流式细胞术——交大版.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2014/11/11,#,流式细胞术,-,原理、操作及应用,生物化学与分子细胞生物学系 流式实验室,地址：西,7,楼,107,室,电话：,63846590-776423,主要内容,一、流式细胞仪结构和原理,流式细胞术简介,流式细胞仪的光信号检测,流式细胞仪的结构组成,荧光抗体的选择,流式细胞术数据的存贮、显示与分析,二、流式细胞术操作与技巧,三、流式细胞术在生物医学中的应用,1.1,流式细胞术简介,流式细胞术（,F,low,C,yto,m,etry,，,FCM,）,是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞,(,或生物学颗粒,),的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。,流式细胞仪（,Flow Cytometer,）,是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,流式细胞术的特点,检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；,检测参数：多参数；,检测特点：单细胞水平分析；,检测速度：高速，最高达上万个细胞,/,秒；,检测结果：精度高、准确性好；,可对目标细胞进行分选；,流式细胞仪的分类,分析型,流式细胞仪,细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。,分选型,流式细胞仪,既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；,进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。,流式细胞仪的发展及商品化,1934 Moldavanl:First try(,固定式细胞分析,-,流动式,),；,1953,Crosland-Taylor:,鞘流系统,(,解决难题,),；,1956 Coulter,原理,(,血细胞计数器,),；,1965 Kamentsky:,分光光度计定量细胞成分和散射光应用；,1967 Kamentsky,等设计了细胞分选的装置；,1969 Vandilla,等,:,第一台荧光检测细胞计,(,鞘流聚焦、激光,),；,1972,斯坦福大学,:,研制出荧光激活细胞分选仪,(FACS),；,1973 BD,公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流,式细胞仪,-FACS,。,1975 Kohler,和,Milstein:,单克隆抗体技术,(,促进流式发展,),。,1.2,流式细胞术光信号检测,光信号的类型,散射光信号,：,与标记荧光素无关，,是细胞的固有参数。,前向散射光,(forward scatter,FSC);,侧向散射光,(side scatter,SSC).,荧光信号,自发荧光,(,细胞色素因子、核黄素,),：微弱,特异荧光：标记的荧光素分子发出,的荧光，比自发荧光强很多倍。,1.2.1,散射光信号,（一）前向散射光,FSC,FSC,信号方向与激光束平行，偏离度一般在,1-6,度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的,体积大小和活力,。,（二）侧向散射光,SSC,SSC,方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称,90,度散射光，其信号强度反映,细胞内部颗粒度和精细结构的变化,。,（三）散射光的作用,实验中，常利用,FSC,和,SSC,这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。,粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,红细胞、死细胞和碎片,死细胞,或碎片,粘连细胞,肿瘤细胞株,FSC/SSC,散点图,死细胞,加药处理后,FSC/SSC,散点图,通过,FSC/SSC,散点图，,gate,出目标细胞进行分析。,1.2.2,荧光信号,（一）荧光：,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。,发射波长,(,荧光波长,),Emission,wavelength,激发波长,Excitation,wavelength,（二）常用荧光素,499nm,蓝色荧光（,Blue,）,；,500-549nm,，绿色荧光（,Green,）,；,550-584nm,，黄色荧光（,Yellow,）,；,585-615nm,，橙色荧光（,Orange,）,；,616-700nm,，红色荧光（,Red,）,；,700nm,，远红外荧光（,Far-Red,）,。,标记抗体的荧光素,荧光素分子,激发光波长,（,nm,）,发射光波长,（,nm,）,中文名,FITC,490,520,异硫氰酸荧光素,PE,488,575,藻红蛋白,PerCP,490,675,多甲藻叶绿素蛋白,APC,650,660,别藻青蛋白,PE-Cy5,496/546,670,藻红蛋白,-,花青素,5,PE-Cy7,496/546,767,藻红蛋白,-,花青素,7,Alexa,Flour 488,495,519,Alexa Flour 647,650,665,核酸荧光染料,PI,（碘化丙啶,535,623,）,可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于,DNA,分析，需要用,RNase,处理细胞排除,RNA,对,DNA,荧光定量的影响；,PI,不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。,7-AAD,（,7-,氨基放线菌素,D 545,647,）,以插入的方式与,DNA,链的,G-C,碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。,DAPI,（,4,4,6-,二脒基二苯基吲哚,358,456,）,可以非嵌入方式与,DNA,链上的,A-T,碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的,DNA,定量染料。,Hoechst,（,343,450,）,常见为,Hoechst33342,和,Hoechst33258,，非嵌入的方式与,DNA,链上的,A-T,碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞,DNA,定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。,PY,（派若宁,560,573,）,RNA,染料，能进入活细胞。,AO,（吖啶橙,509,525,）,DNA,、,RNA,染料，染色后,DNA,呈黄绿色荧光，,RNA,呈橙黄色荧光，可进行,DNA/RNA,双参数分析。,1.3,流式细胞仪的结构组成,液流系统,流动室,液流驱动系统,光学系统,激发光源,光束收集系统,电子系统,光电转换器,数据处理系统,细胞分选系统,喷嘴,电偏转板,样本收集器,1.3.1,液流系统,鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液,(sheath),。,流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在,10-20um,，避免了多个细胞重叠进入检测区。,鞘液,鞘液,细胞流,激光照射点,流体动力学聚焦示意图,1.3.2,光学系统,（一）,激发光源：激光器,气体激光器：氩离子,(488nm,、,355nm),、氦氖,(633nm),、氪离子,(647nm),、氪氩,(568nm),；,染料激光器：如氩离子激光泵浦的,Rhodomin 6G,水溶液染料激,光器，发出,550-650nm,可变波长激发光；,半导体激光器,：,价格低、结构简单、寿命长。,BD,的,FACS Calibur,已采用,635nm,半导体激光器。,激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。,现在仪器常配有仪器选配,2-4,根激光器，波长多为,488nm,、,633nm,和,355nm,、,405nmUV,；,（二）光收集系统,滤光片,的组成,长通滤片,(LP),：只允许特定波长以上的光束通过；,短通滤片,(SP),：只允许特定波长以下的光束通过；,带通滤片,(BP),：只允许一定波长范围内的光束通过。,Long,pass Short pass Band pass,460,500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,460,500 540,460,500 540,全反射光路,FACS Aria,流式细胞仪器信号检测系统,PE-Cy7,PerCP-Cy5.5,PE-TexasRed,PE,FITC,SSC,1.3.3,电子系统,光电检测器,将光信号转换成电子信号。,前置放大电路,将信号等比例放大，输出电脉冲信号。,模数转换器,将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。,数据处理系统,计算机系统数据采集、分析。,（一）,光电检测器,(photodetector),光电二极管,(photodiode),光灵敏度低，测定强信号（,FSC,）；,光电倍增管,(photomultiplier,PMT),光灵敏度高，测定弱信号（,SSC,FL1,FL2,FL3,FL4),。,PMT,前向散射光,光电二极管,（二）,电信号两种放大方式,由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用,线性,或,对数,两种方式。,线性,(linear;lin),对数,(logarithmic;log),一般,FSC,和,SSC,变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。,（三）,荧光信号的面积,A,、宽度,W,和高度,H,细胞通过激光检测区域时，产生的荧光信号被光电倍增管接收，形成脉冲信号。,荧光信号脉冲形成示意图,Time,Volts,Pulse Area,Pulse Height,Pulse Width,0,荧光信号脉冲的面积、高度和宽度,Width=Area/Height,一个信号脉冲有高度、面积和宽度。,光信号电信号数字信号,通道,(channel),一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管,/,倍增管，就有多少个通道：,散射光通道,:FSC,通道和,SSC,通道；,荧光通道,通道命名方式：,以,FL(fluorescence),加数字命名，如,FL1,、,FL2,、,FL3,等。,以该通道接收的主要荧光素命名，如,FITC,通道、,PE,通道、,APC,通道等。,For example,：,FACSCalibur,有,488nm,和,633nm,两根激光器，,488nm,能检测,FSC,、,SSC,、,FL1(FITC),、,FL2(PE),、,FL3(PerCP),，,635,能检测,FL4(APC),，代表,Calibur,有,6,个通道，最多能同时检测,4,个荧光，,6,种参数。,1.3.4,流式分选,电荷式,分选,超声振动器,(15-100kHz),液流充电系统,高压偏转板,收集装置,(,流式管、培养板,),lasers,断裂点,(,充电,),高压偏转板,四路分选原理,电荷式分选装置,分选指标,分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、需要收集的细胞数。,需要细胞数,目标细胞所占比例,(%),1,5,50,10,4,1.7 min,20,s,2 s,10,5,16.8 min,3.4 min,20 s,10,6,2.8 h,3.4 min,3.4 min,10,7,1.2,天,5.6 h,34 min,分选时间表,(,机器流速,10000,个,/s,时,),分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。,分选纯度,指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达,99%,以上。,分选收获率,是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。,分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。,富集模式,(enrich mode),纯化模式,(purify mode),单细胞模式,(single cell mode),1.4,荧光抗体的选择,A,根据流式细胞仪选择抗体,流式细胞仪能检测的通道数,(,由激光器种类、数量和使用的光学滤片决定,),。如,FACSCalibur,：,多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。,FACSCalibur,常用四色搭配：,FITC,、,PE,、,PerCP,、,APC,。,488,FL1,BP,530/30,515-545,FITC,、,AF488,FL2,BP 585/42,564-606,PE,FL3,670,LP,670,PE-Cy5,、,PerCP,、,PE-Cy7,635,FL4,BP 661/16,653-669,APC,、,AF647,B,根据抗原表达强弱合理选择抗体,不同的荧光素强度有所不同；,高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原：,CD4-FITC,、,CD25-APC,、,Foxp3-PE,C,选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调节补偿。,CD5,1.5 FCM,数据存储、显示与分析,标准的,FCM,数据采用,列表模式（,list mode,）,，记录了每个细胞的所有参数的信息。,每个细胞检测,5,个参数，那么获取,10000,个细胞，容量为,510000,（字或双字）。,Event#,FSC,SSC,FL1 FITC,FL2,PE,FL3,APC,1,100,500,10,650,4,2,110,505,700,700,6,3,90,480,720,670,10,4,95,490,15,720,15,FCM,数据显示方式,单参数直方图,(Histogram),双参数数据显示：,散点图,(Dot Plot),伪彩图,(,Pseudo-color Plot),等高线图,(Contour Plot),密度图,(Density Plot),假三维图,(Pseudo 3D Plot),三维图,(3D Plot),常用分析软件,CellQuest,Diva,FlowJO,WinMDI,FCS Express,直方图,Histogram,细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数。,Event#,FL1 FITC,1,10,2,700,3,720,4,15,0101001000,Counts,FITC,荧,光强度,横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。,DNA,倍体分析,抗原表达分析,Overlay,图,散点图,散点图中每个点代表一个细胞，,X,轴与,Y,轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观。,FL1,FL2,散点图和伪彩图,等高图和密度图,等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。,密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。,假三维图和三维图,SSC-Height,FSC-Height,Counts,SSC,CD45,CD14,设门与数据分析,门,(Gate,，简写,G),是流式细胞术中的一个重要术语，,FCM,数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。,椭圆形,圆形,矩形,任意形状,R(Region,，区域,),。门可以是单一区域,(G=R1),，也可以是几个区域组合在一起：,G=R1 and R2;G=R1 or R2;G=R1 not R2,。,十字门,线性门,二、流式细胞术操作与技巧,流式细胞术操作流程,：,培养,细胞,血液骨髓,新,鲜组织,石蜡包,埋,单细胞悬液,制备,荧光染色,上机检测,表型测定,细胞分选,继续培养,FISH,PCR,统计学分析,2.1,单细胞悬液制备,2.2,免疫荧光标记,2.3,对照的设置,2.4,光谱重叠与补偿,2.1,单细胞悬液制备,2.1.1,新鲜实体组织的样本制备,对于不同组织来源的实体组织和实体瘤标本，应该根据各自特点选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞,产量高,、,损伤小,的目的。常用方法有：,酶消化法,机械法,化学试剂处理法,酶消化法,：,根据分散组织类型来确定使用的酶类：,胰蛋白酶,水解酯键、肽键；,胶原酶,降解几种分子类型的胶原；,溶菌酶,水解糖蛋白、肽的糖苷键；,弹性蛋白酶,消化糖蛋白、弹性蛋白的纤维。,将新鲜组织置于离心管中，加入,1-2ml,酶消化,20-30min,（恒温,37,或室温），间断振荡或吹打；,终止消化，收集细胞悬液，,300,目尼龙网过滤，除去细胞团块，低速离心除去细胞碎片；,将制备好的单细胞悬液进行荧光标记或保存备用。,注意,：,酶的使用浓度、温度、消化时间、酶活性的,pH,值。,机械法特点,：易造成细胞碎片和团块，实际操作时，应注意碎片和团块的去除，常与其他方法（如酶消化法）配合使用,。,组织解离器,机械法,：,有,剪碎法,、,网搓法,、,研磨法,等。,利用机械方法、物理方法给予组织交大的压力，使细胞从组织间分散开来。,化学处理法,：,作用原理：将组织细胞间起黏着作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散开来，常用试剂有,EDTA,、,EGTA,、,TPB,等。,EDTA,是一种螯合剂，可以和组织间的钙、镁离子形成螯合物，实际运用中常采用螯合物加酶法（主要是胰蛋白酶）。,特点,：用化学法细胞存活率低、细胞产额低，细胞碎片和聚集量不稳定。,机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量，注意去除细胞碎片和团块以免影响,FCM,结果，如低速离心去碎片、尼龙网过滤团块等。,酶消化法、化学试剂处理法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成分的不良影响。,根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，最终要求细胞呈单个分散状态；细胞碎片、团块尽量少；细胞活性不受到明显损伤，保证下一步荧光染色。,2.1.2,石蜡包埋组织样本制备,切片：将石蜡组织切成,50um,厚的组织片,4-5,片，放入,1,试管中；,脱脂：加入二甲苯,3-5ml,脱脂，室温下,1-2,天，脱净后弃二甲苯；,水化：依次加入,100%,、,95%,、,70%,、,50%,梯度乙醇,5ml,，每步,10 min,，去乙醇后加入蒸馏水,3-5ml,，,3-5min,后弃水；,消化：加入,5ml 0.5%,胃蛋白酶（,pH 1.5-2.0,），,37,恒温水浴,30 min,，每隔,5-10min,振荡一次；,终止消化：加冷的,PBS,或生理盐水终止消化；,过滤：用,300,目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第二次消化；,收集细胞悬液：将过滤液离心沉淀，再用,PBS,漂洗,1-2,次，低速离心沉淀去除碎片；,根据实验目的标记荧光抗体，或保存细胞备用。,2.1.3,血液、骨髓样本制备,外周血单个核细胞,PBMC,的分离,血液层,Ficoll,层,血浆层,PBMC,Ficoll,层,红细胞层,离心前,离心后,Ficoll,密度梯度离心法分离,PBMC,注意：,由于多核粒细胞比较大，粒细胞沉降在红细胞层，所以该法不适合粒细胞研究；,该法操作过程中可能丢失一些有意义的细胞或细胞亚群，所以临床上一般不主张分离血液或骨髓的单个核细胞。,红细胞裂解液去除红细胞,原理：红细胞裂解液成分为低渗的,NH,4,Cl,溶液，利用双凹型的红细胞膜抗性差，白细胞膜抗性比较好的特点，加入低渗透压的红细胞裂解液时，红细胞膜胀破，而白细胞膜不受影响，从而达到去除红细胞的目的。,2.1.4,培养细胞单细胞悬液制备,2.1.5,体液脱落细胞样本制备,悬浮生长细胞,吸管反复吹打,贴壁生长细胞,消化处理,离心获得单细胞悬液,洗脱液,尿液,胸腹水,离心收集细胞，用生理盐水或,PBS,洗涤,3,次,300,目尼龙膜过滤后离心沉淀去上清,单细胞悬液,FCM,可检测下列细胞成分：,表面标记物,胞浆标记物,核内标记物,可溶性成分,2.2,免疫荧光染色,黏附因子,表面受体,细胞因子,分泌到胞外的细胞因子,胞内抗原,核酸含量,核内抗原,荧光素偶联抗体,抗体上偶联荧光素,(FITC,、,PE,等,),，通过抗原抗体反应让目标细胞特异性的带上荧光。,染色过程即抗原抗体反应过程。,荧光染料,/,荧光化合物,PI,、,DAPI,等插入核酸链中；,CFSE,和蛋白质共价结合；,Annexin V-FITC,检测凋亡。,荧光蛋白,如,GFP,，不需要染色，直接检测。,免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。间接标记的方法难以进行多色标记，而且操作复杂、信噪比高，所以一般首先直标荧光抗体。,荧光抗体,荧光二抗,第一抗体,直接标记,间接标记,一般检测时，获取,1,2,万个细胞，标记,0.5,110,6,细胞即可。,下述情况细胞量需相应增加：检测胞内,/,核内抗原，离心次数多；细胞周期乙醇固定损失细胞多；检测细胞在标本中比例低,0.5,110,6,个细胞,孵育体积,50-100ul,上机体积,200-500ul,终浓度约,110,6,个,/ml,加染料,洗涤后补加液体,细胞表面抗原标记,表面抗原分析是流式应用中最广泛的，标记步骤也相对简单。,标记：取,0.5,110,6,细胞，加入适量抗体,(,根据抗体说明书,),，充分混匀后,(,总体积,50-100ul),，,4,避光孵育,10-30min,。,洗涤：加入,1ml PBS,洗液，,300g,离心洗涤,5min,。,上机检测：弃去上清后加入,200-500ul PBS,，重悬细胞后立即上机检测；如不能及时上机检测，则加入同样体积的,1%,多聚甲醛，混匀后置于,4,冰箱内保存，一般不超过,24h,。,胞内抗原荧光标记,细胞内抗原：如,MPO,；,核内抗原：如,FoxP3,；,细胞内细胞因子,(,胞内因子,),：,IFN-r,、,IL-4,、,IL-17,等。,固定：,4,多聚甲醛,破膜,/,透化,0.05%,皂素,(saponin),；,0.01%Triton X-100,70%,乙醇,膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量细胞标本，充分混匀后避光孵育,10-30min,。,洗涤：加,1ml PBS,洗液，,300g,离心,5min,。,固定：去上清后加入,500ul 4%,多聚甲醛，固定,20min,。,透化：离心洗去固定剂后，加皂素,500 ul,，透化,10min,。,胞内抗原染色：离心洗去透化液后，加入相应荧光素标记抗体，混匀后室温避光孵育,30 min,。,洗涤：加,1ml PBS,洗液，,300g,离心,5min,。,上机检测：弃去上清后加入,PBS 200-500 ul,后上机检测。,2.3,对照的设置,空白对照,细胞内物质自身也发出荧光，能被,FCM,灵敏的检测到，这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。,设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。,流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越大，电子信号越强；电压越小，信号越弱。,通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。,001,001,002,阳性对照,Positive Control,设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次分析时都必须设置：,使用新的荧光素抗体时；,使用存储时间较长的荧光素抗体时。,设置阳性对照的方法：,用肯定表达有该抗原的细胞来检测；,已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。,单标对照,Single Staining Control,两色或多色实验时须设置单标对照，用于补偿的调节；,单标实验时不需要。,2.4,光谱重叠与补偿,当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测到。但由于目前使用的各种荧光染料都是,宽发射谱,性质，虽然它们之间各自发射的峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，这种现象就是,光谱重叠,(spectral overlap),。,FL1 530/30,FL2 585/42,发射波长,FITC,发射谱,PE,发射谱,实验操作中，常利用电子技术和计算机软件设置的方法将串入相邻荧光通道的信号扣除，这种技术称为荧光补偿,(fluorescence compensation),。,FL-1(FITC),FL-2(PE),FL-1(FITC),FL-2(PE),FL2-%FL1,FL-1(FITC),FL-2(-),FL-1(-),FL-2(PE),FL1-%FL2,补偿前,补偿后,FITC,单标,PE,单标,未补偿,正确补偿,FITC-PE,补偿太大,PE-FITC,补偿太大,补偿调节要合适,三、流式细胞术的应用,细胞大小,细胞粒度,细胞表面面积,核浆比例,DNA,含量与细胞周期,RNA,含量,蛋白质含量,细胞结构,特异性抗原,（细胞表面,/,胞浆,/,核）,细胞内细胞因子,细胞活性,酶活性,激素结合位点,细胞受体,细胞功能,在上述分析基础上进行分选,3.1,检测细胞周期,3.2,检测细胞凋亡,3.3,检测细胞增殖,3.4,免疫细胞亚型检测,3.5,检测细胞因子,3.6,检测细胞吞噬功能,3.7,流式分选,3.1,检测细胞周期,处于不同细胞周期的细胞,DNA,含量不同，,G,0,/G,1,期细胞含有二倍体量的,DNA,，,G,2,/M,期细胞含有四倍体量的,DNA,，而,S,期细胞,DNA,含量处于二倍体和四倍体量之间。,DNA Content,DNA,荧光染料能与,DNA,结合，,DNA,含量的多少与,荧光染料的结合量成正比，荧光强度反应了,DNA,吸收荧光分子的多少。通过流式检测就能反映细胞内,DNA,的含量，区分细胞周期的,G,0,/G,1,期、,S,期和,G,2,/M,期细胞比例。,细胞周期分析核酸染料,细胞膜非通透性染料：,PI(,碘化丙啶,),、,EB(,溴化乙啶,),，不能进入完整细胞膜，标记时需要通过固定等方法增加细胞膜的通透性。,细胞膜通透性染料：,DAPI,、,Hoechst,，能染活细胞的,DNA,，但需紫外激光激发。,PI,标记法,检测细胞周期,需要乙醇固定增加细胞膜的通透性；,需要加,RNase,，去除,RNA,对,DNA,的干扰。,PI,法检测细胞周期一般步骤：,收集单细胞悬液,(1 10,6,个,),，缓慢加入,1 ml,预冷的,70,乙醇，于,4,固定过夜，或,-20,长期固定。,离心收集细胞，再以,1ml PBS,彻底洗去乙醇；,去上清后加入染色液,(,包含,50ug/ml PI,，,100ug/ml,RNase A，0.2%Triton X-100,),，,37,染色,30min,后上机检测。,细胞周期检测结果,脾脏细胞,培养肿瘤细胞,通过流式检测，能得出,G,0,/G,1,期、,S,期和,G,2,/M,期细胞比例。,增殖指数,(proliferous index,PI),：指处于,S,期和,G,2,/M,期细胞之和占总细胞的比例，反映了细胞的增殖能力。,CV,值,(,变异系数,),：衡量仪器测量分辨率和精度的指标。,DNA,倍体分析,病变肿瘤细胞常出现结构和染色体异常，流式检测,DNA,含量能反映异倍体情况。,DNA,指数,(DNA index,DI),：,(,样本的,G,0,/G,1,期峰平均荧光道数,)/(,正常二倍体细胞,G,0,/G,1,期峰平均荧光道数,),，描述样品细胞,DNA,含量的偏离程度和倍体水平。,倍体,(ploidy),：染色体数目。二倍体,DI=1,；四倍体,DI=2,；二倍体四倍体之外统称异倍体。,二倍体,异倍体,异倍体,精子单倍体细胞,双联体细胞的去除,利用信号脉冲,FL2-W/FL2-A,区别标本中的粘连细胞以及碎片，最大程度的减少假阳性。,G,1,双联体细胞,G,2,/M,细胞,FL2-W,FL2-W,FL2-H,FL2-H,FL2-W,FL2-A,3.2,检测细胞凋亡,细胞死亡方式主要有两种：包括细胞坏死,(necrosis),和细胞凋亡,(apoptosis),。,细胞凋亡，也称细胞程序性死亡，是细胞受基因调控的一种主动性的、高度有序的结束自己生命的过程。,凋亡细胞在形态学和生化上有明显的特征，如细胞皱缩、核固缩、细胞膜卷曲、,DNA,片段化、线粒体电位发生变化。根据这些特征，流式有多种方法能定性及定量的检测细胞凋亡情况。,3.2.1,亚二倍体,(,Sub-G,1,),峰的检测,凋亡细胞核小体崩解，,DNA,含量减少，加之由于,DNA,的降解，与荧光染料的结合减少，因此,DNA,染料的着色能力下降，荧光强度降低，表现在,G1,峰前出现亚二倍体峰，即亚,G,1,峰,(,凋亡峰,),。,细胞凋亡峰,Sub-G,1,四倍体峰,二倍体峰,PI,Number,3.2.2 Annexin V/PI,双染法,正常细胞膜是不对称性的，胞浆面含有带负电的磷脂,(,如磷脂酰丝氨酸,PS),。早期凋亡时，细胞表面不对称性发生改变，,PS,外翻到胞外侧。,Annexin V,是一种,Ca,2+,依赖性的对,PS,有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别膜表面是否有,PS,，从而识别凋亡细胞。,PS,外翻,PI,常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所以,PI,不能进入早期凋亡细胞核内。,Annexin V-FITC,PI,活细胞,早期凋亡,晚期凋亡坏死细胞,裸核,免疫荧光图,C,1h,2h,3h,4h,5h,3.2.3,线粒体膜电位检测法,凋亡细胞线粒体膜电位会发生改变，利用荧光探针罗丹明,123(Rh123),、,DiOC6,和,JC-1,等标记后，经过流式能检测出线粒体电位的变化，从而反映了细胞的凋亡情况。,JC-1,在正常细胞中在胞浆以聚合体形式存在，在,Fl-1,和,Fl-2,有荧光；细胞凋亡时线粒体膜电位发生去极化，,JC-1,进入线粒体以单体形式存在，仅在,Fl-1,通道有荧光。,JC-1(Fl-1),Jurkat T Cells,Control,Camptothecin,JC-1(Fl-2),3.2.4 DNA,断裂片段的检测,(TUNNEL,法,),凋亡中晚期会发生核酸内切酶的激活，双链的,DNA,出现不对称的断裂点，即产生一系列,3-OH,端。加入外源性的,脱氧核苷酸末端转移酶,(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT),能够催化外源性荧光素标记的,dUTP,连接到,DNA,的,3-OH,端，通过流式检测就能知道,DNA,断裂片段的多少，这种方法叫做,TdT,介导的,dUTP,缺口末端标记法,(TdT mediated-dUTP nick end labeling,TUNEL),。,近来研究证实，,Br-dUTP(,BrdU,),更容易掺入到凋亡细胞的,DNA,中，所以现在流式中都先用,BrdU,进行掺入反应，然后使用荧光素标记的,BrdU,抗体进行细胞染色，流式检测后得到凋亡结果。,TUNEL,法检测凋亡原理,Fas-induced Apoptosis in Jurkat T Cells,Annexin V-FITC,Annexin V/PI,双染法,P,I,TUNEL,法,BrdU-FITC,3.3,检测细胞增殖,细胞增殖,(,proliferation),是细胞生命活动的重要特征之一。检测细胞增殖的方法主要有：,MTT,检测法,胸腺嘧啶核苷（,3,H-TdR）,掺入法,流式细胞术,细胞周期法,相对计数法,/,绝对计数法,示踪染料标记法,BrdU,标记法,增殖蛋白检测,3.3.1,示,踪染料标记法,示踪染料能与细胞发生非特异性的稳定结合，主要有两种结合方式：,一种进入胞内与蛋白质共价结合，如,CFSE,和,BRSE,；,另一种嵌入细胞膜的脂质双分子层，与细胞非共价结合，如,PKH,类和,CellVue,类等。,CFSE,标记细胞后对细胞没有很强毒性，被激发后能发出很强的荧光，并且非常稳定，只有当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞的荧光信号减少一半。,PMA,刺激小鼠的脾细胞增殖图,3.3.2,BrdU,标记法,5-,溴脱氧尿嘧啶核苷,(bromodeoxyuridine,BrdU),是胸腺嘧啶核苷的类似物，在细胞增殖,DNA,合成时可以与内源性的胸腺嘧啶核苷竞争掺入到新合成的,DNA,中，而,BrdU,抗体可以特异性的识别,BrdU,，所以可以检测细胞增殖。,Br,Br,Br,Br,anti-BrdU,Br,Br,Acid or DNase,打开双链,BrdU,标记时同时加入,DNA,染料,(PI,7-AAD),，结果为一个典型的“马蹄形”峰，不仅能得到,G,0,/G,1,期、,S,期和,G,2,/M,期的比例，还能比较不同细胞,DNA,合成能力的不同。,sub-G,1,5.6%,G,0,/G,1,38.6%,G,2,/M 14.4%,S,期,38.6%,BrdU,标记法检测细胞增殖的另一优势是：发挥流式多参数的特性，能和其他指标同时检测，既可以是表面抗原，也可以是胞内蛋白。,取致敏,BALB/c,小鼠脾脏细胞，体外刺激,(PMA,和离子霉素,),后掺染,BrdU 45 min,，标记,anti-BrdU,、,7-AAD,、,CD8,以及,IL-10,进行多参数分析,27%,24%,34%,38%,3.4,免疫细胞亚型检测,CD,分子是细胞,(,包括白细胞、红细胞、血小板、内皮细胞等,),在分化为不同谱系,(lineage),、不同阶段以及活化过程中或疾病状态下出现或消失的细胞表面标记。,分化群,(cluster of differentiation,CD),：一类分化抗原的总称，进行流水编号，至,2009,年已至少有,350,种,CD,分子。,大多数白细胞分化抗原在生物进化中具有保守性，但是有些小鼠白细胞分化抗原和人类还是有所不同：,某些人,CD,分子尚未在小鼠中确定；,某些人和小鼠,CD,分子编号相同，但功能有所差别。,细胞群体,人,小鼠,免疫细胞,CD45,+,CD45,+,T,淋巴细胞,CD3,+,CD3,+,B,淋巴细胞,CD19,+,、,CD20,+,B220(CD45R),+,NK,细胞,CD56,+,CD335(NKp46),+,单核细胞,CD14,+,Mac-1,+,红细胞,CD235a,+,Ter119,+,造血干细胞,Lin,-,CD34,+,CD38,-,Lin,-,Sca-1,+,CD117,+,免疫细胞特征表型,Lin,为谱系标记,Lineage marker,，是造血细胞来源的各种血细胞和免疫细胞特异性标记的总称。,Lin,虽然包括很多种抗体，干细胞鉴定时，可能把它们标上同一种荧光素，只需分配一个流式通道。各流式抗体公司一般都有用于流式的,lineage cocktail,。,Granulocytes,Monocytes,Eosinophils,Basophils,Neutrophils,Lymphocytes,T,B,NK,Peripheral White Blood Cells,CD45,+,T,Helper,CD3,+,CD4,+,T,Cytotoxic,CD3,+,CD8,+,CD3,+,CD3,-,CD19,+,CD3,-,CD16,+,CD56,+,Monocytes,CD,1,4,+,3.4.1,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为：,T,淋巴细胞,(CD3,+,),，与细胞免疫有关；,辅助性,T,细胞,(CD3,+,CD4,+,),：,helper T cells,，,Th,细胞；,细胞毒性,T,细胞,(CD3,+,CD8,+,),：,Cytotoxic T cells,，,Tc,细胞。,B,淋巴细胞,(CD19,+,),，与体液免疫有关；,NK,细胞,(CD3,-,CD16,+,CD56,+,),，行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,总,T,、总,B,和,NK,细胞的比例以及,Th/Tc,可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。,FSC,SSC,CD3 PerCP,SSC,CD4 FITC,CD8 PE,42.04%,48.3%,1.8%,13.9%,35.9%,T,淋巴细胞亚群分析,CD3 PerCP,CD4 FITC,CD8 PE,42.82%,37.41%,49.68%,T,细胞、,B,细胞和,NK,细胞比例检测,亚群,百分比,(,),绝对计数,(,个,/ul),总,T,细胞,(CD3,+,),50-84,955-2860,总,B,细胞,(CD3,-,CD19,+,),5-18,90-560,NK,细胞,(CD3,+/,CD16,+,CD56,+,),7-40,150-1100,健康成年人外周血淋