核酸和蛋白质的生物合成.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处，请联系改正。,10.1 DNA,的生物合成,10.2 RNA,的生物合成,10.3,蛋白质的生物合成,生物亲代与子代之间，在形态、结构和生理功能上常常相似，这就是遗传现象。,生物的遗传特性，使生物界的物种能够保持相对稳定,。,根据现代细胞学和遗传学的研究得知，控制生物性状的主要遗传物质是脱氧核糖核酸（,DNA,）。,金丝猴的后代仍然是金丝猴,牛的后代仍然是牛,生物的各项生命活动都有它的物质基础。生物遗传的物质基础是什么呢？,DNA,是生物遗传的主要物质。生物机体的遗传信息以密码的形式编码再,DNA,分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。并通过,DNA,的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，,遗传信息自,DNA,转录给,RNA,，然后翻译成特异的蛋白质（中心法则）,。以执行各种生命功能，使后代表现相似的遗传性状。,中心法则,(Crick,1958),转录,在,DNA,分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的,RNA,的过程。,复制,遗传物质从亲代,DNA,传递到子代,DNA,分子上，合成出与原来,DNA,相同分子的过程。,翻译,在,RNA,的指导下，根据核酸链上每三个核苷酸决定一个氨基酸的三联体密码规则，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链的过程。,Reverse,transcription,10.1 DNA,的生物合成,复制过程可分为：起始、延长和终止,3,个阶段。,一、,DNA,的半保留复制,通过碱基配对,(A-T,C-G),两条链连在一起，成为互补链。一条链上核苷酸排列顺序决定了另一条链上的核苷酸排列顺序，每一条链都含有合成它的互补链所必需的全部遗传信息。,DNA,复制过程中，首先碱基间氢键断裂并使双链解旋和分开，然后每条链可作为模板在其上合成新的互补连，新形成的两个,DNA,分子与原来,DNA,分子的碱基顺序完全一样。在此过程中，每个子代分子的一条链来自亲代,DNA,，另一条链子是新合成的。这种方式称为,半保留复制。,DNA,复制,（一）半保留复制的实验依据,1958,年，,Messelson,和,Stahl,用实验加以证实。细菌可利用,NH,4,Cl,作氮源合成,DNA,。,普通,DNA,的沉降位置,含,15,N-DNA,的细菌,第一代,第二代,培养于含,14,N-DNA,的普通培养液,重,DNA,的沉降位置,细菌的,DNA,双链,含,15,N-DNA,链,含,14,N-DNA,链,密度梯度离心结果,普通,DNA,的沉降位置,实验结果表明,:,子一代,DNA,双链中有一股是,15,N,单链，而另一股是,14,N,单链，前者是从亲代接受和保留下来的，后者则是完全新合成的。,（二）半保留复制的意义,半保留复制的意义：,按半保留复制的方式，子代保留了亲代的全部遗传信息，体现在亲代与子代之间,DNA,碱基序列的一致性上。体现了遗传过程的相对保守性（不是绝对的）。是物种稳定的分子基础。,A T,G C,A T,A T,C G,A T,G C,A T,A T,C G,A T,G C,A T,A T,C G,亲链,子链,子链,亲链,二、,DNA,复制的起点和方式,复制子,基因组能独立进行复制的单位。,每个复制子都含有控制复制起始的起点（富含,A,、,T,区），可能还有终止复制的终点。复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制开始，它既继续下去，直到整个复制子完成复制。,J.Cairns,（,1963,年）,Direction of DNA replication,原核生物的染色体和质粒，真核生物的细胞器,DNA,都是环状的双链分子，都在一个固定的起点 开始复制，复制的方向是双向的。即形成,2,个复制叉。,复制叉,亲代链分开及新生,DNA,开始复制处形成的,Y,形结构。,细菌,DNA,复制叉移动的 速度大约,50000bp/min,，真核生物 染色体,DNA,复制叉移动的 速度大约,10003000bp/min,，高等真核生物一般复制子为,100200kb,。,DNA,新起始方式,（,de novo initiation,）复制的基本模式,Parental D.S,DNA,Unwinding protein,RNA polymerase,Primase,DNA polymerase,leading Strand,lagging Strand,Elongation of lag.&lea.strands,DNA polymerase,Poly(dNt)ligase,Replication loop,RNA primer,RNA-primed DNA pieces(1kb),Continuous 5 to 3 in Leading S.,Discontinuous 3 to 5 in lagging S.,Two long DNA pieces,Many shorter DNA pieces(1-2 kb),Repair&filling in 5 to 3,Bidirectional lengthening of new stands,眼形结构,三、原核生物,DNA,复制的酶学,DNA,复制所需的物质及作用,1,、底物：,dNDP,。,2,、聚合酶：,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶，简称,DNA-pol,。,3,、模板：,解开成单链的,DNA,母链。,4,、引物：,提供,3,-OH,末端，使,dNDP,可以依次聚合。,5,、其他酶和蛋白因子,（如：引物酶、解旋酶、,DNA,连接酶、拓扑异构酶、单链,DNA,结合蛋白等）。,（一）复制中解链和,DNA,分子拓扑学变化,拓扑,物体或图像做弹性位移而又保持物体不变的性质。,核酸的拓扑结构,核酸分子结构的空间关系,。,共同起解开、理顺,DNA,链，维持,DNA,在一定时间内处于单链状态的作用。,解螺旋酶（,DNA helicase),解开双链。同样功能的还有,Rep,蛋白。,DNA,拓扑异构酶（,Top I,、,Top II,）改变,DNA,分子拓 扑构象。,单链,DNA,结合酶（,SSB),维持模板的单链状态并保持单链的完整。,解旋、,解链酶,Top I,Cut,D.S.DNA,ATP,Ligate,Top II,Top I,在,DNA,的一股链上产生缺口，使另一条链得以穿越。,Top II,则在,DNA,的双链上产生缺口，使另一双链,DNA,片段得以穿越。,（二）引物酶,（,Primase),和引发体,(Primosome),引物酶,(Dna G),：催化引物合成的一种,RNA,聚合酶。,引物酶在模板的复制起始部位催化互补碱基的聚合，形成短片断的,RNA,。引物酶和解螺旋酶共同起作用。,引发体：,Dna A,蛋白、,Dna B,蛋白、,Dna G,蛋白、,Dna C,及其他复制因子，一起形成复合体，结合引物酶，形成较大的聚合体，再结合到模板,DNA,上。,引发体的下游解开双链，再由引物酶催化引物的合成。,解螺旋,辨认起点,引物酶,Primosome,（,consists of six proteins,）,PriA(dual role)displace SSB from S.S DNA and helicase,DnaT,required at prepriming stage,DnaB is central component,action with DnaC,DnaC,is central component,action with DnaB,PriB,function is unknown,PriC,function is unknown,DnaG primase,（三）,DNA,聚合反应和聚合酶,1,、,DNA,聚合反应,Kornberg(1956),发现了,DNA,聚合酶。该酶可催化,4,种脱氧核糖核苷三磷酸合成,DNA,。脱氧核糖核苷酸被加到,DNA,链的末端，同时释放出无机焦磷酸。,（,dNMP),n,+dNTP (dNMP),n+1,+ppi,DNA,延长了的,DNA,反应需要接受模板的指导,引物：反应需要有引物,3,羟基存在。,底物：,4,种脱氧核糖核苷三磷酸（,dNTP,）,产物,DNA,的性质与模板相同。,复制在,5,-3,方向延伸,DNA,聚合酶的反应特点,:,2,、,DNA,聚合酶,(DNA pol),DNA,聚合酶,(pol-,Konberg),：,由一条单一多肽链组成 ，分子形状呈球体。当有底物和模板存在时，可使脱氧核糖核苷酸逐个加到具有,3-OH,末端的多核苷酸链上。和其他的,DNA,聚合酶一样，只能延长多核苷酸链，即要有引物的存在。而不能从无到有开始,DNA,链的合成。,可催化的反应：,A:,核苷酸聚合反应，使,DNA,链延,5 3,方向延长（聚合酶活性,填补缺口）。,B:,由,3,端水解,DNA,。（,3 5,核酸外切酶活性,校正错误）。,C:,由,5,端水解,DNA,。（,5 3,核酸外切酶活性,切除引物）。,D:,由,3,端使,DNA,链发生焦磷酸解。,E:,无机焦磷酸盐与脱氧核糖核苷三磷酸之间的焦磷酸基交换。,每个大肠杆菌细胞约有,400,个分子的,DNA,聚合酶,。,DNA,聚合酶,不是复制酶，而是修复酶，起着去除,RNA,引物的作用，只是参与局部修复。,（,DNA,聚合酶,、,、,、,、,）,（,2,）,DNA,聚合酶,（,pol-,）,DNA,聚合酶,为多亚基酶。,作用：,A:,从,5 3,方向合成,DNA,，并需要带有缺口的双链,DNA,作为模板，缺口不能过大。,B:3 5,核酸外切酶活性，但无,5 3,核酸外切酶活性。,不是复制酶，而是修复酶。,每分子每分钟催化,2400,个,dNTP,的聚合。,每个大肠杆菌细胞约有,100,个分子,DNA,聚合酶,。,（,3,）,DNA,聚合酶,（,pol-,）,DNA,聚合酶,为多亚基（,10,种）组成的蛋白质，其全酶由,、,、,、,、,、,、,、,、,、,10,种,亚基组成。,是,DNA,的复制酶。,每个大肠杆菌细胞约有,10-20,个分子,DNA,聚合酶,。,作用：,其性能与,DNA,聚合酶,相似。,A:,需要模板，以,dNTP,为底物，需要有引物的存在，从,5 3,方向合成,DNA,。,B:,具有,3 5,核酸外切酶活性，但无,5 3,核酸外切酶活性。,C,：多亚基酶。,pol-,异二聚体结构,核心酶,DNA,聚合酶,全酶亚基组成,亚基,亚基数,亚基功能,2,聚合活性。催化从,5 3,方向合成,DNA,。,2,35,外切酶活性，校对功能 核心酶,2,组建核心酶,2,核心酶二聚化,2,依赖,DNA,的,ATP,酶，形成,复合物,1,可与,亚基结合，形成,复合物,1,形成,复合物,1,形成,复合物,1,形成,复合物,4,两个,亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力。,夹,子,装,配,器,pol-,异二聚体结构,亚基由两个形成夹子结构,（,4,）,DNA,聚合酶,和,DNA,聚合酶,涉及,DNA,的错误倾向修复。使修复缺乏准确率。,DNA,受到较严重的损伤时，即可诱导产生这两种酶。,DNA,聚合酶,酶,作 用,DNA,聚合酶,不能从无到有开始,DNA,合成，要有引物链。,5 3,聚合酶及外切酶作用，,3 5,外切酶酶作用，可校正,/,修复,DNA,链，还可切除引物。,DNA,聚合酶,5 3,聚合酶及,3 5,外切酶酶作用，可校正,/,修复,DNA,链。,DNA,聚合酶,与酶,作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶（聚合酶,replicase,）。,DNA,聚合酶,涉及,DNA,的错误倾向修复。,DNA,受到严重损伤时，可诱导产生，使修复缺乏准确性。,DNA,聚合酶,同上。,（四）,DNA,连接酶,DNA,聚合酶只能催化,DNA,链的延长反应，不能使链之间连接。,DNA,连接酶催化双链,DNA,切口处的,5,磷酸基和,3,羟基生成磷酸二 酯键。,DNA,连接酶在,DNA,的复制、修复和重组等过程均起重要的作用。,反应分三步进行：,第一步：,NAD,或,ATP+DNA,连接酶 酶,-AMP,复合物,第二步：酶将,AMP,转移给,DNA,切口处的,5,磷酸，形成,AMP-DNA,。,第三步：通过相邻链的,3-OH,对活化的磷原子发生亲核攻击，,生成,3,，,5,磷酸二酯键。同时释放出,AMP,。,Nick,：指断裂的磷酸二酯键。,Gap,：指缺失核苷酸,四、原核生物,DNA,生物合成过程,Top I ,Top II,Helicase(rep protein),Single Strand Binding protein(SSB),Helix destabilizing protein(HDP),DnaB pritein,DnaC protein,Primase,Ung-ase,DNA Polymerase III,DNA Polymerase I,Ligase,for primosome,复,制,体,进化中形成了活的多酶复合体,replisome,包括,起始、延伸和终止,三个阶段,。,1,、起始阶段,复制的起始阶段,主,要是引发体的形成。,(1)Dna A,蛋白识别并结合于起始点,ori C,。,(2)Dna,、,Pri A,、引物酶等相继结合，组成复制引发体。,（,3,）拓扑异构酶,引入负超螺旋，促进,Dna A,的结合，同时消除扭曲张力。,（）聚合酶,结合到模板上，在引物的,后面合成新的链。,解螺旋,水解,ATP,推动,DNA,解链,合成引物,半不连续复制,：在复制叉上前导链连续合成子代链，而滞后链不连续合成子代链。,2,、延伸阶段,前导链,以走向,3,5,的亲代链为模板，连续合成子代链。,滞后链,以走向,5,3,的亲代链为模板，不连续合成子代链。,冈崎片断,滞后链侧的,较小的,DNA,片断。,每一个复制叉上只有一个,DNA,聚合酶,全酶的二聚体。同时在前导链和滞后链上完成复制任务。,（滞后链）,（前导链）,DNA,生物合成过程,单链,DNA,结合蛋白,（,DNA,聚合酶）,（,DNA,聚合酶）,DNA,生物合成过程,（,DNA,聚合酶）,(DNA,引物酶,),（冈崎片断,),（,RNA,引物）,（解螺旋酶）,（,DNA,聚合酶）,（滞后模板）,复制叉上蛋白质的协作,（前导模板）,两个复制叉在,ori C,约,180,度的对面相遇，在这一区域有几个终止子的位点，它们与,tus,基因产物即,Dna,解旋酶的抑制剂结合，从而阻止复制叉的前进。,复制终止后，由,DNA,聚合酶,填补空隙，最后由连接酶封口。,3,、复制的终止,DNA,复制的要点是：,1,）在复制开始阶段，,DNA,的双螺旋拆分成两条单链。,2,）以,DNA,单链为模板，按照碱基互补配对的原则,在,DNA,聚合酶催化下，合成与模板,DNA,完全互补的新链，并形成一个新的,DNA,分子。,3),通过,DNA,复制形成的新,DNA,分子,与原来的,DNA,分子完全相同。经过一个 复制周期后，子代,DNA,分子的两条链中，一条来自亲代,DNA,分子，另一条是新合成的，所以又称为半保留复制。,五、真核生物,DNA,的复制合成,真核,DNA,的合成的基本过程类似于原核,DNA,，不同之处：,复制速度慢，多复制起点。,全部复制完之前起点不再重新开始复制。,至少有五种聚合酶,。,DNA,聚合酶,（,）,DNA,聚合酶,（,）,DNA,聚合酶,（,M),DNA,聚合酶,（,）,DNA,聚合酶,（,）,亚基数,4,1,2,2,1,分子量（,KD),250,36-38,160-300,170,256,细胞内定位,核,核,线粒体,核,核,引物合成酶活性,35,外切活性,+,+,+,功能,引物合成,修复,线粒体,DNA,合成,核,DNA,合成,修复,端粒的复制依赖于端粒酶。,端粒,-,每一线性,DNA,末端含有多拷贝的富含,G,的六核苷酸重复序列。,真核生物染色体,DNA,末端补齐模式,端粒的发现,1938 Muller,X-ray,四膜虫,Drosophila,末端极少发生缺失和倒位,推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定,.,并定名为,Telomere,1938 B.McClintock,顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。,推测染色体末端具有特殊端粒结构。,1970s,分子生物学发展 端粒研究获得突破,端粒,DNA,(Telomer),TTGGGG(T2G4),序列高度重复的末端,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG,3(rich G chain),3,AACCCC AACCCC AACCCC,5 (rich C chain),1985.Carol Greider&Blackburn,1986.,Gottchling,尖毛虫,telomere binding protein,1 55kd,telomere binding protein,2 26 kd,四膜虫,telomerase,将,T,2,G,4,末端重复延伸,游扑虫,Telomerase,=,RNA CAAAACCCC,链,+,末端结合蛋白,（,TBP,）,+,100 bp telomere,长 短,细胞分裂次数与端粒长短呈正比,细胞分裂,端粒阈值,端粒长短,端粒酶活,Harley(1989),端粒的重复片段为探针检测,胎儿细胞株,婴儿细胞株,青年细胞株,老年细胞株,年龄,小 大,端粒长度,早老性侏儒症的端粒明显较正常人短,“,多莉”的衰老,研究端粒（记时器）丢失的速率,/,年，预测人类的寿命,XX XY why?,PCD,机制、癌细胞的无限繁殖,六、,DNA,的损伤及其修复,DNA,的损伤形式包括：,碱基修饰、碱基改变、核苷酸删除和插入、,DNA,链的交联、磷酸二酯键骨架的断裂,。,损伤可造成突变或致死。,许多,DNA,损伤可修复。,只有逃过修复的损伤才会造成突变。,突变,（,mutation,）：指一种遗传状态，可以通过,复制而遗传的,DNA,结构的任何永久性改变。,携带突变基因的生物称为,突变体,。,未突变的称为,野生型,。,DNA,是细胞内唯一可以修复的大分子。,（一）诱发突变的原因,物理,（紫外、高能射线、电离辐射）,化学,（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）,生物因素,（碱基对置换、碱基的插入,/,缺失造成移码）,光聚合反应,胸腺嘧啶碱基在紫外光照射下，可以发生二聚加成反应：,在,DNA,分子中，如果两个胸腺嘧啶碱基相邻，在紫外光照射下，可能发生上述聚合反应，其结果是破坏了正常复制或转录。,物理因素,当,DNA,受到大剂量紫外线（波长,260nm,附近）照射时，可引起,DNA,链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如嘧啶二聚体（,TT,二聚体）。,化学因素,化学因素是引起,DNA,结构发生变化的最常见因素，主要包括：烷基化试剂，亚硝酸盐以及碱基类似物等。,烷基化试剂能够与,DNA,分子中的氨基或氧作用，生成烷基化,DNA,。除了碱基上有多个位置可被烷基化外，,DNA,链上磷酸二酯键中的氧也容易被烷基化，从而导致,DNA,链的断裂。,烷基化反应,由于含氧碱基存在酮式和烯醇式的互变异构，烯醇式中的羟基可以被烷基化转变为稳定的烯醇醚。,鸟嘌呤核苷烷基化形成,6-,甲氧基鸟嘌呤核苷后，不再与,C,配对，而与,T,配对。,这种情况将引起,DNA,的复制、转录及信息表达出现错误。,环外氨基的反应,环外氨基在适当条件下，也可以发生化学反应。,胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变,DNA,的碱基组成。,腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷也能发生类似的反应，分别形成次黄嘌呤核苷（,I,）和黄嘌呤核苷（,X,）。,这种变化，将影响或改变碱基形成氢键的能力和方向，导致,DNA,复制错误，是引起基因突变的重要原因之一。,碱基类似物是一类结构与核酸碱基相似的人工合成或天然化合物，由于它们的结构与核酸的碱基相似，当这些物质进入细胞后能够掺入到,DNA,链中，干扰,DNA,的正常复制和转录。,常见的有碱基衍生物及稠环、稠杂环类化合物。例如,5-,溴尿嘧啶（,5-BU,），它与胸腺嘧啶碱基的结构相似，能取代,T,与,A,配对。,又如一种称为二恶英的含氯芳香杂三环化合物（,2,3,7,8-,四氯,-,二苯,-,二恶英，简称,TCDD,），是一种具有强烈致癌和致畸物质。它能够进入细胞并与,DNA,结合，导致,DNA,复制发生错误，从而可能诱发癌变。,（二）,突变分子改变的类型,措配、缺失、插入、重排。,碱基顺序颠倒，如,TA,被颠倒成,AT,某个碱基被调换，如,AT,换成,GC,（二）,突变分子改变的类型,胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变,DNA,的碱基组成。,（二）,突变分子改变的类型,少了或多了一对或几对碱基，例如：,5,ATGG,C,TATGC 3,变成,5,ATGGTATGC 3,3,TACC,G,ATACG 5,3,TACCATACG 5,（二）,突变分子改变的类型,遗传变异的化学本质,DNA,结构的改变将导致相应蛋白质一级结构（氨基酸顺序）的变化，从而引起生物特征或性状发生变异。,所以，一切生物的变异和进化都可以认为是由于,DNA,结构的改变而引起蛋白质组成和性质变化的结果。,（三）,DNA,损伤的修复,DNA,修复,指针对已发生了的缺陷而实行的补救机,制，主要有光修复、切除修复、重组修复和,SOS,修复。,1,、光修复,（,photoreactivation,）,可见光（最有效波长,400nm,）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。,是一种高度专一的修复形式，只分解由于,UV,照射而形成的嘧啶二聚体。,光修复酶,2,、切除修复（,excision repair,）,是细胞内最重要的修复机制在一系列酶（,DNA,聚合酶,、连接酶、解旋酶）的作用下，将,DNA,分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使,DNA,恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。,细胞的修复功能对于保护遗传物质,DNA,不受破坏有重要意义。,3,、重组修复（,recombination repair,）,又称复制后修复（,postreplication repair,）,受损伤的,DNA,在进行复制时，跳过损伤部位，在子代,DNA,链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。,4,、,SOS,修复,指,DNA,受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种,DNA,修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（,Error-Prone Repair,）。,基因重组与,DNA,克隆（基因工程）,限制性内切酶,能识别,DNA,特定核苷酸序列的核酸内切酶,分布：,主要在微生物中。,特点：,特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。,结果：,产生黏性未端（碱基互补配对）。,举例：,大肠杆菌的一种限制酶能识别,GAATTC,序列，并在,G,和,A,之间切开。,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将,DNA,分子切断。目前已发现的限制酶有,400,500,多种。,运载体种类,：,质粒、噬菌体和动植物病毒。,质粒的特点,:,细胞染色体外能自主复 制的小型环状,DNA,分子；,质粒是基因工程中最常用的运载体；,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；,存在于许多细菌及酵母菌等生物中；,质粒的存在对宿主细胞无影响；,质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,DNA,重组与克隆,从细胞中分离出,DNA,限制酶截取,DNA,片断,分离大肠杆菌中的质粒,DNA,重组,用重组质粒转化大肠杆菌,培养大肠杆菌克隆大量基因,重组体的筛选,PCR,(polymerase Chain reaction),聚合酶链式反应,PCR,也称体外酶促基因扩增，原理类似天然,DNA,复制。靶,DNA,分子变性后解链，两条单链,DNA,分别与两条引物互补结合，在,4,种,dNTP,存在和合适和条件下，由耐热的,Taq DNA,聚合酶催化引物由,5,3,扩增延伸，形成两条新的双链,DNA,分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、复性、延伸循环，模板,DNA,增加一倍。经过,30,50,个循环，可使原,DNA,量增加,106,109,倍。,PCR,的主要步骤：,模板,DNA,的变性,一般选用,95,左右,1min,，使,DNA,双链解为单链,复性,按引物实际情况确定适当温度，时间一般,30s,至,1.5min,延伸,一般,72 1min,循环数,按初始模板浓度确定，一般,25,45,之间,PCR,的引物设计,PCR,扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的设计是,PCR,成功的关键，,引物位置和产物长度,根据不同目的和要求确定，长度一般在,200,800bp,之间,引物的长度,一般为,18,25bp,末端核苷酸,3,端不得有任何修饰,G,C,含量和,Tm,值,一般在,40,60%,之间，两条相差,2,3,10.2 RNA,的生物合成,DNA,携带的遗传信息传递给,RNA,分子的过程称,转录,（,transcription,）,。,在生物界，,RNA,合成有两种方式：一是,DNA,指导的,RNA,合成，此为生物体内的主要合成方式。另一种是,RNA,指导的,RNA,合成，此种方式常见于病毒。转录产生的初级转录本是,RNA,前体（,RNA precursor,），需经加工过程（,processing,）方具有生物学活性。,一、原核生物中的基因转录,合成方向：,5,3,从头合成。,连接方式：,3,5,磷酸二酯键。,5-,末端的起始核苷酸常为,GTP,或,ATP,。,合成过程,:,连续,转录特点：,不对称转录,-DNA,片段转录时，双链,DNA,中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录。,模板链,(template strand),及,反义链,(antisense strand):,指导,RNA,合成的,DNA,链为模板链，又称反义链。,编码链,(coding strand),及有义链,(sense strand),：,不作为转录的另一条,DNA,链为编码链，又称有义链。,由于基因分布于不同的,DNA,单链中，即某条,DNA,单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。,原料：,四种三磷酸核苷,NTP,DNA,中的,T,在,RNA,合成中变为,U,。,转录基本特点,调节基因,启动子,操纵,基因,lacZ,lacY,lacA,CAP,cAMP,CAP-cAMP,复合物,mRNA,+,-,半乳糖苷酶,-,半乳糖苷透过酶,-,半乳糖苷乙酰,基转移酶酶,“,转录单位,”,（,transcriptionunit,）：,以,操纵子,（,operon,）为转录的功能单位,结构上包括四个功能区：多顺反子（结构基因区）、启动子、操作子、终止子和调节基因。,识别,解链,起始,延伸,终止,终止位点,起始位点,大肠杆菌的,RNA,聚合酶,全酶由,5,种亚基,2,组成,。,因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与,2,分离。,没有,亚基的酶,称为核心酶,只催化链的延长，对起始无作用。,只有全酶能够找到转录的起始位点并起始。,五种亚基的功能分别为：,亚基：,与启动子结合功能，决定转录的基因类型。,亚基：,含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯键，参与转录的全过程。,亚基：,在全酶中存在，功能不清楚。,亚基：,与,DNA,模板结合功能。参与转录的全过程。,亚基：,识别起始位点，转录延长时脱落。,1.,启动子和起始,启动子是基因起始处的,DNA,序列。,识别正确的启动位点，启动子的结构至少由三部分组成：,-35,序列提供了,RNA,聚合酶全酶识别的信号；,-10,序列是酶的紧密结合位点（富含,AT,碱基，利于双链打开）；第三部分是,RNA,合成的起始点。,解旋从,RNA,聚合酶结合的启动子部位开始，然后从起始位点的核苷酸处起始,RNA,链的合成。第一位点被定义为基因序列的,+1,位置。,5,3,+1,转录起始点,AACTGT,ATATTA,TTG,ACA,TA,TAA,T,5,3,35,序列,Sextama,框,10,序列,Pribnow,框,+1,对解旋很重要,最保守,2.,转录起始,加入的第一个核苷三磷酸常是,GTP,或,ATP,。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，,亚基就会被释放脱离核心酶。,-35,-10,pppG,或,pppA,5,5,3,3,模板链,E,3.,链的延伸,以,NTP,为原料和能量,DNA,模板链为模板，,靠核心酶的催化，,核苷酸间通过,3,5-,磷酸二酯键成核糖核酸链,(RNA),。转录的第一个核苷酸总是,pppG,或,pppA,。,4.,转录终止,转录终止在特殊的终止子序列。,转录终止信号分两类,：,一类是不依赖,因子,(,即,蛋白,),，另一类是依赖,因子。,不依赖于,因子的这一类,，,其,DNA,链的,3,端附近有富含,GC,的回文区域和随后的一段富含,AT,的序列。当以这段终止信号为模板转录出的,RNA,即形成具有茎环的发夹形结构,(hairpin structure),，其,3,端含有一串,UUUU,的尾巴（图,8.40,），这种发夹结构阻碍了聚合酶的进一步延伸，,RNA,链的合成即终止。,另一类依赖因子的终止,，其,DNA,链的,3,端附近的回文序列没有富含,G-C,碱基的区域，后面也没有连续的,A,存在，需,因子的参与才能完成链的终止。,因子是由,基因编码的相对分子质量为,55 000,的蛋白质。现在一般认为,因子是与正在合成的,RNA,链相结合，并利用水解,ATP,或其他核苷三磷酸释出的能量从,5-3,端移动，当聚合酶遇到终止信号时，聚合,酶移动速度减慢，,因子就很快追赶上来，,使转录终止，释放,RNA,，,并使,RNA,聚合酶与,因,子一起从,DNA,上脱落下,来。,二、真核生物的转录作用,酶类,分布,产 物,活性,分子量,(KDa),反应条件,核仁,rRNA,（,5.8S,、,18S,、,28S,）,50,70,500,低离子强度要求,Mg,2+,或,Mn,2+,核质,mRNA,、,snRNA,20,40,700,高离子强度,核质,tRNA,、,5SrRNA,、,snRNA,、,7sRNA,10,700,高,Mn,2+,浓度,1.,真核,RNA,聚合酶,2.,转录,真核,RNA,转录基本过程与原核类似，但其产生的,mRNA,为,“,单顺反子,”,，只编码一条肽链。,转录产物的“加工”（成熟过程）,在细胞内，由,RNA,聚合酶合成的原初转录物（,primary transcript,）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、,5,和,3,末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的,RNA,分子。此过程总称为,RNA,的成熟,或称为,RNA,的转录后加工,。,原核生物的,mRNA,转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。,rRNA,前体的转录后加工,tRNA,前体的加工,真核,mRNA,前体的加工,rRNA,前体的加工,r,RNA,基因之间以纵向串联的方式重复排列。,加工过程：,1,、剪切作用：需核酸酶参与。,2,、甲基化修饰：修饰在碱基上。,3,、自我剪接：一种核酶的作用。,原核,rRNA,加工：,rRNA,含非转录的间隔区，其产物中含,tRNA,真核,rRNA,加工：,1.5S,自成体系加工少无修饰和剪接。,2.45S,加工中含剪切和甲基化修饰，需核酸酶。,tRNA,前体的加工,tRNA,前体在,tRNA,剪切酶的作用下，切成一定在小的,tRNA,分子,3,末端加上,CCA,碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用,真核,mRNA,前体的加工,剪接（,Splicing,）,去除内含子，连接外显子,5,帽端结构的生成（,5,端加,7-,甲基化鸟苷，防止外切酶的 攻击）,3,端多聚,A,（,polyA,）的附加,RNA,的复制合成（,RNA,指导的,RNA,合成）,噬菌体,Q,的,RNA,复制两阶段,（,1,）其单链,RNA,可充当,mRNA,，利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白和,RNA,复制酶的,亚基。,（,2,）复制酶的,亚基可与来自寄主细胞的亚基,自动装配成,RNA,复制酶，可进行,RNA,的复制，以分子中单链,RNA,为模板（正链），复制出一条新的,RNA,链（负链），再复制出正链，与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。,某些,RNA,病毒可以以自身,RNA,为模板进行复制。,不同的,RNA,病毒复制方式不同,5,RNA-,5,3,3,RNA+,释放,释放,3,5,3,3,5,5,RNA+,RNA+,RNA-,RNA-,及,RNA+,的合成方向均为,5 3,核酶,1982,年,Cech,发现四膜虫,rRNA,前体自我剪接作用，,RNA,有催化作用,;1983,年发现,RNase P,中的,RNA,可催化,tRNA,前体的加工。,核酶自我切割区内有锤头结构,（,hammer-head structure,）,，,其中的结构特点是：,（,1,）三个茎区形成局部的双链结构；其中含,13,个保守的核苷酸，,N,代表任何核苷酸。,（,2,）图中的箭头表示自我切割位点，位于,GUX,的,X,外侧，,X,可表示为,C,、,U,或,A,，不能是,G,。,核酶的生物学意义,1.RNA,为生物催化剂，具有重要生物学意义。,2.,打破了酶是蛋白质的传统观念。,3.,在生命起源问题上，为先有核酸提供了依据。,4.,为治疗破坏有害基因，肿瘤等疾病提供手段。,基因表达转录调控方式,基因表达调控概述,原核生物以操纵子为单元进行表达和调控，特异的阻遏蛋白是控制原核启动序列活性的重要因素。,乳糖操纵子的调节机制,色氨酸操纵子的调节机制,I,调节基因,P,启动子,O,操作子（操作基因）,Z,、,Y,、,A,三种结构基因,阻遏蛋白的负性调节,当无诱导物乳糖存在时，调节基因编码的阻遏蛋白（,repressor protein,）处于活性状态，阻止,RNA,聚合酶与启动基因的结合，则无法启动转录。,当有乳糖存在时，,lac,操纵子（元）即可被诱导。乳糖进入细胞，经,半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与,O,序列解离、转录发生。,异丙基硫代半乳糖苷（,IPTG,）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。,CAP,（代谢产物活化蛋白）的正性调节,当没有葡萄糖及,cAMP,浓度较高时，,cAMP,与,CAP,结合，这时,CAP,结合在,lac,启动序列附近的,CAP,位点，可刺激,RNA,转录活性。葡萄糖的分解代谢产物能抑制腺苷酸环化酶活性并活化磷酸二酯酶，从而降低了,cAMP,的浓度，,CAP,不能被活化形成,CAP,cAMP,复合物，则不能转录。,lac,阻遏蛋白负性调节与,CAP,正性调节两种机制协调合作：当,Lac,阻遏蛋白封闭转录时，,CAP,对该系统不能发挥作用；但是如果没有,CAP,存在来加强转录活性，即使阻遏蛋白从操纵序列上解聚仍几无转录活性。,lac,操纵子强的诱导作用既需要乳糖存在又需缺乏葡萄糖。,10.3,蛋白质的生物合成,Reverse,transcription,遗传信息,基因的遗传信息在转录过程中从,DNA,转移到,mRNA,，再由,mRNA,将这种遗传信息表达为蛋白质中氨基酸顺序的过程叫做,翻译,。,合成体系：,20,种氨基酸,mRNA,、,tRNA,、核蛋白体、酶和因子,以及无机离子、,ATP,、,GTP,合成方向：,NC,端。,翻译过程分为：,起始、延长、终止,3,个阶段。,真核细胞,一、遗传密码,密码子