分子生物学---第9章-原核生物基因表达调控.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,教学要求,掌握操纵子的结构,理解诱导和阻抑操纵子的调控机制,理解葡萄糖对乳糖操纵子的调控方式,掌握色氨酸对操纵子的阻抑和弱化作用,第1节,基因表达调控的基本概念,第2节 The Lac operon 乳糖操纵子,第3节 The trp operon 色氨酸操纵子,第4节,不同,因子对转录的调节,主要内容,第1节,基因表达调控的基本概念,一、基因表达的概念,gene expression,：,基因转录及翻译的过程。对这个过程的调节就称为,gene regulation,。,rRNA、tRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达,2、,适应性表达,指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。,应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导,(induction),，这类基因被称为,可诱导的基因,(inducible gene),；,相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏,(repression),，相应的基因被称为,可阻遏的基因,(repressible gene),。,三、基因表达的规律 时间性和空间性,1、时间特异性（,temporal specificity）,按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，称之为基因表达的,时间特异性,。,多细胞生物基因表达的时间特异性又称,阶段特异性(stage specificity)。,2、空间特异性(spatial specificity),基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称,细胞或组织特异性,(cell or tissue specificity),。,在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，,称之为基因表达的,空间特异性,。,四、基因表达调控的生物学意义,适应环境、维持生长和增殖,（原核、真核）,维持个体发育与分化,（真核）,五、基因表达调控的基本原理,(一)基因表达的多级调控,基因表达调控可见于从基因激活到蛋白质生物合成的各个阶段，因此基因表达的调控可分为,转录水平（基因激活及转录起始）,转录后水平（加工及转运）,翻译水平,翻译后水平,但以转录水平的基因表达调控最重要,。,（二）基因转录激活调节基本要素,1.顺式作用元件,2.反式作用因子,3.RNA聚合酶,(1)原核生物的顺式作用元件,原核生物基因表达与调控是通过操纵子机制来实现的。其顺式作用元件由启动基因、操纵基因组成。,(2)真核生物的顺式作用元件,在真核生物中，与基因表达调控有关的顺式作用元件主要有启动子,（promoter）、增强子（enhancer）和沉默子（silencer）,1.,顺式作用元件：又称分子内作用元件，指存在于DNA分子上的一些与基因转录调控有关的特殊顺序。,操纵子,The,operon,model,操纵子模型,Jacob and,Monod,1961,获,1965,年诺贝尔生理学和医学奖,操纵子：是基因表达的协调单位，由调节基因、启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。,Structural genes,(,结构基因,),：,用于表达参与特异生化合成途径所需的酶。,Control elements,(,调控元件,),：调节结构基因转录的一段,DNA,序列，包括启动子、操纵基因等。,Regulator,gene(s,)(,调节基因,),：,编码合成那些参与基因表达调控的,RNA,和蛋白质的特异,DNA,序列。,Control element,Structural genes,操纵子,调节基因 启动序列 操纵序列,编码序列（,结构基因,）,表达,转录,I,CAP,P,O,Z,Y,A,阻遏蛋白,结合部位,RNA聚合酶,结合部位,多顺反子mRNA,功能上相关联的多个结构基因受同一启动序列调控，被一起转录和翻译生成多种蛋白质的,mRNA,。,启动序列（P）：,其中的,-35区,-10区,是RNA聚合酶识别并结合的部位。,多顺反子mRNA,阻遏蛋白,（负性调节）,（,正性调节,）,多种蛋白质,R,P,O,ST,1,ST2,T,启动 操纵,调节基因 基因 基因 结构基因,控制区,操纵元,信息区,操纵元模型的一般结构,2反式作用因子（trans-acting factor）,定义：又称为分子间作用因子，指一些与基因表达调控有关的蛋白质因子。反式作用因子与顺式作用元件之间的共同作用，才能够达到对特定基因进行调控的目的。,1)原核生物的反式作用因子,（3类）,特异因子,决定RNA聚合酶对启动序列的特异识别和结合能力；,(如,RNA聚合酶的,因子,),阻遏蛋白,通过与操纵序列结合，阻遏基因转录，发挥负性调控作用；,（,由调节基因表达的阻遏蛋白,）,激活蛋白,与启动子上游DNA序列结合，促进RNA聚合酶转录活性，发,挥正性调控作用。（如，,CAP,分解代谢物基因活化蛋白,）,2)真核生物的反式作用因子,真核生物中的反式作用因子通常称为转录因子,按其功能不同，常有以下三类：,基本转录因子,转录调节因子,共调节因子,3.,RNA聚合酶,1.,启动子碱基序列变化影响RNA聚合酶活性,（,尤其10区和35区的共有碱基序列变化,）,2.调节蛋白构象变化影响RNA聚合酶活性,第2节 The Lac operon 乳糖操纵子,一、乳糖操纵子的结构,二、乳糖操纵子的调节机制,一、乳糖操纵子的结构,大肠肝菌能够利用乳糖：,环境中乳糖作为唯一碳源 表达并合成一系列与乳糖代谢相关的酶类,环境中没有乳糖 编码上述乳糖代谢酶的基因则被关闭,The lac operon,Lac repressor,抑制因子,Transcription blocked,Inducer,Activate,the,P,lac,transcription,CRP+cAMP(glucose repressed),High level of transcription,(诱导子，Lactose),Overview,一、乳糖操纵元的结构,i基因 P O,lacZ lacY lacA,阻遏,基因,CAP,启动子,操纵基因,结构基因,代谢激活蛋白结合位点,一、乳糖操纵子的结构,(一)乳糖操纵子的结构,a regulatory gene(,调节基因,):Lac I,encode the,lac,repressor(,编码乳糖阻抑物,),3,stuctural,genes(,结构基因,):Lac Y,、,Lac Z,、,Lac A,2 control elements(,调控元件,):,P,lac,（启动子,),、,O,lac,(,操纵基因位点,),lac,I,Regulatory gene,lacZ,lacY,lacA,DNA,m-RNA,-Galactosidase,Permease,Transacetylase,Protein,Structural Genes,P,lac,I,P,lac,O,lac,lacY,编码,半乳糖苷渗透酶,),，促进半乳糖苷进入细胞,lac,Z,编码,半乳糖苷酶，将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,lac,A,编码,硫代半乳糖苷转乙酰酶,G2:The LAC operon,lacZ,lacY,lacA,三个结构基因位于同一个转录单元中。,1.结构基因,G2:The LAC operon,2.操纵基因,位于,-5,至,21,这段区域，和启动子的右侧末端重叠，,2628bp,是阻遏蛋白的结合位点。,(,回文对称,):,当一条链以,5,到,3,方向从左向右读与其互补链,5,到,3,方向从右向左读时具有相同的序列。,以+11为对称轴，每边为两段各6bp反向重复序列,3.,乳糖阻抑物,Regulation,of Transcription in Prokaryotes,(1)是由4个相同亚基组成的同源四聚体,(2)具有两个结合位点：操纵基因结合位点和诱导物结合位点,(3)无诱导物存在时，能阻止基因的转录,诱导物通过与阻遏物结合，改变它的构象，使之不能与操纵区相结合，激活基因转录。,(4)阻遏蛋白和DNA的结合能增强RNA聚合酶结合DNA的能力,乳糖操纵元的双调控系统：,(1)受乳糖与阻遏蛋白调控的、可诱导的负调控系统;,(2)受cAMP与CAP调节的、可诱导的正调控系统。葡萄糖通过调节cAMP的合成间接监控这一过程。,以此保证大肠杆菌灵活、经济、有效地适应外界环境，只有在必需的时候（只有乳糖，没有葡萄糖）才启动乳糖操纵子的表达。,二、乳糖操纵子的调节机制,二、乳糖操纵子的调节机制,(一)负调节机制,1.无,诱导物时，阻抑物与操纵基因结合，阻止转录,2.,Induction 诱导,诱导物跟乳糖阻抑物结合，改变了阻抑物的构象，使其不能结合到操纵位点上。,G2:The LAC operon,诱导物和结合于操纵基因上的阻遏物结合，使其从操纵基因上释放。而不是和游离阻遏物结合，影响阻遏物和DNA结合的平衡,诱导物改变阻遏蛋白在DNA上的分布，而不是产生游离阻遏蛋白：,随机,DNA,序列和阻遏蛋白也具有亲和力，但比操纵基因和阻遏蛋白的亲和力低,10,7,倍,诱导物和阻遏蛋白结合时，阻遏蛋白和操纵基因的亲和力下降，所有阻遏蛋白结合在,DNA,的随机序列上,除去诱导物后，阻遏蛋白恢复活性，从随机位点直接转移到操纵基因上,i,p,o,z,y,a,Very low level of lac mRNA,Absence of lactose,Active,i,p,o,z,y,a,b,-Galactosidase,Permease,Transacetylase,Presence of lactose,Inactiv,e,Lactose(乳糖),is present,the low basal level of,permease(透过酶),allows its uptake,and-galactosidase,(半乳糖苷酶),catalyzes the conversion of some lactose to allolactose,(异乳糖).,Allolactose acts as an inducer,binding to the lac repressor and inactivate it.,Lactose,(allolactose)：天然的诱导物,IPTG,(异丙基-,b,-D-硫代半乳糖苷),人工合成的诱导物，,能快速激活乳糖操纵子结构基因的转录，但自身不被分解(义务诱导物),IPTG is used to induce the expression of the cloned gene from LacZ promoter in many vectors,such as pUC19.,Amp,r,ori,pUC18,(3 kb),MCS(Multiple cloning sites,多克隆位点）,Lac promoter,lacZ,Gene X,No IPTG,little expression of X gene,With IPTG,efficient expression of X gene.,L1:The LAC operon,可诱导调控的操纵元，其基因表达产物都是利用某种营养物的酶体系（分解代谢）,有营养物 相应基因开放,无营养物 细胞就没必要产生相应的酶,2,CAP位点,操纵序列,RNA聚合酶,启动序列,cAMP,mRNA 5,DNA结合区,与CAP位点结合,CAP,(同二聚体),含,cAMP结合区,cAMP-CAP复合物（,有活性,）,CAP,（二）CAP的正性调节作用,1.,CRP，cAMP受体蛋白,G2:The LAC operon,CRP,是一种,转录激活因子,(,分解代谢激活蛋白,CAP),与,cAMP,结合后才有活性：,CAP,与,cAMP,结合后，发生空间构象的变化而活化，能以二聚体的方式与特定的,DNA,序列结合，从而增强,RNA,聚合酶的转录活性，可使转录提高,50,倍,cAMP,水平受 葡萄糖调节,CRP,激活因子参与分解代谢操纵子对葡萄糖水平反应的基因表达的全局调控。,cAMP,：,Cyclic AMP,ATP在腺苷酸环化酶的作用下转变成环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)。,When glucose is present,当葡萄糖存在时，细胞中cAMP含量低，CRP以二聚体的形式存在，从而不能跟DNA结合调控转录。,When glucose is absent,当葡萄糖缺乏时，cAMP含量升高，与CRP结合；CRP-cAMP复合物结合到启动子中RNA聚合酶结合位点上游的序列，使DNA弯曲90,，增强了RNA聚合酶跟启动子的结合，使转录提高了50倍。,CRP-binding site is an inverted repeat.,正调节,当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用,如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。,cAMPCAP复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。,(三)协调调节,葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称,分解代谢阻遏(catabolic repression)。,单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。,The,Lac,Operon:,When Glucose Is Present But Not Lactose,Repressor,Promoter,LacY,LacA,LacZ,Operator,CAP,Binding,RNA,Pol.,Repressor,Repressor,Repressor,mRNA,Hey man,Im,constitutive,Come on,let me through,No way,Jose!,CAP,The,Lac,Operon:,When Lactose Is Present But Not Glucose,Repressor,Promoter,LacY,LacA,LacZ,Operator,CAP,Binding,Repressor,Repressor,mRNA,Hey man,Im,constitutive,CAP,cAMP,Lac,Repressor,Repressor,X,This lactose has,bent me,out of shape,CAP,cAMP,CAP,cAMP,Bind to me,Polymerase,RNA,Pol.,RNA,Pol.,Yipee!,The,Lac,Operon:,When Glucose and Lactose are Present,Repressor,Promoter,LacY,LacA,LacZ,Operator,CAP,Binding,RNA,Pol.,Come on,let me through,CAP,Repressor,Repressor,mRNA,Hey man,Im,constitutive,Repressor,Repressor,This lactose has,bent me,out of shape,Lac,X,The,Lac,Operon:,When Neither Lactose Nor Glucose Is Present,Repressor,Promoter,LacY,LacA,LacZ,Operator,CAP,Binding,CAP,cAMP,CAP,cAMP,CAP,cAMP,Bind to me,Polymerase,RNA,Pol.,Repressor,Repressor,mRNA,Hey man,Im,constitutive,Repressor,STOP,Right there,Polymerase,Alright,Im off to,the races.,Come on,let,me through!,第2节 The,Trp,Operon,色氨酸操纵子,一、色氨酸操纵子的结构,二、色氨酸操纵子的调节机制,三、正调控系统和负调控系统,Regulation,of Transcription in Prokaryotes,调控基因,结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸 的酶,一、色氨酸操纵元的结构,trpR,trpR,P,Leader,前导序列,编码色氨酸合成所需的,5,种结构基因,当细胞中色氨酸短缺时，这些基因协同表,1.特点:,(1),trpR,和,trpABCDE,不连锁；,(2)操纵基因在启动子内,(3)有衰减子(attenuator)/弱化子,(4)启动子和结构基因不直接相连，二者被,前导序列(Leader)所隔开,A,B,C,G3:The trp operon,G3:The trp operon,二、色氨酸操纵子的调节机制,(一)负调控机制,(二)弱化系统,Regulation,of Transcription in Prokaryotes,调节基因,trpR,编码色氨酸阻抑物,与色氨酸形成复合物后，与操纵基因相结合，阻止结构基因的转录,Trp,：,协同抑制因子,，能抑制色氨酸的合成,(,负反馈调控,),能使转录的起始效率下降,70,倍,是一种,粗调控机制，调节转录的起始,(一)负调控机制,G3:The trp operon,The repressor is a,dimer(二聚体),of two subunits which has a structure with a,central core,(中心区域),and two flexible,DNA-reading heads(DNA解读头部),(carboxyl-terminal of each subunit),central core,DNA-reading heads,色氨酸阻抑物,G3:The trp operon,trpR,operon,trp,operon,O,阻遏蛋白,mRNA,Trp,trp,R,P,trp,E,trp,D,trp,C,trp,B,trp,A,转录生成162核苷酸长的,前导序列，,可以,形成,“衰减子”,结构,（,结构基因关闭,）,调节区,在高浓度色氨酸存在下，通过形成特殊的“,衰减子,”结构，对转录进行更精细的调控。,(二)弱化系统,有活性,1.,前导RNA的结构,Regulation,of Transcription in Prokaryotes,在trp mRNA5端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段。,含有四个互补序列区，碱基互补形成不同的结构,Complementary 3:4 termination of,transcription,Complementary 2:3 Elongation of transcription,free leader RNA,G3:The trp operon,2.,前导肽,Regulation,of Transcription in Prokaryotes,前导,RNA,含有一个有效的核糖体结合位点，并能编码一个由,14,个氨基酸组成的前导肽,该前导序列的第,10,个和,11,个密码子编码色氨酸。,单林娜 制作,70,3.弱化子：,DNA中可导致转录过早终止的一段核苷酸序列（123-150区）。,123150,Attenuator sequence,characteristic,位于前导序列,(,在,trpE,起始密码子之前,),的末端,非,依赖型的终止位点，有一富含,GC,的回文对称结构，紧跟着一串,8,个,U,残基序列,高效的转录终止子,3.,弱化作用,Regulation,of Transcription in Prokaryotes,Transcription and translation in bacteria are coupled,.,Therefore,synthesis of the leader peptide immediately follows the transcription of leader RNA,and the attenuation is possible.,High trp,(,attunation),Lack of trp,(proceeding through the whole operon),Transcription of the trp operon,During transcription of the RNA from trp operon,the RNA Polymerease pauses,at the end of,sequence 2,(sequences 1 and 2 form a hairpin),until a ribosome began to translate the leader peptide.,G3:The trp operon,单林娜 制作,75,Low tryptophan levels,当色氨酸浓度低时，生成的tRNA,trp,就少，核糖体在序列1的trp密码子处暂停，序列2和3之间形成配对结构，阻止了衰减，因为序列3不再与序列4之间形成衰减结构，RNA聚合酶得以沿DNA前进，继续去转录其后trpE等基因，trp操纵元就处于开放状态。,单林娜 制作,76,当色氨酸浓度增高时，tRNA,trp,浓度随之升高，核糖体快速翻译序列1(前导肽阅读框)，占据到2的机会增加，1和2生成发夹结构的机会减少，3和4形成类似终止子的衰减子结构的机会增多，导致RNA聚合酶终止转录。,High tryptophan levels,通过前导肽中核糖体所处的位置，实现RNA聚合酶对DNA转录的影响。,Low Trp,High Trp,Importance of attenuation,衰减作用的重要性,细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使,转录不起始,，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停下来。阻遏作用的信号是,细胞内色氨酸的多少,；,弱化作用的信号则是,细胞内载有色氨酸的tRNA的多少,。,它通过前导肽的翻译来控制转录的进行，在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。,Regulation,of Transcription in Prokaryotes,如果其他氨基酸不足，对转录有何影响？,三、正调控系统和负调控系统,1)根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白）的应答，可分为：,正转录调控,负转录调控,调节基因,操纵基因,结构基因,阻遏蛋白,激活蛋白,正转录调控,负转录调控,正转录调控,如果在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的调控正转录调控。,调节基因,操纵基因,结构基因,阻遏蛋白,激活蛋白,正转录调控,负转录调控,负转录调控,在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭，这样的调控负转录调控。,可诱导调节,：指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。,例：,大肠杆菌的乳糖操纵子,分解代谢蛋白的基因,根据操纵子对某些能调节它们的小分子的应答，可分为,可诱导调节,和,可阻遏调节,两大类：,调节基因,操纵基因,结构基因,阻遏蛋白,调节基因,操纵基因,结构基因,阻遏蛋白,诱导物,mRNA,酶蛋白,酶合成的诱导操纵子模型,诱导物,如果某种物质能够促使细菌产生酶来分解它，这种物质就是诱导物。,可阻遏调节：,基因平时是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。,例：,色氨酸操纵子,合成代谢蛋白的基因,酶合成的阻遏操纵子模型,调节基因,操纵基因,结构基因,mRNA,酶蛋白,调节基因,操纵基因,结构基因,辅阻遏物,辅阻遏物,如果某种物质能够阻止细菌产生合成这种物质的酶，这种物质就是辅阻遏物。,3)在,负转录调控系统,中，调节基因的产物是,阻遏蛋白,（,repressor,），起着阻止结构基因转录的作用。,根据其作用特征又可分为,负控诱导,和,负控阻遏,：,在,负控诱导,系统中，阻遏蛋白与效应物（诱导物）结合时，结构基因转录；,在,负控阻遏,系统中，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。,4)在,正转录调控,系统中，调节基因的产物是,激活蛋白,（,activator,）。,根据激活蛋白的作用性质分为,正控诱导,和,正控阻遏,在,正控诱导,系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态；,在,正控阻遏,系统中，效应物分子（,辅阻遏物）,的存在使激活蛋白处于非活性状态,。,Induction,Inducer,Inducer,Positive control,Negative control,负控诱导系统,正控诱导系统,Negative control,Positive control,Repression,Corepressor,Corepressor,负控阻遏系统,正控阻遏系统,Regulation,of Transcription in Prokaryotes,第4节,不同,因子对转录的调节,Sigma factor,Heat shock,热休克,Sporulation,in,B.,subtilis,枯草芽孢杆菌的孢子形成,Bacteriophage,factors,噬菌体,因子,factor subunit bound to RNA pol for transcription initiation,Released core enzyme,RNA elongation,1.factors is bifunctional(双功能蛋白)protein,Bind to core RNA Pol,跟核心,RNA,聚合酶结合,Recognize specific promoter,sequence,(-35 and 10)in DNA,识别,DNA,中特异的启动子序列,Transcriptional regulation by alternative,Factors,s,factor:,Transcriptional regulation by alternative,Factors,许多细菌能产生一系列不同的,因子，用以满足在正常和极端生长条件下调控转录的需要。,E.coli,:,Heat shock,热休克,Sporulation,in,bacillus subtilis,枯草芽孢杆菌的形成,Bacteriophage(,噬菌体)factors,Transcriptional regulation by alternative,Factors,大肠杆菌中的各种,因子比较,因子,编码基因,主要功能,70,rpo,D,参与对数生长期和大多数碳代谢过程基因的调控,54,rpoN,参与多数氮源利用基因的调控,38,rpoH,分裂间期特异基因的表达调控,32,rpoS,热休克基因的表达调控,28,rpoF,鞭毛趋化相关基因的表达调控,24,rpoE,过度热休克基因的表达调控,2.热休克,Transcriptional regulation by alternative,Factors,当温度高于,37C,，大肠杆菌特异的表达出,17,中蛋白质。,由,32,参与构成的,RNA,聚合酶与热休克应答基因启动子结合,诱导产生大量的热休克蛋白,适应环境需要,Comparison of the heat-shock,32,and general,70,responsive promoter,Consensus promoter,35 sequence 10 sequence,Standard,70,Heat shock,32,-,TTGACA,-1618bp-,TATAAT,T-C-C-,CTTGAA,-1315bp-CCC,CAT-T,Transcriptional regulation by alternative,Factors,Heat shock,Transiently expression,of the 17 heat shock proteins,Increase in temperature is more extremely(50C),Heat shock proteins are the,only proteins,made in E.coli to maintain its viability,From 37C to 42C,4.枯草芽孢杆菌芽孢形成,Transcriptional regulation by alternative,Factors,有序的,因子的替换,RNA聚合酶识别不同基因的启动子,使芽孢形成有关的基因有序地表达,G4-5:,Bacteriophage,factors,Transcriptional regulation by alternative,Factors,赋予寄主RNA聚合酶不同的启动子特性，可选择性的表达自身的噬菌体的基因。,B.subtilis,SPO1 phage,枯草芽孢杆菌的SPO1噬菌体,Normal bacterial holonzyme,Express early genes,Encode factor for transcription of late genes,Encode,28,Express middle genes(gene 34 and 33),本章要点,1.基因概念,顺式作用元件、反式作用因子、操纵子,2.乳糖操纵的组成结构及调节机制,3.色氨酸操纵子的组成及调节机制,4.弱化子的概念,5.正转录调控(正控阻遏、正控诱导)、负转录调控(负控阻遏、负控诱导),