基因工程和人类基因组全套ppt.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程和人类基因组,基因工程的基本操作程序：,制备目的基因；,选择适当载体；,构建重组载体；,转化受体细胞；,筛选转化细胞。,基因的本质是,DNA,遗传与基因,染色体结构,研究基因的本质（一）,有荚膜,致死 无荚膜,存活,肺炎链球菌（,Streptococcus pneumoniae,）感染实验一,Fredrik Griffith,1928,研究基因的本质（一）,肺炎链球菌（,Streptococcus pneumoniae,）感染实验二,Fredrik Griffith,1928,基因的结构、功能和调控,1,、,DNA,结构：,华生,(,Watson,),和克里克,(,Crick,),DNA,双螺旋模型（,1953,）,DNA,半保留复制（,1953,）,获,1962,年诺贝尔奖,基因工程的基本过程,切,从供体细胞中分离出基因组,DNA,，用限,制性核酸内切酶将目的基因切开；,接,用,DNA,连接酶将目的基因片段接到载体,分子上，形成重组分子；,转,借助于细胞转化手段将重组,DNA,分子导,入受体细胞中；,检,筛选和鉴定转化细胞，获得外源基因高,效稳定表达的基因工程菌或细胞株。,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,制备目的基因的,从,cDNA,文库或基因组文库中分离；,PCR,（,Polymerase Chain Reaction,）法；,mRNA,差异显示分离目的基因；,化学合成法；,PCR,反应,PCR,由变性,-,退火,-,延伸三个基本反应步骤构成：,模板,DNA,的变性：模板,DNA,经加热至,93,左右一定时间后，使模板,DNA,双链,DNA,解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,模板,DNA,与引物的退火,(,复性,),：模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降至,55,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合；,引物的延伸：,DNA,模板,-,引物结合物在,Taq,DNA,聚合酶的作用下，以,dNTPs,为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板,DNA,链互补的半保留复制链。重复循环变性,-,退火,-,延伸三过程，就可获得更多的,“,半保留复制链,”,，而且这种新链又可成为下次循环的模板。,每完成一个循环需,2,4 min,，,2,3 h,就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR,反应示意图,引物,引物,*,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定,PCR,反应结果的关键。,*引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,3,5,5,5,PCR,技术,基因组,3,3,3,变性、退火,延伸,变性、退火、延伸,3,PCR,原理图,假单胞菌,NADH,脱氢酶基因,721 ACTTCATGCGGGGGCGCAGATACCGGTTGAGGCCGTCGACGATGACGGT,CAT,GCCGGTTT,781 TC,AAGG,CGCC,ATG,AATGGCCAGCTGGTGCATGCGATAGAGCGAGGCATAGAACAGCTTGG,841 CCAGGCGCCCCTCGATGAACAGGCTGCGTGCCGAGGCGCCGCGCATCAGGCTGCCCACGG,901 CATCGAAGTGCGCCAGCGAGATCAGCGAGCCGCGATCGCGGAAGACGAAATCCTTGAGGG,961 GCTTGCCGTCCATTGCCGCGCGCAGGTTGTGGTACAACAGGCTGGCTTGCTGATGCGCGG,1021 CCTGGGCGCCAGGCGGTACGCGCTTGTCGTCGGGTTGCGGGCAGGAGGCGCAGTCGCCCA,1081 AAGCGAAGATGCGATCGTCGTCGATGCTCTGCAGGGTCTGATGCACCTTGAGCTGATGAT,1141 TGCGCTCGGTGGAAAGCCCCAGTTCGGACAGAAATGCCGGCGCGCGTATGCCGGCGGCCC,1201 AGACGTTGAGGTCGGTGGCAATGCGCGTCTCGTCGGCGGTGACGAAACCGTGCTCGTCGG,1261 CGCAGGTCACGCGGGTGTCGACATGGATCTGCACGCCCAGGCGTTCCAGCTCCTGGTGCA,1321 CGGCGCGGCTGATGCGCTCGGGCAGCGCCGGCAGGATGCGCGGTGCTGCCTCGATGAGGT,1381 GGATCTCCAGCTTGCCGCTGTCCATGGCGGTGAACCCGTAGCTGTGCAGCATCTTGGAGG,1441 CGCCGATCAGTTCGGCGGCCAGCTCGACGCCGGTGGCACCGGCACCGACGAGCCCCACGC,1501 TCAGGTTGGGATGGGTGCGCCGCTCGGGATCGCTGTACCGCAGGAAGGTGTTGAGCATGT,1561 CCTGGCGGAAGCTTTCGGCCTGTTGCGGGCTGTCGATGAAGTGGCTGTGCTTGGCCACGC,1621 CCGGGGTGCCGAAGTCGTTGGAGACGCTGCCCAGCGACATCACCAGGTAATCGTACTCCA,1681 GCGTGCGCGCCGGCAGGATCACGACGCCGTCGTCGTCGATGATCGGCGCCAGCGTGATGG,1741 TGCGGTTGTCGCGGTCGAGGTTGCTGAGCGTGCCGCGTTGAAAGCGGTAGCCGTGCGCCT,1801 TGGAATGCCCCTGGTAGGACACTTCATCGAGGCTGGAATCGAGCACGCCCGTGGCCACTT,1861 CATGCAGCAGGGGCTTCCAGATGTGCGTGGCGTTGCGGTCGACCAGAACGATCTCGGCGC,1921 GTTGGCGCTTGCCGAGCTTGCGCCCCAGGCGGGTGACCAGTTCGAGGCCACCTGCGCCTC,1981 CCCCGACCACCACGATGCGCGGTGTAGACATGATGGACTCCCGAAGAACGAAACATGGAA,2041 AAAGGGTGTCGCCAGGGTCGGGCATCGCAGCGAAACGCCAAGGTACGAGGCGCCTGGGAA,2101 GGCGTGTCGTGACGCGGGGGCGCTGGCGCCTGGTGTCGGCGACGTCTGCGTA,TAG,AATAA,PCR,扩增一个约,1.3kb,的基因,1904bp,1584bp,1375bp,947bp,831bp,M 1,载体（,vector,）是由在细胞中能够自主复制的,DNA,分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的,DNA,片段与其连接，而进行复制。,常用载体：质粒、病毒；,基因工程载体,理想载体的基本条件,：,可转移性,合适的复制位点,多克隆位点：广泛、特异,选择标志，便于筛选和鉴定,分子较小，可容纳较大的外源,DNA,存在于细菌染色体外的小型环状,DNA,分子,;,具有,自我复制,功能,;,带有抗性基因及表型识别等,遗传性标记物,;,经改造后具有,多克隆位点,;,质 粒,不同的,DNA,分子间发生共价连接形成重组,DNA,分子。,重组,DNA,质粒,DNA,基因片段,基因重组,限制性核酸内切酶识别特定碱基序列,磷酸二酯键的形成,DNA,连接酶,DNA,连接酶,DNA,连接酶,目的基因与载体的连接,重组质粒的酶切分析,4 268 bp,3 530bp,1 584bp,1 375bp,947bp,M 1 2 3,通过物理，化学或生物的方法将重组,DNA,转入受体细胞。,重组,DNA,导入受体细胞,受体细菌,50-100,mmol/LCaCl,2,感受态细菌,重组载体转入细菌,重组载体,CaCl,2,处理,-,半乳糖苷酶法筛选转化子,白色菌落提示有外源基因插入,抗,Amp,质粒,宿主细菌,含,Amp,培养基,含重组质粒大肠杆菌的蛋白质,SDS-PAGE,电泳图谱,8 7 6 5 4 3 2 1 M,94kDa,67kDa,43kDa,30kDa,20kDa,基因工程菌的构建与生产,分子筛,亲和柱,离子交换,抗原抗体,目的蛋白,目的蛋白的分离纯化,基因载体,目的基因,质粒 噬菌体 病毒,PCR cDNA,人工合成 基因文库,限制性内切酶,有切口的载体,有切口的目的基因,DNA,连接酶,重组体,转化 转染 体外包装,带重组体的宿主细胞,表型筛选 电泳法 核酸杂交 免疫学方法,目的基因的表达,1,、基础理论研究,：,基因的结构与功能。,基因的人工定点突变。,人类基因组计划,基因工程的应用,疾病的诊断：,疾病的预防：基因工程疫苗。,疾病的治疗：基因工程药物、基因治疗。,2,、医学领域中的应用：,基因工程方法生产蛋白质药物,3,、植物基因工程技术及应用,植物基因工程的受体是植物细胞，主要在作物抗病虫害、抗逆性、提高品质、提高产量、医药等方面应用。至,1998,年,4,月，世界各国批准进行的大田实验已达,4387,项。,植物基因工程的优点,可以赋予植物一些通过其它途径几乎不可能获得的新性状。,可以更有目的的改良植物性状。,可以缩短培育新品系的周期。,增产：,使作物产量提高,5%,15%,；,不用或少用农药：,1081 AAGCGAAGATGCGATCGTCGTCGATGCTCTGCAGGGTCTGATGCACCTTGAGCTGATGAT,植物基因工程的受体是植物细胞，主要在作物抗病虫害、抗逆性、提高品质、提高产量、医药等方面应用。,从cDNA文库或基因组文库中分离；,*引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；,M 1 2 3,2007年5月在休斯敦的贝勒大学举行的庆祝仪式上，79岁的沃森获得了一张储存着自己全部基因组序列的DVD光盘。,HGP的任务与进展,1801 TGGAATGCCCCTGGTAGGACACTTCATCGAGGCTGGAATCGAGCACGCCCGTGGCCACTT,2005年，年产值达350亿美元。,我国的彩棉产量已占到世界彩棉生产总量的1/3，成为全球最大的彩棉生产国；,基因工程方法生产蛋白质药物,1381 GGATCTCCAGCTTGCCGCTGTCCATGGCGGTGAACCCGTAGCTGTGCAGCATCTTGGAGG,细胞培养 转基因牛,“线粒体DNA”是只通过母系一脉传递的遗传基因，男性也能从母亲那里继承“线粒体DNA”，却无法将它遗传给自己的后代。,781 TCAAGGCGCCATGAATGGCCAGCTGGTGCATGCGATAGAGCGAGGCATAGAACAGCTTGG,入受体细胞中；,转基因植物研究进展,自,1983,年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，短短十余年间，植物基因工程的研究和开发进展十分迅速。国际上获得转基因植株的植物已达,100,种以上，包括水稻、玉米、马铃薯等作物；棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物；番茄、黄瓜、芥菜、甘蓝、花椰菜、胡萝卜、茄子、生菜、芹菜等蔬菜作物；苜蓿、白三叶草等牧草；苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓等瓜果；矮牵牛、菊花、香石竹、伽蓝菜等花卉；以及杨树等造林树种。应该说转基因植物研究取得了令人鼓舞的突破性进展。,我国的转基因植物,1996,年我国投入研究和开发的转基因植物仅为,47,种、涉及各类基因,103,个。,目前，我国正在研究和开发的各种生物物种已超过,100,种，涉及动物、植物、微生物基因达,200,多个，若干作物品种已具备了产业化条件。,就整体研究水平而言，我国在发展中国家处于领先地位，一些领域已经进入国际先进行列。我国是世界上继美国之后第二个拥有转基因抗虫棉自主知识产权的国家。,2004,年我国的生物技术棉花种植面积已达到,370,万公顷。由于节水、抗虫、节约劳动力的投入，每年为农民增收,50,亿元人民币。我国的彩棉产量已占到世界彩棉生产总量的,1/3,，成为全球最大的彩棉生产国；,2,全球转基因作物播种面积增长,12%,耐贮藏西红柿,通过反义,RNA,技术，阻断果实成熟时乙烯的生成，延长果实的贮藏期。,动物基因工程,培养出了包括猪、牛、羊、马、鸡、鱼等多种转基因动物，涉及的基因有生长激素基因、抗冻基因、抗病毒基因等。,转,生物反应器,利用乳腺生物反应器生产贵重药物：,红细胞生成素（肿瘤化疗的辅助药物）；,铁蛋白（促进铁的吸收）；,抗胰蛋白酶（治疗囊性纤维化及肺气肿）；,凝血因子,VIII,及,IX,（治疗血友病）；,人血清白蛋白（治疗烧伤）；,2005,年，年产值达,350,亿美元。,利用细胞培养和转基因牛生产医用蛋白的成本及产量比较,细胞培养 转基因牛,培养液成本,/,元,.L,-1,320400 24,培养液中的蛋白质含量,/mg.L,-1,1050 1 00010 000,每克终产品的成本,/,元,.g,1,6 40040 000 0.154.00,人类科学史上的三大计划之一,人类基因组计划（,HGP,）,1986,年,3,月美国生物学家、诺贝尔奖得主,Dulbecco,首先提出,肿瘤研究的一个转折点：人类基因组的全序列分析,1990,年，美国国会正式批准，,1990,年,10,月,1,日开始实施，计划耗资,30,亿，历时,15,年。,HGP,产生的背景,Celera,遗传公司的竞争,1998,年,5,月一批科学家在美国罗克威尔组建,Celera,遗传公司，计划投入,3,亿美元，到,2001,年绘制出完整的人体基因图谱，与国际人类基因组计划展开竞争。,基因组与基因,基因组：,维持基本生理功能的一整套基因，即配子所含的基因总和，人,23,条染色体上的所有基因。,HGP,的任务与进展,15,年内，完成,23,对染色体上,30,亿个核苷酸的测序并识别其中的基因。,2001,年,2,月,12,日，由美国、日本、德国、法国、英国和中国组成的研究机构及美国塞莱拉公司联合宣布对人类基因组的初步分析结果：,人类基因组有,31.6,亿个核苷酸，,33.5,万个基因；,基因在染色体上不是均匀分布的，有些区域有很多的基因，有些区域（约,1/4,）则象“荒漠”；这意味着原来被认为的“垃圾,DNA”,的功能应该被重新认识；,不同种族有,99.99%,的相同基因，并不比同一种族不同个体之间的差异大。,人与黑猩猩,DNA,序列差异为,1.44%,2004,年,5,月,27,日,英国,自然,杂志发表了我国科学家参与完成的人与黑猩猩比较基因组学研究取得的重大成果。科学家发现,人与黑猩猩,DNA,序列差异为,1.44%,。,人与黑猩猩染色体比较,Nature,公布精度大于,99%,人类基因组完成图,国际人类基因组计划合作组织,2004,年,10,月,21,日在英国,自然,杂志上宣布，一张精度大于,99%,、误差小于十万分之一的人类基因组完成图已成功绘就。经过多国科学家近,3,年的精心“修纂”，原本（,2001,年）遗漏了,15,万个细节的“人类生命天书”几近完美地完成。,完成图显示，庞大的人类基因组似乎只包含,2,万至,2.5,万个基因，大大少于此前估计。,几种生物的基因数目比较,染色体测序的策略,沃森：“能看到自己的基因组图谱，我感到非常兴奋。”,2007,年,5,月在休斯敦的贝勒大学举行的庆祝仪式上，,79,岁的沃森获得了一张储存着自己全部基因组序列的,DVD,光盘。沃森成为世界第一份完全破译的,“,个人版,”,基因组图谱的拥有者。由于采用了新的测序技术，不但只用了不到,2,年的时间，而且仅花费了约,100,万美元。,美国,Celera,公司创始人温特尔的基因图谱成功绘出,2007,年,9,月克雷格,温特尔的详细基因组序列被公布，这是世界上第一个个体的二倍体基因组序列。发现温特尔的两组染色体序列存在,0.5%,的较大差异。他的,APOE,序列和,SORL,1,基因均表明他存在较高的罹患早老性痴呆病和心血管病的风险；,人类,X,染色体,(1),研究人员在,2005,年,3,月,17,日在,nature,杂志上公布了,X,染色体上,99.9,基因的测序。它包含有多达,1098,个基因，其中只有,54,个在,Y,染色体上有相应功能的等位基因。,Y,染色体上仅有大约,78,个基因。,人类,X,染色体,“,线粒体,DNA”,是只通过母系一脉传递的遗传基因，男性也能从母亲那里继承“线粒体,DNA”,，却无法将它遗传给自己的后代。也就是说，如果一个女性生下的全都是儿子，她的“线粒体,DNA”,遗传链将因此终止。英国牛津大学人类遗传学教授西基斯称，“线粒体,DNA”,一般很难发生改变，平均要过,2,万年“线粒体,DNA”,才会发生微小的变异。,英国牛津大学人类遗传学家通过,10,多年的,DNA,研究发现，每个线粒体,DNA,相同的人都是数万年前同一个女性的后代。,现代,97%,的欧洲人都是,14.5,万年前,7,个女性的后代，她们被称为欧洲的“宗族母亲”。,人类,Y,染色体,Y,染色体作为决定男性性别的染色体，出现在,3,亿年前，然后在漫长的演变过程中失去了像其他染色体那样能够去除损坏,DNA,的机能，而且使得数百个原始基因都无法产生作用。有科学家怀疑由于在漫长的进化过程中,Y,染色体遗失了部分基因，因此很有可能会在,5001000,万年后彻底消失。,1600,万个成吉思汗的后代,2003,年，泰勒史密斯和牛津大学的科研人员从成吉思汗时代版图内及其周边地带收集到,16,个群体的样本。结果发现，多达,8%,的男性基因中，拥有相同的,Y,染色体片段。,这个极高的表达率是极不寻常的，表明它们可能是从同一个祖先那里继承来的。科学家通过检测,Y,染色体的微小变化得出结论：他们共同的祖先都生活在,12,到,13,世纪之间。将这些基因变化的证据和成吉思汗,12,世纪建立的王国版图联系起来，研究者们推断这就是成吉思汗的,Y,染色体片段。,现在大约有,1600,万人是成吉思汗的后代。,谢谢观看,