国标SNT5194-2020羊传染性脓疱皮炎检疫技术规范规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 51942020代替 SN/T 11622002羊传染性脓疱皮炎检疫技术规范Quarantine protocol for contagious pustular dermertitis of sheep and goat 中华人民共和国海关总署发 布ICS 11.220CCS B 412020-12-30 发布2021-07-01 实施ISN/T 51942020前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国长春海关、中华人民共和国宜兴海关、中华人民共和国惠州海关、吉林省畜牧兽医科学研究院。本文件主要起草人：孟庆峰、周宇、童明龙、王伟利、程荣华、姚贵哲、孟日增、王伟琳、宋战昀。1SN/T 51942020羊传染性脓包皮炎检疫技术规范1范围本文件规定了羊传染性脓疱皮炎临床诊断、病毒分离、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应检测技术。本文件适用于羊传染性脓疱皮炎的检疫检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规程和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行检测，所有培养物和废弃物应按照 GB 19489 中的有关规定执行。5试剂和材料5.1所用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。5.2犊牛睾丸原代细胞的制备（见附录 A 中 A.1）。5.30.01 mol/L（pH7.2）PBS（见附录 A 中 A.2）。5.410%十二烷基硫酸钠（见附录 A 中 A.3）。5.520 mg/mL 蛋白酶 K（见附录 A 中 A.4）。5.6引物与探针根据羊传染性脓疱皮炎特异基因合成一套特异性引物。扩增产物大小为 488 bp。引物 1：5-CGGCGTATTCTTCTCGGACT-3引物 2：5-CGGACAGGTCCTTGACGATG-3根据羊传染性脓疱皮炎特异基因合成一套特异性引物与配套探针。引物 1：5-TGAACCGCTACAACACCT-3引物 2：5-GAGTCCGAGAAGAATACGC-3探针：FAM-AACTTCCACCTCAACCACTCCG-TAMRA2SN/T 519420205.7阳性对照：可溯源的标准毒株，或含目的片段的 DNA 亦可。5.8分子生物学试剂：10PCR 缓冲液、dNTP（2.5 mmol/L）、Taq DNA 聚合酶（5U/L）、ExTaq Hs（5U/L）。5.90.2 mL 和 1.5 mL 塑料离心管。5.10吸头，配套移液器使用。5.11灭菌三角烧瓶：250 mL，500 mL。6仪器和设备6.1PCR 仪。6.2荧光 PCR 仪。6.3电泳仪。6.4凝胶成像系统。6.5生化培养箱：-5 1 50 1。6.6生物安全柜。6.7电子天平：感量 0.1 g。6.8均质器。6.9生物显微镜。6.10移液器：量程 0.5 L10 L，量程 10 L100 L，量程 100 L1 000 L。6.11高速冷冻台式离心机（最高可达 13 000 r/min）。7临床诊断7.1临床症状临床症状主要分唇型、蹄型及外阴型，见附录 B 中 B.1。7.2剖检变化主要病变见附录 B 中 B.2。7.3流行病学主要流行病学见附录 B 中 B.3。7.4初步诊断根据临床症状、剖检变化、流行病学做出初步诊断。8病毒分离8.1样品处理采集疑似患病羊痂皮脓疱等病料，加 0.01 mol/L（pH7.2）PBS 研磨制成 110（质量体积）的悬液，5 000 r/min离心30 min，取上清液，按20%比例加入浓度为10 000 IU/mL的双抗（青、链霉素），4 感作过夜后，保存备用。3SN/T 519420208.2样品接种培养犊牛睾丸原代细胞长满 25 cm2细胞培养瓶单层后，弃上清营养液，接种病料处理上清液 l mL，37 吸附 2 h，弃上清液后加入含 2%血清的 MEM 细胞维持液，37 静止培养，同时设正常细胞对照及感染细胞对照。每天观察细胞生长情况和细胞病变（CPE）。若细胞在接种病料后 4d5d 内未出现病变则连续盲传 3 代后收取培养物；若有 CPE 出现，直接收取培养物。8.3结果鉴定8.3.1对照细胞正常，接种样品的细胞盲传 3 代后无 CPE，判为阴性。8.3.2细胞初期出现小病灶，病灶中的细胞圆缩，有折光性。进一步培养，CPE 增多，所有细胞脱壁。经过连续传代后可在 24 h48 h 后产生完全的 CPE。8.3.3出现上述典型 CPE 的培养物，用 PCR 和荧光 PCR 进行进一步鉴定。9PCR 检测方法9.1模板 DNA 的制备取待检样品 8.1 上清液 465 L，加入 25 L 10%十二烷基硫酸钠和 10 L 的 20 mg/mL 蛋白酶 K，50 水浴摇床上放置2 h；加入等量的饱和酚溶液500 L，振荡混匀20 s，12 000 r/min离心5 min，取上清液；加入等体积的酚三氯甲烷异戊醇（25241），振荡混匀 20 s，12 000 r/min 离心 5 min，取上清液；再加入等体积的三氯甲烷异戊醇（241），振荡混匀 20 s，12 000 r/min 离心 5 min，取上清液；最后加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，12 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，室温干燥后，加入 50 L 双蒸馏水溶解沉淀，既得 DNA 模板，-20 贮存备用。另外，DNA 提取也可采用等效的商品化 DNA 提取试剂盒，按照说明书进行操作。9.2反应体系反 应 体 系 为 25 L：10PCR 缓 冲 液（Mg2+Plus）2.5 L、dNTP（2.5 mmol/L）2.0 L、引 物（25 mol/L）各 1 L、Taq DNA 聚合酶（5U/L）5 L、模板 DNA 1 L、ddH2O 补足 25 L。9.3反应条件94 预变性 3 min；94 变性 30 s，56 退火 30 s，72 延伸 40 s，进行 40 个循环；72 延伸 10 min，4 保存。9.4结果观察用 1TAE 电泳缓冲液配制 1%的琼脂糖凝胶，加入最终浓度为 1 g/mL 的溴化乙锭。用 100 bp DNA ladder Marker 作为对照，对 PCR 产物进行电泳。在凝胶成像系统上观察有无目的大小的特异性条带。必要时可以对扩增的条带进行测序分析。9.5结果判定在空白对照和阴性对照均无特异条带扩增，阳性对照出现 488 bp 目的条带（参见附录 C）的条件下：待检样品出现目的条带判定为核酸阳性结果；待检样品未出现目的条带判定为阴性。4SN/T 5194202010实时荧光 PCR 检测方法10.1模板 DNA 的制备同 9.1。9.2反应体系反 应 体 系 为 25 L：10PCR 缓 冲 液（Mg2+Plus）2.5 L、dNTP（2.5 mmol/L）2.0 L、引 物（25 mol/L）各 1 L、；ExTaq Hs（5 U/L）5 L、模板 DNA 1 L、探针 1 L、ddH2O 补足 25 L。10.3反应条件95 预变性 10 min；94 变性 30 s，55 退火 45 s，72 延伸 40 s，在此收集荧光进行 40 个循环。10.4结果判定10.4.1质控标准阴性对照和空白对照无 Ct 值并且无扩增曲线；阳性对照的 Ct 值应小于等于 32，并出现典型的扩增曲线；如阴性对照、空白对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。10.4.2结果描述及判定10.4.2.1阴性无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无羊传染性脓疱皮炎病毒核酸。10.4.2.2阳性Ct 值小于等于 32，并出现典型的扩增曲线，表明样品中有羊传染性脓疱皮炎病毒核酸。5SN/T 51942020附录A（规范性）细胞及试剂制备A.1牛睾丸原代细胞制备采集 1 日龄犊牛睾丸，用 75%酒精喷撒牛睾丸外层皮毛，作用 1min2 min 后，用无菌镊子取出牛睾丸，置于另一无菌平皿内，用含 100 单位双抗的 PBS 冲洗睾丸 3 次。眼科剪刀剪开包裹睾丸外的结缔组织，剥离并取出实质组织置于另一平皿。用含 100 单位双抗的 PBS 冲洗组织 35 次。若组织充血，应多洗几次，直至将凝血块完全洗净（注意操作过程中及时更换无菌剪刀、镊子）。随后将睾丸实质转至无菌青霉素瓶中。将处理过的牛睾丸实质放在筛网上，用玻璃针芯研磨，边研磨边加入 PBS，用无菌平皿收集研磨液。将细胞悬液（研磨液）按白细胞计数方法进行计数。通过计数，在研磨液中加入适当量的 M199培养液稀释，调整细胞浓度至 3105/mL。37 细胞培养箱培养。A.20.01 mol/L（pH7.2）PBS 配制取 23.876 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）溶解于少量的蒸馏水中，完全溶解后加蒸馏水定容至 1 000mL，配制成 1/15 mol/L 磷酸氢二钠。取9.074磷酸二氢钾（KH2PO4）溶解于少量的蒸馏水中，完全溶解后加蒸馏水定容至1 000 mL，配 制成/15 mol/L 磷酸二氢钾。取8.5氯化钠溶解于少量的蒸馏水中，完全溶解后加蒸馏水定容至1 000 mL，配制成生理盐水。取1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液73 mL、1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液27 mL、生理盐水566 mL混匀后,用 1/15 mol/L 磷酸盐调 pH 值至 7.2。A.310%十二烷基硫酸钠（SDS）在90 mL三蒸水中溶解10 g十二烷基硫酸钠（电泳级），加热至60 助溶，用盐酸调pH 值至7.8，加三蒸水定容至 100 mL。A.4蛋白酶 K 储备液（20 mg/mL）每升三蒸水中加入三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.21 mg、乙二氨四乙酸（EDTA）2.9 mg、硼酸 27.5 g，用 5 mol/L 的盐酸调 pH 值至 8.0。6SN/T 51942020附录B（规范性）临床诊断B.1临床症状B.1.1唇型病羊首先在口角、上唇或鼻镜上出现散小的红斑，逐渐变为丘疹和小结节，继而成为水疱或脓疱，破溃后结成黄色或棕色的疣状硬痂。如为良性经过，则经 12 周痂皮干燥、脱落而康复。严重病例，患部继续发生丘疹、水泡、脓疱、痂垢，并互相融合，波及整个口唇周围及眼睑和耳廓等部位，形成大面积龟裂、易出血的污秽痂垢。痂垢下伴以肉芽组织增生，痂垢不断增厚，整个嘴唇肿大外翻呈桑葚状隆起，影响采食，病羊日趋衰弱。B.1.2蹄型绵羊易感，常在蹄叉、蹄冠或系部皮肤上形成水疱、脓疱，破裂后则成为由脓液覆盖的溃疡。如继发感染则发生化脓、坏死，常波及基部、蹄骨，甚至肌腱或关节。病羊跛行，长期卧地，病期缠绵。B.1.3外阴型母羊表现为黏性或脓性阴道分泌物，在肿胀的阴唇及附近皮肤上发生溃疡；乳房及乳头皮肤上发生脓疱、烂斑或痂垢；公羊则表现为阴囊鞘肿胀，出现脓疱和溃疡。B.2剖检变化病死羊口腔黏膜、舌、齿龈溃烂，可视黏膜苍白；心、肝、肾均有小出血点；肺脏水肿；胃黏膜有出血性炎症。B.3流行病学病毒对外界有相当强的抵抗力，干痂中的病毒，在阳光直射下经 30 d60 d 才失去传染力；散落于地面的病毒可以越冬，至来春仍具有传染性。本病只危害绵羊和山羊，且以 36 月龄的羔羊发病为多，常呈群发性流行。病羊和带毒羊为传染源，主要通过损伤的皮肤、黏膜感染。干旱季节放牧或采食干硬饲料最容易感染，羔羊的口腔黏膜娇嫩，特别在出牙时，易致外伤，用一只奶瓶喂养许多羔羊会引起传染。自然感染是由于引入病羊或带毒羊，或者利用病羊污染的厩舍或牧场而引起的。7SN/T 51942020附录C（资料性）羊传染性脓疱皮炎扩增基因参考序列羊传染性脓疱皮炎扩增基因参考序列001 CGGACAGGTC CTTGACGATG TCGCCCTTCT CGGCGTTCAC GCTCACGAAG GCGTGGTAGC061 GGTAGTGCGT GCCGTCGAGG CTGGCGACCG TGAGGTGCGC GAAGGTGTCG TCCACGATGA121 GCAGCTTAGT GTTGTTCGCG GCGTCGTCCC GGCCGGGTAC CACGAACTTG CGCACGGACA181 TGTCCACGCT GCCGACGCCA AAGTCGTTGA GGCTGCGCGC GGCCGAGACC GACAGCGGGT241 CCGCGTTCTT CCACTCGGTG ATGATCACGC GCACGCGCAC ACCGCGGTTG ATGGCCGCGC301 GCAGCAGCGC GTCAATGATC TGCGGCCAGT ACTCCACGGC GCTGGCGTGC TTGATCACCG361 GCACCATCGA GAGCAGCGAG AGGTCGATGC TGTTCTTGGC GTTCTCGATG CGGTGCAGCA421 CGAGGTCCTC GTCGAGCGTG CGGTAGAAGC CTAGGAAGCG CTCCGGCGAG TCCGAGAAGA481 ATACGCCG