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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程基本操作过程,2025/11/3 周一,一、查找序列及引物设计,二、抽提质粒及电泳检测,三、感受态细胞制备及基因的导入,四、筛选阳性克隆及DNA测序,五、诱导表达,一 查找目的基因及引物设计,一、查找目的基因（从NCBI上查到的大肠杆菌NEO基因）,2025/11/3 周一,二、,pet-22b,质粒分析,2025/11/3 周一,比较理想的酶切位点有：,BamH l、EcoR l、Sac l、Sal l、Hind lll、Not l、Xho l、Eag l、Ava l,等9种,2025/11/3 周一,引物设计（,Oligo,）,2025/11/3 周一,2025/11/3 周一,二聚体分析,2025/11/3 周一,组成与,Tm,2025/11/3 周一,错误引发位点,2025/11/3 周一,PCR,2025/11/3 周一,限制性酶切位点分析,2025/11/3 周一,双酶切质粒、PCR并电泳检测,溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中,2、取50ul过夜培养物接入3ml含氨苄青霉素的LB培养液，37C振荡培养2h以上，至对数中期,这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。,第三种方法是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。,05倍菌液体积的预冷CaCl2 溶液。,然而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。,通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序,不同菌种，离心的转速和时间可以酌情更改。,将分离出的质粒进行酶切，酶切后如果导入质粒为成功将目的基因接入的质粒，则应该为两个基因片段。,2、取50ul过夜培养物接入3ml含氨苄青霉素的LB培养液，37C振荡培养2h以上，至对数中期,由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。,目的基因上只有一种酶(EcoR l)的限制性酶切位点，所以我们排除他，选择了BamH I和Hind III两种酶,2025/11/3 周一,BamH I,上游引物,CGGATCC,ATGTCCAAAATCGTAAAAATCATCGGT,TTATGCCTGGCCTTTGATCTCTTTA,AAGCTT,下游引物,Hind III,2025/11/3 周一,三 抽提质粒并电泳检测,质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒,1、去除RNA,去除 RNA 相对比较简单，首先是使用 RNase 消化(抽提中或者抽提后)。经过 RNase 消化后，RNA 变得比较小了，其残留对酶切反应几乎没有影响。如果要彻底去除残留得 RNA，则需要更烦琐的操作,2025/11/3 周一,2、质粒与细菌基因组分开,基本上是采用两种办法：一是利用酶/弱去污剂部分裂解细菌，在抽提时只让质粒从细菌中释放出来，而不让基因组 DNA 从细菌中出来，从而将质粒和基因组 DNA 分开；二是利用 NaOH/SDS 完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来，再利用质粒和基因组 DNA 在变性/复性过程中的不同表现，将质粒与基因组 DNA 分开。,3、去除蛋白质及其他杂志,基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是，依据不同的细菌，不同的培养条件，以及操作时的精细程度等，杂质的残留量会不同。所以，通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。,经过上面的处理，沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了,2025/11/3 周一,将外源基因导入载体,PCR后电泳检测,回收缓冲液以及更换,Buffer,电泳检测,2025/11/3 周一,双酶切质粒、PCR并电泳检测,一、双酶切,双酶切反应(Double Digests)的分类：,1、同步双酶切：,同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳,缓冲液,是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见内切酶在不同,缓冲液,里的活性表及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和,反应时间,。,2、分步酶切：,如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。,3、使用配有特殊,缓冲液,的酶进行双酶切：,使用配有特殊,缓冲液,的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准,缓冲液,的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对,缓冲液,有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳,缓冲液,中进行酶切反应时，,反应速度,会减缓，因此需要增加酶量或延长,反应时间,。通过内切酶在不同缓冲液里的活性表可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。,2025/11/3 周一,二、PCR扩增质粒,变性温度与时间变性充分,：变性温度越高，时间越长变性就越充分。,变性温度、时间要适应：温度过高、时间过长又会影响 Taq DNA 聚合酶的活性，变性温度90-95 为宜。,退火温度与时间,：复性温度决定着 PCR 的特异性。温度越低复性越好，升高复性温度可以增加非特异性结合，大多数 PCR 反应的复性温度在 3570,一般低于引物Tm值的5左右。复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。,延伸温度与时间,：引物延伸温度一般为 72。延伸时间：72 时，核苷酸的合成速度为 35-100 个核苷酸/S，这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和 DNA 模板的性质。然而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。,2025/11/3 周一,三、琼脂糖凝胶电泳,原理,在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。,DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。,回收质粒更换Buffer并电泳检测,2025/11/3 周一,DNA测序：是对DNA分子的一级结构的分析。,2、取50ul过夜培养物接入3ml含氨苄青霉素的LB培养液，37C振荡培养2h以上，至对数中期,转接完成后，置于37，220r/min培养1小时左右。,2、化学方法：氯化钙制备法、氯化锂制备法,基本上是采用两种办法：一是利用酶/弱去污剂部分裂解细菌，在抽提时只让质粒从细菌中释放出来，而不让基因组 DNA 从细菌中出来，从而将质粒和基因组 DNA 分开；,要有足够的空间提供溶氧。,第三种方法是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。,由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。,选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。,2、化学方法：氯化钙制备法、氯化锂制备法,能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。,2、化学方法：氯化钙制备法、氯化锂制备法,检测OD600值，一般,在冰上将定容好的细胞以200l/支分装到预冷的EP管中，将EP管插入冰中。,检测分三种，首先是通过对标记基因的检测，通常用DNA分子杂交技术，来检验标记基因（目的基因）是否成功的导入受体细胞。,2、化学方法：氯化钙制备法、氯化锂制备法,选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。,四，酶连（目的基因与载体的连接）,第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；（EcoliDNA连接酶，来源于大肠杆菌，可用于连接粘性末端；T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低。）,第二种方法是，用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。,第三种方法是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。,这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。粘性末端DNA片段的连接 DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。平末端DNA片段的连接 常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。,2025/11/3 周一,四 感受态细胞制备及基因导入,制备感受态的方法,1、电击法,2、化学方法：氯化钙制备法、氯化锂制备法,氯化钙制备法：,原理：在,CaCl,2,溶液中，细胞会发生膨胀，,Ca,2+,会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞,仪器及设备,高速冷冻离心机、超净台、冰盒、冰若干等。,离心杯、移液器、吸嘴、,EP,管、自封袋等。,培养基及试剂,液体,LB,培养基、无抗平板、,Amp,平板、带,Amp,抗性的质粒、,100mM CaCl,2,溶液（含,15%,甘油）,2025/11/3 周一,1、准备工作,所有使用的移液器、吸嘴、离心杯、,EP,管以及装培养基的容器最好是专用。,洗涤容器时用水清洗干净，尽量不要用洗涤剂（洗涤剂一般含有表面活性剂而表面活性剂对感受态影响很大）,离心杯、,EP,管灭菌后置于,-20,预冷备用。,自封袋写上感受态名称、批号。,2、划板,从,-80,冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板上划线，并将菌种迅速放回,-80,保存。在划线板上做好相应标记，于,37,培养,16-20,小时,。,2025/11/3 周一,3、接种,在照过紫外的超净台中，用灼烧并冷却后的镊子夹住一个,20,l,枪头（或者灭过菌的牙签），挑取单克隆，放入装有,LB,的试管中，将试管置于,37,恒温摇床培养,10-12,小时,4、转接,将过夜菌按比例转接至准备好的液体培养基中。一般转接菌液与培养基体积比例不得大于,:,，即,转接菌液,:,培养基体积,:,培养基体积与三角瓶体积比不得小于,:,，即,培养基体积,:,三角瓶体积,:,要有足够的空间提供溶氧,。,2025/11/3 周一,转接完成后，置于,37,，,220r/min,培养,1,小时左右。检测,OD,600,值，一般,OD,600,值不要超过,0.6,，也不要低于,0.2,。,OD,值,是一个重要的参数，当,OD,600,值大于一定值时，菌体不会保持对数生长。同时，,OD,值大时菌体总量达，所以需要在这两个方面的影响中找到一个平衡点。不同的菌种所对应的值不一样,注：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作,2025/11/3 周一,5、,离心,将达到浓度的菌液在超净台中转移到事先于,-20,预冷的离心杯中。将装有菌液的离心杯置于冰上,10min,，使菌液迅速冷却,取出冷却后的离心杯，配平后对称放入冷冻离心机，,4000r/min,，,4,，离心,15min,。此时可以将,CaCl,2,溶液放入,-20,预冷（,CaCl,2,溶液不要放太早，否则会冻住，冷冻结晶后的,CaCl,2,溶液最好弃去）。不同菌种，离心的转速和时间可以酌情更改。,离心结束后，小心倒去上清，加入,0.2,倍菌液体积的预冷,CaCl,2,溶液。充分悬浮细胞。,配平后对称放入冷冻离心机，,4000r/min,，,4,，离心,15min,，充分除去上清，加入,0.05,倍菌液体积的预冷,CaCl,2,溶液。充分悬浮细胞。冰浴,30min,2025/11/3 周一,6、分装,在冰上将定容好的细胞以,200,l/,支分装到预冷的,EP,管中，将,EP,管插入冰中。分装完成后装入对应的自封袋，立即放入,-80,备用。,7、,检测（转化）,、转化的原理,溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，在,42,度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使,DNA,进入细菌细胞中,8、,检测结果评判,正常情况：转入质粒的平板和阳性对照长菌，阴性对照不长菌。,若阳性对照不长菌，说明细胞已经死亡；阴性对照长菌，说明已经被污染。应弃去整批感受态。,若对照组正常，转入质粒的平板不长菌，应重新再做转化，设如同前一次的对照组。,2025/11/3 周一,四 筛选阳性克隆及,DNA,测序,一、筛选转化子,1、菌落PCR：是直接以转化菌的单个克隆为模板，通过特异性引物或通用引物对插入载体的目的基因快速扩增，用于鉴定和筛选阳性转化菌的技术。,一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽，形状较规则，而假阳性和假阴性的PCR条带，多数不太亮，条带细而且不规则，有时拖尾,2025/11/3 周一,2、标记基因检测,标记基因的作用在于便于检测目的基因的情况。因为标记基因和目的基因同位于运载体上，要导入都导入，要表达则都会表达。一般标记基因的DNA序列是已知的，若选用抗氨苄青霉素基因，则可在目的基因导入后用氨苄青霉素来处理受体细胞，若无异常，则抗氨苄青霉素已合成，说明基因已得到表达。,检测分三种，首先是通过对标记基因的检测，通常用DNA分子杂交技术，来检验标记基因（目的基因）是否成功的导入受体细胞。,或者用DNA分子杂交技术，来看目的基因导入后是否成功转录出信使RNA。,最后可以用抗原-抗体检验，来验证导入基因是否成功表达,2025/11/3 周一,二、酶切、抽质粒,1、质粒的抽提,可通过外部条件的骤变、高压、酶解、超声破碎等方法使感受态细胞。,再通过高速离心，将质粒从破碎的细胞悬浮液中筛选出。,2、质粒的酶切电泳,将分离出的质粒进行酶切，酶切后如果导入质粒为成功将目的基因接入的质粒，则应该为两个基因片段。,进行琼脂凝胶电泳检测酶切后片段。,2025/11/3 周一,电泳后凝胶图片,实验成功情况下电泳条带显示应该为两条清晰且含其它杂质的条带,2025/11/3 周一,三,、DNA测序获得目的细胞,DNA测序：是对DNA分子的一级结构的分析。其基本原理是DNA的复制反应体系中需要存在DNA聚合酶、DNA模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链后，DNA聚合酶在引物的引导下在模板链上沿35的方向移动，dNTP按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3-OH末端,主要方法：双脱氧链终止法测序、化学降解法测序、自动化测序、基因芯片测序,双脱氧链终止法测序,基本原理：,通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序,2025/11/3 周一,用于终止反应的双脱氧核苷酸：,将,2,，,3,双脱氧核苷酸（,ddNTP,）参入到新合成的,DNA,链中，由于参入的,ddNTP,缺乏,3,羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，,DNA,合成反应将中止,。,2025/11/3 周一,五 诱导表达,目的蛋白质诱导表达及检测,SDS-PSGE凝胶电泳,1、挑取单菌落，接入3ml含氨苄青霉素的LB培养液，37C培养过夜,2、取50ul过夜培养物接入3ml含氨苄青霉素的LB培养液，37C振荡培养2h以上，至对数中期,3、吸出500ul未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，室温高速离心1min，沉淀悬浮于100ul -SDS凝胶加样缓冲液，100度加热3min，室温高速离心1min，冰上放置,4、在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L，37C继续培养3h，取500ul样品放于微量离心管中，室温高速离心1min,5、沉淀悬浮于100ul-SDS凝胶加样缓冲液，100度加热3min，室温高速离心1min，待全部样品处理完毕后上样,2025/11/3 周一,感谢观看,