分子生物学实验室工作手册第十二章课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,分子生物学实验室工作手册,第十二章：DNA、RNA、蛋白质,蛋白质,DNA,RNA,DNA,DNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度。DNA对紫外线有吸收作用，当核酸变性时，吸光值升高；当变性核酸可复性时，吸光值又会恢复到原来水平。温度、有机溶剂、酸碱度、尿素、酰胺等试剂都可以引起DNA分子变性，即使得DNA双键间的氢键断裂，双螺旋结构解开。,DNA,介绍,DNA是相当稳定的，这是保存和传递遗传信息的所必备的条件。但是对待DNA也不能大意，常常会DNA的污染。污染主要来源于其它的DNA,。,DNA的分离,概述：,1.DNA的分离现已多用试剂盒提取，有小量，中量，大量提取三种。实验室一般销小量提取多见。,2.试剂盒可分离基因组，染色体组以外的DNA。如：琼脂糖凝胶中分离DNA、PCR产物中分离DNA。,3.一般分离试剂盒是使用结合DNA的树脂或者滤膜，避免了酚抽提和CsCl超离心。,4.染色体外的DNA作为噬菌体或者质粒DNA被抽提出来。,5.大片段的DNA(30Kb)，必须小心操作，防止断裂。如：基因组。,6.不同实验对DNA的要求不一致，因此分离之后的鉴定也很重要，鉴定方法各不相同。例：酶切、测序等。,一.DNA的分离,1.,碱-SDS质粒小量制备,（1）培养物1.5ml，置于离心管内。,（2）10000g离心2min，弃上清。,（3）100ul预冷的solution,重悬，振荡2min。,（4）常温放置5min。（充分裂解释放DNA）,（5）200ul solution,，上下颠倒5s。（不要太剧烈，振荡会损伤DNA）,（6）水浴5min，12000g离心5min。,（7）加200ul冰上预冷的solution，上下颠倒20s，混匀。,（8）水浴5min，12000g离心5min，将上清移至新的EP管内。,（9）加入5ul 2mg/mlRNaseA,37度放5min。,（10）加入（,450ml,）的酚-氯仿抽提。（见后）,（11）乙醇浓缩。(见后),（12）70%乙醇沉淀，离心1min，吸去上清，挥发干酒精。,（13）25ulTE重悬沉淀，2-4ul电泳。,（14）-20保存。,2.DNA酚抽提,目的：去除DNA中的蛋白质,原理：酚和水互不相容，形成两相，DNA溶于水相，蛋白质溶于酚相。,方法：DNA样品+等体积的酚氯仿剧烈振荡 20s常温离心5min小心转移上层水相于新的EP管加入等体积酚氯仿重复抽提。,4.使用真空浓缩机(干燥浓缩的DNA),5.紫外分光光度计测定核酸浓度和纯度,紫外分光光度计测定核酸浓度和纯度,文本,文本,文本,文本,文本,文本,文本,文本,寡核苷酸（20bp）,文本,文本,文本,文本,文本,文本,文本,文本,二.DNA的扩增-PCR,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。生物体外的特殊DNA复制。,原理：PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95高温时变性会变成单链，低温（经常是60C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。,PCR反应体系,：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。,10扩增缓冲液,10l,4种dNTP混合物,200l,引物,10100l,模板DNA,0.12g,Taq DNA聚合酶,2.5 l,Mg2+,1.5mmol/L,加双或三蒸水,100 l,PCR的注意事项,1.远离PCR仪及其他污染源制备PCR样品。,2.PCR的移液器与其他移液器分开使用，防止交叉污染。,3.实验过程中戴手套和口罩，尽量不要说话。,4.反应体系中最后才加DNA。,三.将DNA导入细胞和微生物,原核细胞,1.一般转化法：扩增克隆的DNA（不表达载体的细菌）,获得大量DNA编码的蛋白质（表达载体的细菌）,2.与高浓度的钙离子温育：操作简单，耗时短，只需几分钟即可完成。,3.电转化：最佳条件取决于细菌物种,注意：载体和所选的细胞类型是转化成功与否的关键，实验之前要选好。,真核细胞,真核细胞的转化称为转染：转化+感染,感染:病毒介导的基因传递,报告基因：转染的携带DNA的细胞会表达一些报告基因而被选择出来。如：能抵抗某种抗生 素，GEP(绿色荧光蛋白)等。,转染的方法：,1.磷酸钙共沉淀法,2.DEAE右旋糖酐介导的转染,3.脂质体介导的转染,4.电转化,5.微注射,6.病毒介导的转导 例：SV40、腺病毒、逆转录病毒等,质粒,质粒（Plasmid）,：,是一类存在于细菌和真菌细胞中独立于DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子（covalently closed circular DNA）,也称为cccDNA,其大小通常在1100KB范围内。,质粒的分类,质粒分为两类：,1.,严紧型,质粒，当细胞染,色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒；,2.,松弛型,质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。,质粒,质粒的形式,：,超螺旋,DNA：,在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存,在。,开环,DNA：,如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处,断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛,型的环状分子，称开环DNA,。,线状,DNA：,如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则,形成线状DNA(LinearDNA）,。,当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分,子的泳动速度快。,当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA的两条,链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变,性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超,螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。,质粒的提取,从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：,1.,培养细菌使质粒扩增；,2.,收集和裂解细胞；,3.,分离和纯化质粒DNA。,采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁,。,十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。,经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。,碱-SDS质粒小量制备,（1）培养物1.5ml，置于离心管内。,（2）10000g离心2min，弃上清。,（3）100ul预冷的solution,重悬，振荡2min。,（4）常温放置5min。（充分裂解释放DNA）,（5）200ul solution,，上下颠倒5s。（不要太剧烈，振荡会损伤DNA）,（6）水浴5min，12000g离心5min。,（7）加200ul冰上预冷的solution，上下颠倒20s，混匀。,（8）水浴5min，12000g离心5min，将上清移至新的EP管内。,（9）加入5ul 2mg/mlRNaseA,37度放5min。,（10）加入（,450ml,）的酚-氯仿抽提。（见后）,（11）乙醇浓缩。(见后),（12）70%乙醇沉淀，离心1min，吸去上清，挥发干酒精。,（13）25ulTE重悬沉淀，2-4ul电泳。,（14）-20保存。,Thanks,