生化研究技术与方法---1沉淀法27.ppt

*,南京农业大学 生命科学学院,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,*,南京农业大学 生命科学学院,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第二章 沉淀法,沉淀法是纯化生物大分子常用的一种经典方法。该法操作简单，成本低廉，一般包括盐析沉淀、有机溶剂沉淀和选择性沉淀等类型。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,1,2025/11/1 周六,生命科学学院 生物科学,51,班,2,第二章 沉淀法,基 本 原 理,蛋白沉淀法,1,2,3,核酸沉淀法,第一节 沉淀的基本原理,沉淀法也称溶解度法。,其纯化生物大分子的基本原理是：,根据各种物质,结构的,差异,（如蛋白分子表面的疏水基团和亲水基团之间比例的差异）来改变溶液的某些性质（如,pH,、极性、离子强度、金属离子等），就能致使抽提液中有效成分溶解度的变化。,可通过选择适当的抽提溶剂使欲分离的有效成分最大溶解，而杂质最小溶解；或者相反。从而达到分离的目的。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,3,2025/11/1 周六,3,南京农业大学 生命科学学院,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,6,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,7,第二节 蛋白沉淀法,1.,盐析法,盐的选择,一般蛋白沉淀时选用硫酸铵，原因：,溶解度大，对温度不敏感,分级效果好,有稳定蛋白质结构的作用,价格低廉，废液可以肥田,盐析的缺点：样品继续纯化时须脱盐。,硫酸铵的缺点是铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,8,2025/11/1 周六,8,南京农业大学 生命科学学院,第二节 蛋白沉淀法,1.,盐析法,硫酸铵盐析,固体法。在大体积粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当达到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀下来。,饱和溶液法。较固体法温和，但不适用于大体积样品，会导致样品体积大量增加。,透析法。将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的盐溶液中，通过透析作用改变蛋白质溶液中的盐浓度。该法以盐浓度连续变化避免局部盐浓度过高的影响，分级效果好。但受透析袋容积、盐析速度、及硫酸铵耗费大的制约，仅用于精确、样品体积小的试验中。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,9,2025/11/1 周六,9,南京农业大学 生命科学学院,硫酸铵盐析,固体法,g=533(S,2,-S,1,)/(100-0.3S,2,)(20),g=541(S,2,-S,1,)/(100-0.3S,2,)(20),g,：,1,升溶液中需加入固体硫酸铵的克数,S,1,：表示需要达到的百分饱和度,S,2,：表示原溶液中的百分饱和度,饱和溶液法,V=V0(S2-S1)/(S3-S1),V,：表示需要加入的硫酸铵溶液体积（,ml,）,V,0,：表示原来溶剂的体积（,ml,）,S,1,与,S,2,同上,S,3,：表示需要加入的硫酸溶液的饱和度,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,10,2025/11/1 周六,10,南京农业大学 生命科学学院,硫酸铵分级沉淀示例：,各溶解度区段的沉淀效果（尿素酶）：,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,11,名称,沉淀效果,硫酸铵饱和度,/%,（,25,）,025,2535,3545,4555,5565,沉淀物酶活力单位,/U,0,112,6850,3020,27,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,12,调整硫酸溶液饱和度计算表,第二节 蛋白沉淀法,1.,盐析法,盐析的影响因子,：,蛋白质浓度对盐析的影响：,蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率也低。一般控制样品液蛋白浓度在,0.2%-2%,为宜。,离子强度和离子类型对盐析的影响：,离子强度越大，蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而价数低的离子对盐析影响弱。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,13,2025/11/1 周六,13,南京农业大学 生命科学学院,盐析的影响因子,：,p,对盐析的影响：,蛋白质所带净电荷越多，溶解度越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将,p,值调到蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。,温度对盐析的影响：,在低离子强度或水中在一定范围内蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加；但在高盐溶液中，温度的升高有时反而下降。一般情况下在,操作。,其他：,在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加入一定量,EDTA,，以除去沉淀剂中带入的金属离子。再者是加硫酸铵的时间要控制好，一般,2 h,左右。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,14,2025/11/1 周六,14,南京农业大学 生命科学学院,第二节 蛋白沉淀法,2.,有机溶剂沉淀法,原理：,有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。,有机溶剂的沉淀作用主要是,:,降低溶液的介电常数从而增强分子之间的相互作用，使其溶解度降低。,对于具有表面水层的生物大分子来说，有机溶剂可破坏溶质分子表面的水膜，使这些大分子脱水而相互聚集析出。不同溶质要求不同浓度的有机溶剂，因此可用有机溶剂进行分步沉淀。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,15,2025/11/1 周六,15,南京农业大学 生命科学学院,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,16,第二节 蛋白沉淀法,2.,有机溶剂沉淀法,常用溶剂：,甲醇、乙醇、丙酮。,优点：,有机溶剂沉淀法分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤比较容易。,缺点：,对某些具有生物活性的大分子，容易引起变性失活，操作常在低温下进行；分离效果差，共沉作用大；离子强度及离子种类对其也有影响。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,17,2025/11/1 周六,17,南京农业大学 生命科学学院,第二节 蛋白沉淀法,3.,蛋白质沉淀法,针对某一类或某一种蛋白的沉淀法，常见沉淀剂有：,碱性蛋白质：,多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白，除能有效沉淀核酸外，还能沉淀某些蛋白质。,凝集素：,凝集素是一种特殊的蛋白质，对糖蛋白中糖链末端序列具有明显、特异的凝聚力。该法反应条件温和，特异性高。,重金属：,重金属盐（如铅盐、汞盐）作为蛋白质沉淀剂，也能将蛋白质或酶沉淀。但应控制条件，并尽快透析除去重金属，防止变性。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,18,2025/11/1 周六,18,南京农业大学 生命科学学院,第二节 蛋白沉淀法,4.,聚乙二醇沉淀法,聚乙二醇（,PEG,）和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可是蛋白质发生沉淀作用。该法条件温和，不易使蛋白变性，且沉淀完全，应用范围广。,5.,选择性沉淀法,根据各种蛋白质在不同理化因子（如温度、酸碱度和有机溶剂等）作用下稳定性不同的特点，用选择性沉淀法，使杂蛋白变性，而欲分离的有效成分则存在于溶液中（或者发生可逆性沉淀），从而达到分离有效成分的目的。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,19,2025/11/1 周六,19,南京农业大学 生命科学学院,第二节 蛋白沉淀法,6.,结晶沉淀法,结晶,是溶质呈晶态从溶液中析出的过程。,初析出的结晶多少总会带一些杂质，因此需要反复结晶才能得到较纯的产品。,从比较不纯的结晶再通过结晶作用精制得到较纯的结晶，这一过程叫做重结晶（或称再结晶、复结晶）,。,结晶是分离纯化蛋白质、酶等生化产品的一种有效手段,。变性蛋白质不能结晶，所以凡结晶状态的蛋白质都能保持天然状态。晶体内部有规律的结构，决定了晶体的形成必须是相同的离子或分子，才可能按一定距离周期性地定向排列而成，所以能形成晶体的物质是比较纯的。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,20,2025/11/1 周六,20,南京农业大学 生命科学学院,6.,结晶沉淀法,影响结晶的因素：,纯度。各种物质在溶液中均需达到一定的纯度才能析出结晶，这样就可使结晶和母液分开，以达到进一步分离纯化的目的。,浓度。结晶液一定要有合适的浓度，结晶的大小、均匀度和结晶的饱和度有很大关系。,pH,。,pH,的变化，可以改变溶质分子的带电性质，是影响溶质分子溶解度的一个重要因素。一般结晶液所选用的,pH,与沉淀大致相同。,温度。冷却的速度及冷却的温度直接影响结晶效果。,时间。结晶的形成和生长需要一定时间，不同化合物结晶时间长短不同。,晶种。不易结晶的生化物质常需加晶种。有时用玻璃棒摩擦容器壁也能促进晶体析出。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,21,2025/11/1 周六,21,南京农业大学 生命科学学院,第三节 核酸沉淀法,核酸分离纯化应维持在,0-4,的低温度条件下，以防止核酸的变性和降解。为防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸钠,(SDS),、乙二胺四乙酸,(EDTA),、,8-,羟基喹啉、柠檬酸钠等以抑制核酸酶的活性。,常用的沉淀分离法有：,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,其它沉淀剂沉淀法：聚乙二醇（,PEG,），十六烷基三甲基溴化铵（,CTAB,），,LiCl,，精胺，钙盐。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,22,2025/11/1 周六,22,南京农业大学 生命科学学院,第三节 核酸沉淀法,有机溶剂沉淀法,乙醇,优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。,缺点：需要量大，一般要求低温操作。,异丙醇,优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的,DNA,样品沉淀。一般不需低温长时间放置。,缺点：易使盐类、蔗糖与,DNA,共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用,70,乙醇漂洗数次。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,23,2025/11/1 周六,23,南京农业大学 生命科学学院,第三节 核酸沉淀法,等电点沉淀法,：,脱氧核糖核蛋白的等电点为,pH4.2,；核糖核蛋白的等电点力,pH2.0-2.5,；,tRNA,的等电点为,pH5,。所以将核酸提取液调节到一定的,pH,，就可使不同的核酸或核蛋白分别沉淀而分离。,聚乙二醇（,PEG,）,优点：可用不同浓度的,PEG,选择沉淀不同相对分子质量的,DNA,片段。应用,6000,相对分子质量的,PEG,进行,DNA,沉淀时，使用浓度与,DNA,片段的大小成反比。,注意：,PEG,沉淀一般需加,0.5 mol/L,的,NaCl,或,10 mmol/L,的,MgCl2,。要接着加乙醇沉淀核酸或用氯仿抽提除去,DNA,沉淀中,PEG,。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,24,第三节 核酸沉淀法,LiCl,。,LiCl,可以沉淀,RNA,以去除,DNA,。,CTAB,。,CTAB,可从含多糖的裂解体系中沉淀核酸。,精胺,精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀,DNA,。,原理：精胺与,DNA,结合后，使,DNA,在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与,DNA,分开，达到纯化,DNA,的目的。,钙盐沉淀法,：,在核酸提取液中加入一定体积比,(,一般为,1/10),的,10%,氯化钙溶液，使,DNA,和,RNA,均成为钙盐形式，再加进,1/5,体积的乙醇，,DNA,钙盐即形成沉淀析出。,2025/11/1 周六,南京农业大学 生命科学学院,25,2025/11/1 周六,25,南京农业大学 生命科学学院,Thank You!,