双链断裂或单链断裂,而产生大量的,3-OH,末端,，可在,脱氧核糖核苷酸末端转移酶,的作用下，将,脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物,标记,到,DNA,的,3-,末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（,terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL,）,。,正常的或正在增殖的细胞几乎没有,DNA,的断裂，没有,3-OH,形成，很少能够被染色,。,TUNEL,技术检测,BAK,基因过表达后癌细胞凋亡,TUNEL,实际上是,分子生物学与形态学,相结合的研究方法，对完整的,单个凋亡细胞核或凋亡小体,进行,原位染色,，能准确地反应细胞凋亡典型的,生物化学和形态特征,，可用于,石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞,的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。,六、,Caspase-3,活性检测,Caspase-3,正常以,酶原（,32KD,）,的形式存在于胞浆中，在,凋亡的早期,阶段，它被激活，活化的,Caspase-3,由两个,大亚基（,17KD,）,和两个,小亚基（,12KD,）,组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在,细胞凋亡的晚期和死亡细胞,，,caspase-3,的活性明显下降。,1,、,Western blot,分析,分析,Procaspase-3,，活化的,Caspase-3,及其对,底物,多聚（,ADP-,核糖）聚合酶,poly,（,ADP-ribose,）,polymerase,，,PARP,等的裂解。,2,、,荧光分光光度计分析,原理：活化的,Caspase-3,能够特异切割,D(Asp)1E(Glu)2V(Val)3D4-X,底物，水解,D4-X,肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽,Ac-DEVD-AMC,。在,共价偶联时，,AMC,不能被激发荧光，短肽被水解后释放出,AMC,，自由的,AMC,才能被激发发射荧光,。根据释放的,AMC,荧光强度的大小，可以测定,caspase-3,的活性，从而反映,Caspase-3,被活化的程度。,七、酶联免疫吸附法,(ELISA),核小体测定,凋亡细胞的,DNA,断裂使,细胞质内,出现核小体,。核小体由组蛋白及其伴随的,DNA,片断组成，可由,ELISA,法检测。,1,、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含 有核小体,2,、在微定量板上吸附,抗组蛋白抗体,3,、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合,4,、,加辣根过氧化物酶,标记的,抗,DNA,抗体,使之与核小体上的,DNA,结合,5,、加酶的底物，测光吸收。,