基因工程的基本技术序列分析完整PPT.ppt

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3,不是,-OH,，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止,DNA,链的增长。,2,具体操作：,测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入,2,3-,双脱氧的,A,C,G,T,核苷三磷酸（称为,ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP,）,然后进行聚合反应。在第一个反应中,ddATP,会随机地代替,dATP,参加反应，一旦,ddATP,加入了新合成的,DNA,链，由于其第,3,位的,-OH,变成了,-H,所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的,DNA,链都是到,A,就终止了。,假如有一个,DNA,互补序列是,GATCCGAT,我们试着做一下,:,在第一个反应中由于含有,dNTP+ddATP,所以遇到,G,T,C,三个碱基时没什么问题,但遇到,A,时,掺入的可能是,dATP,或,ddATP,比如已合成到,G,下一个如果参与反应的是,ddATP,则终止,产生一个仅有,2,个核苷酸的序列,:GA,否则继续延伸,可以产生序列,GATCCG,又到了下一个,A,了,.,同样有两种情况,如果是,ddATP,掺入,则产生的序列是,GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生,GATCCGAT.,将得到如下结果：,1,产生的都是以,A,结尾的片段,:GA,GATCCGA,。,2,3,4,产生的都是以,C,结尾的片段,:GATC,GATCC,产生的都是以,G,结尾的片段,:G,GATCCG,产生的都是以,T,结尾的片段,:GAT,GATCCGAT,制得的四组混合物全部,平行,地点加在,变性聚丙烯酸受凝胶电泳,板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的,放射性自显影图谱,。从所得图谱即可直接读得,DNA,的碱基序列。,3,、技术路线：,制备单链模板,将单链模板与一小段引物退火,加入,DNA,多聚酶,4,种脱氧核苷酸,分别加入,少量,4,种,双,脱氧核苷酸,将,4,种反应产物分别在,4,条泳道电泳,根据,4,个碱基在,4,条泳道的终止位置读出基因序列,4.,双脱氧终止法测序反应体系,：,DNA,聚合酶,单链,DNA,模板,带有,3-OH,末端的,单链,寡核苷酸引物,Mg,2+,4,种,dNTP(dATP,dGTP,dCTP,和,dTTP),4,种,ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP,和,ddTTP),Sanger,法,DNA,测序的试剂,引物：通常由,20-23,个碱基构成，,G+C=12,，,A+T=8,到,11,，,Tm=60-68,，避免形成引物二聚体或形成发卡结构,模板,DNA,聚合酶,2,3-,双脱氧核苷三磷酸,（,2,3-,d,i,d,eoxy,n,ucleoside,t,ri,p,hosphate,ddNTP,）,dNTP,(4)放射自显影得到直读图象,因为ddNTP 3不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。,高负荷，1块胶可测16个样品；,（8）4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出,三 全自动激光荧光DNA测序,(1)用放射性核素标记待测DNA一侧末端,C反应-在高NaCl存在时，只有C与肼（联氨）发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换,（5）分4个反应体系，按上述程序（4个机制）化学处理，严格控制反应条件。,（2,3-dideoxynucleoside triphosphate,ddNTP）,ABI公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记单泳道法是用4种不同的荧光标记物标记4个反应的产物，4个反应在一个泳道中电泳分离。,聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子；,This figure shows the structure of a dideoxynucleotide(notice the H atom attached to the 3 carbon).Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction.Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.,（4）使标记片段变性为单链,将单链模板与一小段引物退火,C反应-在高NaCl存在时，只有C与肼（联氨）发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换,4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP),Sanger双脱氧链终止法(chain-terminator method),Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.,（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂），这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DNA片段。,(3)电泳 ACGT次序 高压电泳,四荧光标记的单泳道分离的测序原理,(4)放射自显影得到直读图象,同样有两种情况,如果是ddATP掺入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT.,（5）分4个反应体系，按上述程序（4个机制）化学处理，严格控制反应条件。,Sanger双脱氧链终止法(chain-terminator method),基因工程的基本技术序列分析,引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68，避免形成引物二聚体或形成发卡结构,Sanger双脱氧链终止法(chain-terminator method),单荧光标记四泳道分离和四荧光标记的单泳道分离。,同样有两种情况,如果是ddATP掺入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT.,5.,测序过程,:,(1),模板纯化与引物合成,(2)DNA,链的延长和合成阻断,四个试管分别加入,DNA,聚合酶,dNTP,标记引物,终止剂不同,ddA ddG ddC ddT,四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链,(3),电泳,ACGT,次序 高压电泳,(4),放射自显影得到直读图象,与,PCR,的不同之处？,思考,Maxam-Gilbert,化学裂解法,化学裂解,法,是,Maxam,和,Gilbert,等人,1977,年创建的，用来测定,DNA,序列,也简称作化学法。,某些试剂能修饰或破坏,DNA,链上特定核苷酸的碱基进而使,N-,糖苷键断裂，致使在,3,和,5,位上的磷酸二酯键断裂，戊糖脱落。,硫酸二甲酯可作用于嘌呤环，而联氨可作用于嘧啶环,二、,1.,化学裂解法测序的原理,(1),用放射性核素标记待测,DNA,一侧末端,(2),将标记,DNA,分为,G,、,A+G,、,C+T,、,C 4,个反应体系,(3),用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂,DNA,片段某种碱基中的任何一个，产生一组混合物,(4),电泳分离，放射自显影得到图谱，即可读出,DNA,序列,在,4,种反应体系中，化学试剂特异地断裂,DNA,的机制是：,G,反应,-,硫酸二甲酯（,DMS,）使,G,的,N7,甲基化，其后断开了,C8-C9,间的化学键，哌啶（也叫六氢吡啶）置换了被修饰,鸟嘌呤,与核糖的结合。,G+A,反应,-,甲酸使嘌呤环上,N,原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了,嘌呤,。,T+C,反应,-,肼断开了,嘧啶,环，产生碱基片段被哌啶置换。,C,反应,-,在高,NaCl,存在时，只有,C,与肼（联氨）发生反应，随后，被修饰的,胞嘧啶,被哌啶置换,碱基特异性修饰及裂解,反应体系,修饰试剂,碱基修饰反应,置换试剂,断裂点,G,硫酸二甲酯,鸟嘌呤甲基化,六氢吡啶,G,G+A,甲酸,脱嘌呤作用,六氢吡啶,G,和,A,C+T,肼,嘧啶开环,六氢吡啶,C,和,T,C,肼（加盐）,胞嘧啶开环,六氢吡啶,C,（,1,）,限制酶消化,待测,DNA,，得到长度为,100-200bp,的一组片段，纯化回收每,1,个片段作为测序材料,（,2,）,碱性磷酸酶处理消除,5,磷酸,（,3,）,多核苷酸酶催,32,P dNTP,标记,（,5-OH,）末端,（,4,）,使标记片段变性为单链,（,5,）,分,4,个反应体系，按上述程序（,4,个机制）化学处理，,严格控制反应条件,。（使得平均每,1,个,DNA,分子只有,1,个位置被断裂，这种断裂是随机的，如,G,反应，则在,DNA,链上任意位置,G,断裂），,这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂,DNA,链，但由于碱基位置不同，产生,1,组不同长度的,DNA,片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测,DNA,全长,（,6,）,电泳,（,7,）,放射自显影,（,8,）,4,个反应管统一阅读，,DNA4,个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测,DNA,全部核苷酸序列就可直接读出,2.,化学法测序的基本步骤,3.,化学法的优点,化学法一个明显的优点，即所测序列来自原,DNA,分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等,DNA,修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实验来研究,DNA,二级结构及蛋白质与,DNA,的相互作用,.,不需酶催化 不用合成引物 试剂价格低,5,和,3,端均可标记，可从两方向测同一,DNA,操作繁琐、费时、分辨率较低,三 全自动激光荧光,DNA,测序,DNA,自动测序仪的应用实现了,凝胶电泳,、,初始数据获取,、,碱基阅读,等步骤自动化。,自动测序仪的设计原理是采用荧光标记,DNA,片段，并用激光激活的,荧光探测系统,，检测序列反应的分离产物，读出电泳条带所示的碱基顺序。,分离产物有两种基本方法：,单荧光标记四泳道分离,和,四荧光标记的单泳道分离,。,四标记单泳道法：,ABI,公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记单泳道法是用,4,种不同的荧光标记物标记,4,个反应的产物，,4,个反应在一个泳道中电泳分离。每个反应产物用不同颜色的荧光标记进行区分，再用计算机将经过荧光探头的不同颜色顺序转变成测序信息。,这种同一泳道的分离避免了泳道间差异对测序的影响。,四荧光标记的单泳道分离的测序原理,荧光标记物,ddGTP,ddATP,ddTTP,ddCTP,聚合反应及产物,OH 3,P 5,5,P,HO,DNA,聚合酶，,dATP,，,dTTP,，,dGTP,，,dCTP,ddGTP,ddATP,ddTTP,ddCTP,5,P,ddATP,ddGTP,5,P,ddTTP,5,P,ddCTP,5,P,荧光化合物标记链终止法以荧光颜色为标记信号，每种,ddNTP,各有,1,种代表颜色；整个反应在一个试管中进行；当新合成的终止单链通过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。,注意：上机前变性，骤冷 使,DNA,变为单链,感谢观看,