流式细胞术2.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 流式细胞术的应用,第一节 流式细胞周期与DNA倍体分析,1细胞周期和倍体的概念,(1)细胞周期:,从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累，到下一次细胞分裂结束为止，称为一个细胞周期,细胞周期和倍体,G1期(DNA合成前期):,如果诱导细胞分裂，细胞首先进入G1期，在这一期间，细胞内RNA含量增加，合成细胞所需的蛋白质,此时细胞不合成DNA。,S期(DNA合成期):,一旦细胞开始合成新的DNA，细胞则进入了S期。,G2期(分裂前期):,DNA复制完成到有丝分裂开始的时间区间，即细胞DNA倍增结束，细胞开始进入G2期，又称为DNA合成后期。,M期(分裂期):,随后细胞进入分裂期，即M期。时间区间,指从有丝分裂开始到结束。,G0期(静止期):,有些细胞会暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一些功能，称为G0期细胞。,细胞周期和倍体,(2)倍体：,正常静止期体细胞中染色体含量为二倍体数目。,含有异常数量染色体的细胞我们称之为异倍体细胞，这反映出DNA含量的变化。,细胞周期和倍体,(3)流式细胞术测量DNA,含量的变化与倍体关系,1)G0期（静止期）细胞:DNA含量为恒定的2倍（2C）;,2)G1期细胞:DNA合成前期，细胞为进入S期做物质准备，合成大量的蛋白质和RNA。DNA含量与G0期相同，(2C);,3)S期细胞:DNA合成期，当细胞进入S期后DNA含量逐渐增加，从2C4C;,4)G2期与M,期细胞:,DNA合成后期和分裂期。S期后细胞DNA含量倍增，细胞进入G2期，尔后最终进入M期；在M期分裂成两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C。,细胞周期和倍体,参比细胞为单倍体细胞,DNA含量为200道。,被测细胞G0/G1期峰在400道,为二倍体细胞。,DNA直方图,CV,值（,变异系数）,：,实测DNA含量直方图的G0/G1期峰为正态分布，测定过程存在一定的漂移，为精确解释这种漂移现象，在FCM分析DNA含量中引入了变异系数（CV值）。,实测结果的CV值包括仪器的CV值和实验样品的CV值。在实验过程中，一个生物细胞的CV值在5以下的精度就足够了。,细胞周期和倍体,3,DNA含量与细胞周期分析的意义,DNA含量在细胞内所有参数中比较恒定，在细胞周期DNA含量随各时相发生周期性变化。,如果DNA含量发生微小的异常变化，则有可能导致恶性肿瘤细胞的产生。细胞癌变过程中伴随细胞DNA含量的改变，,DNA非整倍体细胞是恶性肿瘤的特异性标志,。,根据DNA分布直方图，可对细胞周期的分布状态进行分析，可计算出G0/G1；S%；及G2/M。了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中，,通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖生长的指标,。,100均为二倍体细胞（DIPLOID,)。,其中G0/G1占99%,无G2/M期细胞,S期细胞0.01%,G0/G1细胞峰CV值为2.94。,正常人血淋巴细胞DNA,分析,100为二倍体细胞：,其中G0/G1占85.79%，G2/M期细胞2.68%，S期细胞11.53%，G0/G1细胞峰CV值为3.39。,正常人骨髓细胞DNA,分析,二倍体细胞占58.86%；,G0/G1细胞峰CV值为3.39。可见一个异倍体细胞峰为亚二倍体，占41.14。DNA指数为0.81%。,急性 T,淋巴细胞白血病骨髓细胞,DNA,分析,多发性骨髓瘤骨髓细胞DNA,分析,二倍体细胞占69.88%,G0/G1细胞峰CV值为3.08。,可见一个异倍体细胞峰为亚二倍体，占30.12。,DNA指数为0.83%。,第二节:流式细胞术在细胞凋亡检测方面的应用,流式细胞术在科研,与临床上的应用,一、概述：,细胞凋亡（apoptosis）又称细胞的程序性死亡(programmed cell death)，是细胞在一定生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，它是一个主动的、高度有序的、基因控制的一系列酶参与的过程。细胞凋亡在形态上和生化上有其明显的特征。,细胞凋亡检测,凋亡细胞在正常细胞的G0/G1峰前出现一个,亚二倍体峰,凋亡诱因连续作用进程中，DNA,直方图的连续变化,细胞凋亡的分析,细胞凋亡检测,细胞凋亡的主要表现,细胞内水解酶改变：如Caspase-3活化,细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI,细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）,凋亡相关蛋白：,Fas,Bcl-,2,细胞凋亡Caspases-3,细胞凋亡Annexin,ANNEXIN-V/PI检测,流式细胞仪检测细胞凋亡Annex in V/PI双染色法,基本原理 目前细胞凋亡早期识别仍有困难。早期改变发生在细胞膜表面，其改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。这些细胞膜表面的PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。,Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，,Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对,PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的,探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜,外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种,细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是,完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就,破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在,细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验,以检测细胞膜的完整性的检测方法。,结果判断,凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。,第三节:流式细胞术在淋巴细胞免疫表型分析的应用,流式细胞术在科研,与临床上的应用,一、概述：,正常机体内淋巴细胞是不均一的细胞群体。根据其表面标志及功能特点，可分为不同的亚群。从体液免疫及细胞免疫功能分，淋巴细胞可分为,B,淋巴细胞,与,T,淋巴细胞,两大类。此外，有一种大颗粒淋巴细胞，由于缺乏,T,和,B,细胞的独特的标志（,TCR、BCR）,故称为第三类淋巴细胞即：（,NK）,细胞,。,再根据,细胞表面分化抗原,（,cluster of differentiation;,CD,）,的表达可将他们进一步分成许多的亚类。,淋巴细胞免疫表型,（一）可归入B细胞组的CD有：CD10、CD19 CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD75、CD77、CD78、CD79a、CD19b、CD80 CD86。,此外，归入其它细胞组的一些CD抗原也表达于B细胞，如CD5、CD11、CD44等。,这些CD成分是划分B细胞亚群的重要标志之一。,特别是在B细胞这些抗原中，有些CD的表达是,B细胞所特有的,，如：,CD19、CD20、CD22、CD79,等。他们的表达是我们区分B细胞与其它细胞的主要标志。,淋巴细胞免疫表型,（二）,可归入,T,细胞组的,CD,有：,CD3、CD4、CD8、CD11a/CD18、CD49/CD29、CD28、CD2、CD45、CD5、CD44,等。,其中，,CD3,与,CD2,（,还有,TCR）,分子是外周血成熟,T,淋巴细胞各亚群共有的表面标志。,而,CD4、CD8,表达是成熟,T,细胞不同亚群的表面标志。,淋巴细胞免疫表型,CD4,在,T,细胞活化中有两个主要功能：,一是作为细胞间的粘附分子，与,MHC II,类分子的,2功能区结合,以稳定,T,细胞与,APC,细胞结合,；,另,一功能是,CD4,分子的胞浆区与蛋白酪氨酸激酶,p56,lck,相连。从而激活,T,细胞作用。,因此其主要功能为,T,辅助作用,（,T helper,Th,）,细胞）或称,T,诱导作用,（,induce lymphcytes,Ti,）。,淋巴细胞免疫表型,CD8,在,T,细胞活化中也有两个主要功能：,一是作为细胞间的粘附分子，与,MHC I,类分子结合以稳定,T,细胞与靶细胞结合。,为抑制性（杀伤性）,T,淋巴细胞,；,另,一功能是,CD8,分子也与蛋白酪氨酸激酶,p56,lck,激活相关。参与,T,细胞的信号转导。,就其主要功能称为抑制性,T,淋巴细胞（,T suppressor,TS）,或称为（杀伤性/细胞毒性）,T,细胞（T,cytotoxic lymphocyte,TC）。,淋巴细胞免疫表型,（,三）,NK,细胞：,是一类具有自发细胞毒活性的细胞，故属于先天性免疫，不具有免疫记忆功能，以非,MHC,形式杀伤靶细胞。故称之为,自然杀伤细胞,（,natural killer cells,NK cells,）。,NK,细胞表面没有特有的标志，可归入,NK,细胞表面的相对标志在人类是,CD16,和,CD56,（NKH1），,小鼠为,NK1.1,和,NK2.1。,淋巴细胞免疫表型,二、血液淋巴细胞免疫表型分析,（一）分析原理,血液经荧光素标记的单克隆抗体免疫荧光染色后，用FCM,分析淋巴细胞膜上白细胞分化抗原（,CD,分子）的表达，由此计算淋巴细胞各亚群的百分比。目前常用的有双色和三色免疫荧光分析法。,淋巴细胞免疫表型,双色（,FITC,/,PE,）免疫荧光染色分析淋巴细胞免疫表型,管号 双色荧光标记的单抗 染色目的与染色细胞,1 CD45,FITC,/CD14,PE,设定淋巴细胞门,2,Mouse IgG1 FITC/Mouse IgG2a PE,阴性对照,3,CD3 FITC/CD19 PE,总,T,和总,B,淋巴细胞,4,CD3 FITC/CD4 PE T,辅助细胞,5,CD3 FITC/CD8 PE T,抑制细胞,6,CD3 FITC/CD16+56 PE NK,细胞,注:参考CD45/CD14,散点图,由,FSC/SSC,设定淋巴细胞门。,淋巴细胞免疫表型,三色(,FITC/PE/PerCP,)免疫荧光染色分析淋巴细胞免疫表型,管号 三色荧光标记的单抗 染色目的与染色细胞,1,Mouse IgG1 FITC/,Mouse IgG1 PE/,阴性对照,CD45 PerCP,2 CD3 FITC/CD19 PE/CD45 PerCP,总,T,和总,B,淋巴细胞,3,CD3 FITC/CD4 PE/CD45 PerCP T,辅助细胞,4 CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP T,抑制细胞,5 CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP NK,细胞,注:用SSC/CD45 PerCP,设定淋巴细胞门。,淋巴细胞免疫表型,CD45,和,CD14,在白细胞上有着不同的表达，固它们可用来在光散射坐标上区分,淋巴细胞群体,或,其它细胞,（如粒细胞，单核细胞等）。,CD45,与,CD14,在白细胞的表达情况：,淋巴细胞免疫表型,1.所有白细胞都表达,CD45，,它是一个白细胞共同抗原（又名,T200）。,其中淋巴细胞与嗜酸性粒细胞表达最高（4），单核细胞中等表达（3），中性粒细胞表达弱（2）。而红细胞、血小板和非血细胞都不表达,CD45。,所以,CD45,染色可排出白细胞以外的所有细胞成分,。并将不同白细胞大致分开。,2.因为所有的白细胞都表达,CD45,所以不能仅用一固定的阴性标准来区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。,3.CD14,在单核细胞上高表达,在成熟粒细胞弱表,达。而淋巴细胞,CD14,阴性。,淋巴细胞免疫表型,此时联合使用CD45,与,CD14,和光散射参数，就能在外周血中区分出各类型的细胞甚至幼稚细胞（如白血病）。,淋巴细胞高表达,CD45，,并极少或不表达,CD14，,同时这些细胞的前向或侧向散射光信号弱。,粒细胞弱表达,CD45,和,CD14，（,很容易与淋巴细胞相区分）。同时这些细胞的前向、侧向散射光信号强。,单核细胞中等表达,CD45，,其侧向散射光信号强，前向散射光信号较粒细胞弱。,淋巴细胞免疫表型,图示FSC/SSC及CD45/CD14散点图：1）由于不同白细胞的CD45/CD14表达不同，故可在右侧散点图中分出不同区域。R1为淋巴细胞群（红色）；R2为中性粒细胞（绿色）；R3为嗜酸性粒细胞（品红）；R4为单核细胞（天蓝）；R5为细胞碎片（深黄色）。2）通过R1R5设置，在FSC/SSC散点图中即可映射出各种细胞的分布区域。将淋巴细胞射门为R6，其中淋巴细胞占95以上。,运用CD3/CD19进行荧光补偿调节,CD3,是,T,淋巴细胞特异性抗原，,CD19,则可用来识别,B,细胞。如运用,CD3/CD19,双标记试剂染色，应没有,CD3,和,CD19,双阳性细胞群体存在。因此当运用,CD3/CD19,双染色时，只会出现单阳性细胞。据此进行荧光补偿调节。,淋巴细胞免疫表型,12,76,B细胞,T细胞,淋巴细胞：T细胞与B细胞的区分,淋巴细胞免疫表型,运用CD3/CD4,来鉴定,CD4T,淋巴细胞,如同其它许多单克隆抗体一样，抗,CD4,抗体并不是完全只与辅助/诱导性,T,淋巴细胞发生反应,它还会与单核细胞结合。因此如要鉴别,CD4,的辅助/诱导性,T,淋巴细胞，则需要加入,CD3,抗体。,CD3,为全部,T,细胞表达，所以,CD3/CD4,双阳性细胞才是真正的辅助/诱导性,T,淋巴细胞,。（,HIV,感染时，此淋巴细胞数量明显下降）。,此外，,CD3-/CD4+,细胞群体是由单核细胞组成。,淋巴细胞免疫表型,辅助/诱导性,T,淋巴细胞,（CD3/CD4,双阳性细胞,）,49,淋巴细胞免疫表型,运用CD3/CD8,来鉴定,CD8T,淋巴细胞,CD8,的表达不只限于细胞毒/抑制性,T,淋巴细胞表达，这种抗原在部分,NK,细胞上也能检测到，,故CD8,必须与,CD3,一起来鉴定细胞毒/抑制性,T,淋巴细胞。,CD3,为全部,T,细胞表达，所以,CD3/CD8,双阳性细胞才是真正的细胞毒/抑制性,T,淋巴细胞,。,CD3-/CD8+,细胞包括一部分,NK,细胞和少数粒细胞,但由于它们不表达,CD3,易于与,CD3+/CD8+,的细胞毒/抑制性,T,淋巴细胞区别开来,。,淋巴细胞免疫表型,细胞毒/抑制性,T,淋巴细胞,（CD3/CD8,双阳性细胞,）,26,NK,细胞,CD16,表达于大多,NK,细胞上，但也表达于中性粒细胞上，这种抗原在,NK,细胞的表达比较弱，并在,NK,细胞活化时丢失。,CD56,表达于大多数,NK,细胞上，也表达于一些,T,淋巴细胞上，当与,CD3,联合使用，就可以区分,CD3+/CD56+T,淋巴细胞和,CD3-/CD56+NK,细胞。,如果联合使用三种单抗就能完全的鉴定所有的,NK,细胞，因为,NK,细胞或表达,CD16，,或表达,CD56，,而不表达,CD3。CD16,和,CD56,联合使用，根据荧光强度可将,NK,从双阴性细胞中区分出来。,运用这组试剂，,NK,细胞可形成独立的群体与其它细胞相区分。,淋巴细胞免疫表型,NK细胞（CD16CD56CD3-）,11,正常人淋巴细胞免疫表型(双色免疫荧光染色):,总T,淋巴细胞76%(正常值50%84%)；总B淋巴细胞12（518）；T辅助细胞49（27%51）；T抑制细胞26（15%44）；NK细胞11（7 40）；TBNK99（95100）；D3+CD4+/CD3+CD8+比值1.88(0.72.8)。,12,76,49,26,11,慢性淋巴细胞增殖病淋巴细胞免疫表型(三色免疫荧光染色):C,D45PerCP/SSC设定淋巴细胞门，1血液中NK细胞高达65,(7 40)。2成熟的T淋巴细胞显著减少为26(50%84%)。此型白血病为：NK细胞型大颗粒淋巴细胞白血病。,AIDS,淋巴细胞免疫表型,(三色免疫荧光染色):C,D45PerCP/SSC设定淋巴细胞门。总T淋巴细胞基本正常83（,50%84%,）；但T辅助细胞（CD3+/CD4+）显著减低为21%(,27%51）；T抑制细胞,（CD3+/CD8+）比例明显增高为59%(,15%44）；,CD3+/CD4+/CD3+/CD8+细胞比值减低仅为0.36(,0.72.8,)。随着病情加重，CD3+/CD4+将进行性减低。,教 学 目 标,1.掌握流式细胞仪检测细胞周期检测的原理和方法、,Annex in V/PI双染色法检测早期细胞凋亡的原理和方法。,2.熟悉流式细胞仪检测淋巴细胞亚群检测的原理，进一步体会流式细胞仪的检测原理。体会流式细胞术中直方图、散点图代表的意义。,网络常用流式细胞术网址：,www.BD,Biosciences/,Intrduction flow cytometry.iht,