酶的提取与分离纯化.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,酶工程,姜 静,jing_jiang1974,QQ:1336754154,生物制药教研室,(A511),1,2,酶蛋白制备,分离选育,构建表达,发酵生产,分离纯化,产酶菌株,发酵液,酶制品,知识回顾,3,第四章 酶的提取与分离纯化,预处理,（,pretreatment,）,：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。,初步纯化,（,rough fractionation,）,（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。,高度纯化,（,fine fractionation,）,（精制）：除去与产物性质相似的杂质。,浓缩与干燥,（,concentration and desiccation,）（成品加工）,:,使酶与溶剂分离的过程。,纯化工艺评价,基因工程酶,/,蛋白分离纯化的一般流程,6,第一节 酶的分离,一、发酵液预处理,目的：,提高固液分离效率,使产物转移用于后处理相中,去除部分杂质,(,一,),发酵液的相对纯化,1.,无机离子的去除,2.,杂蛋白质的去除,3.,色素及其他物质的去除,（降低离子强度、酶活性影响）,（沉淀、变性、凝聚和絮凝、吸附）,7,(,二）发酵液的固液分离,1.,影响发酵液过滤的因素,1,）菌种,2,）培养基组成,2.,提高过滤性能的方法,1,）絮凝和凝聚,2,）稀释、加热,3,）加助滤剂，,常用硅藻土等。,主要方法是离心分离和过滤,8,二、细胞破碎（,胞内酶,）,（一）,细胞壁组成,细胞壁的主要成分：,细菌：肽聚糖,(N-,乙酰萄糖胺，,N-,乙酰胞壁酸,),酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质,真菌,:,多糖（几丁质和葡聚糖）,9,微生物,革兰氏阳性细菌,革兰氏阴性细菌,放线菌,酵母菌,霉菌,壁厚,/nm,15,50,10,13,同,G,+,100,300,100,250,层次,单层,多层,多层,多层,主要组成,肽聚糖,(40%,90%),多糖,胞壁酸,蛋白质,脂多糖,(1%2%),肽聚糖,(5%,10%),脂蛋白,脂多糖,(11%,22%),磷脂,蛋白质,葡聚糖,(30%,40%),甘露聚糖,(30%),几丁质,(1%,2%),蛋白质,(6%,8%),脂类,(8.5%,13.5%),多聚糖,(80%,90%),脂类,蛋白质,各种微生物细胞壁的结构与组成,10,细菌细胞壁的结构,酵母菌细胞壁的结构,M,甘露聚糖；,P,磷酸二酯键；,G,葡聚糖,12,（二）细胞破碎的方法,机械法,机械捣碎法,研磨破碎法,匀浆破碎法,高压匀浆法,超声破碎法,非机械法,酶法,化学法,物理法,干燥法,13,1.,机械法：,1,）液体剪切：搅拌、匀浆。,2,）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。,3,）超声波破碎法。,2.,非机械法,物理法,1,）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）,平衡后迅速转入低渗溶液或水中。,2,）冻融法：反复低温冰冻，室温融化。,14,3.,酶解法（,e,nzymatic lysis,）,：,外加酶法：,根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶,。,自溶法（,a,utolysis,）,:,细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发,生溶解的现象。,15,4.,化学法,应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。,1,）有机溶剂处理：,破坏膜磷脂结构，常用,丙酮、丁醇、氯仿等。,2,）表面活性剂处理：,常用非离子型表面,活性剂，如,Triton X-100,，,Tween,等。,16,破菌,分离策略,酶法,+,高压匀浆,/,超声,盐及表面活性剂,低浓度的变性剂,Detergent,Intact membrane,Detergent,Detergent-solubilized proteins,a,17,（三）细胞破碎确认,1.,直接测定破碎前后的细胞数,：,破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；,破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。,2.,测定导电率,：,利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。,3.,测定释放的蛋白质量或酶活力,：,测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。,18,三、酶的提取,(extraction),把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。,19,提取目标：,a.,将,目的酶最大限度地溶解出来。,b.,保持生物活性。,注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，,一般,采用低温下（,0,10,）,操作。,20,提取原则,a.,相似相溶。,b.,远离等电点的,pH,值，溶解度增加。,21,提取方法,：,（一）盐溶液提取,常用稀盐（常用,NaCl,）溶液（盐溶），,对酶稳定性好、溶解度大，最常用。,（二）酸、碱溶液提取,（三）有机溶剂提取,22,四、离心分离,三种形式：,1,）离心沉降,2,）离心过滤,3,）离心分离和超离心,23,（,一）,基本原理,1.,离心力,F,c,=m a,c,m,r,2,m,r,（,2,N/60,）,2,N,为离心机,每分钟转数,（,r/min,）；,F,c,通常以相对离心力,RCF,（,relative centrifugal force,）表示，即离心力,F,的大小相当于地球引力（重力常数,g,）的多少倍。,一般用,g,（或数字,g,）表示。,RCF=,m,r,（,2,N/60,）,2,/mg,=1.12,10,-5,N,2,r,此公式描述了相对离心力与转速之间的关系,旋转半径用,r,平均,代替,r,平均,=1/2,（,r,大,+r,小,）,cm,24,2.,沉降系数,:,（,sedimentation constant,）,指单位离心力下颗粒的沉降速度（,sedimentation velocity,）,用,S,表示,。,由于许多生物大分子的,S,值很小，所以定义,10,13,s,为一个沉降单位，,1S=1,10,13,s,。,常用,S,表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如,16sRNA,，蛋白质的沉降系数一般在,1 200,之间。,25,（二）离心机的种类,按离心机转速的不同，分为：,常速（低速）,高速,超速,26,名称,转速,(r/min),注意事项,低速离心机,6000,常温，注意样品热变性和离心管平衡,高速离心机,6000,25000,冷冻（防止温度升高），,离心管的精确平衡,超速离心机,25000,冷冻真空系统（减少空气阻力和摩擦），,离心管的精确平衡,离心机的种类,27,实验室离心机,温度类型：,常温及冷冻,超速离心机均为冷冻型。,使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。,使用超速离心机时先抽真空。,28,离心的形式,角式及外摆式：外摆式一般为低速，,角式由低速到超速均有。,29,角式离心机和离心头（转子）,角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。,30,离心机的大小：落地式及台式,31,小台式离心机,32,离心管,材质：玻璃，塑料,强度：和离心速度相配,大小：和转子配套,高速超速管要加盖,33,离心机操作,平衡、定温、定速、定时。,34,（三）常用离心方法,差速离心法,沉降速度法,密度梯度离心,沉降平衡法 等密度梯度离心,35,1,差速离心,（,differential centrifugation,）,采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法,。,特点：,用于分离大小和密度差异较大的颗粒。,优点：,操作简单,。,缺点：,1,）,分离效果较差，,不能一次得到纯颗粒。,2,）,沉降的颗粒受到挤压,。,36,差速离心分离示意图,（,a,）离心前的悬浮液,（,b,）（,e,）离心不同时间后颗粒的沉降情况,37,38,2,密度梯度离心,（,density gradient centrifugation,）,样品在,密度梯度介质,中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。,常用的密度梯度溶液是,蔗糖,溶液。,39,特点：,区带内的液相介质密度小于样品物质,颗粒的密度。,适宜分离密度相近而大小不同的固相,物质,。,40,密度梯度离心示意图,（,a,）离心前 （,b,）离心后,41,Density gradient ultracentrifugation,42,密度梯度离心,步骤：,A.,形成密度梯度,B.,加样,C.,离心,D.,收集样品,43,3.,等密度梯度离心,又称,沉降平衡离心,（,sedimentation equilibrium centrifugation,）。,根据,颗粒的密度不同,而进行分离。,离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。,44,常用,氯化铯,（,CsCl,）作为梯度介质。,特点：,介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。,适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。,45,等密度梯度离心示意图,（,a,）离心前；（,b,）离心后,46,密度梯度离心,等密度梯度离心,分离依据,分离物沉降系数不同,分离物密度不同,梯度样品操作,通常用蔗糖，制备好梯度介质后加样,通常用,CsCl,，样品与介质均匀混合后离心。,离心条件,在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度,使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度,表观特点,区带位置和宽度随离心时间不同而改变,区带位置和宽度随离心时间不同而改变,沉降速度离心和沉降平衡离心的特点,47,48,（四）离心条件,离心力,:,RCF=1.12,10,-5,N,2,r,离心时间,:,t=K/S*(,最高立离心速度,/,所需离心速度,),2,K=(lnr,2,-lnr,1,)/,2=(lnr,2,-lnr,1,)2.3510,11,/n,2,温度和,pH:,49,五、沉淀分离（根据溶解度的不同）,使溶液中的溶质由液相转变为固相析出,古老、实用、简单的初步分离方法,50,在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：,中性盐沉淀（盐析法）,有机溶剂沉淀,选择性沉淀（热变性和酸碱变性）,等电点沉淀,有机聚合物沉淀,51,（一）盐析沉淀法（改变离子强度）,1.,基本原理（盐溶和盐析）,向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：,1),盐溶,（,salting in,）,：,低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。,2),盐析,（,salting out,）,：,高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。,52,蛋白质的盐析,硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响,离子强度,盐 析,盐溶,53,原因：,高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。,不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，,逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。,54,蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域,55,56,57,1,）中性盐的选择,常用（,NH4,）,2,SO,4,，其突出优点：,a.,溶解度大,b.,分离效果好,c.,不易引起变性,d.,价格便宜,2.,盐析用盐,58,2),盐浓度的表示,用饱和（溶解）度表示,:,溶液中饱和硫酸铵的体积,饱和度,溶液的总体积,59,3),调整盐浓度的方式,a.,饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）,适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。,配制饱和硫酸铵溶液,60,所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算：,S,2,-S,1,V=V,0,1-S,2,式中,V,V,0,分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积,S,2,S,1,分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度,61,b.,添加固体硫酸铵,适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。,按下式计算，得表中数据,B(S,2,-S,1,),W=,1-AS,2,A,B,常数，与温度有关。,实际使用时，可直接查表,（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。,62,调整硫酸铵溶液饱和度计算表,63,盐析操作,低饱和度：,饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过,40,。,高饱和度：,固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。,1,）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。,2,）冰箱中（,4,）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。,3,）沉淀再溶解后可用超滤,（,ultrafiltration,）,、透析,（,dialysis,）,或层析,（,chromatography,）,方法脱盐。,64,3.,盐析曲线的制作,如要分离一种新的蛋白质和酶，应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。,蛋白质量,(mg),或酶活力,10 20 30 40 50 60 70 80 90 100,硫铵,饱和度,65,硫酸铵浓度（,%,）,枯草杆菌,-,淀粉酶发酵液的盐析曲线,66,4.,盐析的影响因素,1),离子强度和种类（介绍盐析常数）,蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：,I,：离子强度，,I=MZ,2,；,M,：离子浓度（,mol/L,）；,Z,：离子价数,S,：离子强度为,I,时的蛋白质的溶解度（,g/L,）,S,0,：离子强度为,0,时蛋白质的溶解度（,g/L,）,Ks,：盐析常数，是与,蛋白质,和,盐种类,有关的特性常数。,Ks,代表盐析效率，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，,K,s,越大盐析效果越好。,67,当温度一定时，,S,0,对于某一溶质是常数，用,表示，盐析方程式可改写为：,log S=-K,s,I,两种盐析法：,K,s,分级盐析法,：,在一定的,pH,和温度条件下，利用不同蛋白质,K,s,的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变,I,值）的沉淀方法。,分级盐析法,：,在一定离子强度下，通过改变溶液的,pH,及温度的沉淀方法,。,68,69,2),蛋白质浓度：,过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，,2.5%-3%,最好。,3)pH,值：,等电点处最易沉淀。,4),温度的影响：,稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。,浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。,一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在,0,4,下操作,。,70,（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）,利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。,1.,沉淀机理,降低溶液的介电常数,部分地引起蛋白质脱水,2.,常用有机溶剂,丙酮,乙醇,甲醇，用量一般为酶液体积的,2,倍左右，终浓度为,70%,。,71,3.,优缺点：,优点,：,1,）,分辨率比盐析法高,2,）沉淀不需脱盐,3,）溶剂易蒸发，沉淀易离心,缺点：,1,）容易引起蛋白质变性失活,2),有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。,72,4.,影响有机溶剂沉淀的因素,（,1,）温度：,低温（,0,）操作。,（,2,）,pH,值：,尽可能靠近其等电点。,（,3,）离子强度：,采用,0.05mol/L,的稀盐溶液,增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度,目的,防止蛋白质变性,（,4,）蛋白质浓度：,适当，一般为,5,20,mg/ml,73,（三）等电点沉淀,(isoelectric precipitation),1.,原理,蛋白质在等电点时溶解度最低,不同的蛋白质具有不同的等电点,2.,使用方法,单独,使用,较少（,用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白）,，多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因,蛋白质,在等电点时仍有一定的溶解度。,74,3.,优点：,1,）,大多数蛋白质的,pI,都在偏酸性范围内,2,）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低,3,）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化,4.,缺点：,酸化时，容易引起蛋白质失活,75,（四）有机聚合物沉淀法,1.,作用机理：,与有机溶剂类似,，是发展较快的一种新方法。,2.,沉淀剂：,常用,聚乙二醇,（,Polyethyene glycol,，简写,PEG,）,多用分子量为,6000,20000,的,PEG,。,3.,优点：,操作条件温和，不易引起生物大分子变性。,沉淀效能高，使用少量的,PEG,即可沉淀相当,多的生物大分子。,沉淀后有机聚合物容易去除。,76,（五）选择性变性沉淀法,选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。,热变性,几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，,加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。,pH,变性,等电点沉淀法是,pH,变性法中的一种变体。,有机溶剂变性,使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。,77,六、萃取（,extraction,）分离,利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。,特点：,1,）比化学沉淀法分离程度高,2,）比离子交换法选择性好、传质快,3,）比蒸馏法能耗低,78,（一）溶剂萃取法,明确几个概念：,料液：,供提取的溶液。,溶质：,料液中欲提取的物质,。,萃取剂,：,用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂,。,萃取液,：,经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与,萃取剂形成的溶液,。,萃余液：,被萃取出溶质后的料液。,反萃取（,back extraction,）：,完成萃取操作后，,将产物从有机相转入水相的萃取操作。,79,溶剂萃取法是以分配定律（即溶质的分配平衡规律）为基础。,在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数。,萃取相浓度,C,1,分配系数,K,0,=,萃余相浓度,C,2,K,0,值随溶液,pH,的变化甚大，这是用萃取法实现溶质提取的重要基础。,80,普通有机溶剂萃取难以进行蛋白质的分离，,因为,:,1,）蛋白质亲水性，不溶于有机溶剂,2,）蛋白质在有机相中易变性失活,故溶剂萃取法一般仅用于抗生素等小分子生物物质的提取。,81,萃取操作的,3,个步骤：,1,）混合,2,）分离,3,）溶剂回收,82,（二）双水相萃取技术,又称水溶液两相分配技术,（,partion of two aqueous phase system,）,用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（,PEG,）和葡聚糖（,Dextran,）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达,70%,90%,），故称,“,双水相,”,系统。,83,优点：,1,）,每一水相中均有很高的含水量，为,酶等生物物质提供了一个良好的环境；,2,）,PEG,、,Dextran,和无机盐对酶等无毒,害作用，不会引起变性。,84,双水相的形成：,两种不同水溶性聚合物浓度达到一定值时，体系会自然地分成互不相容的两相，构成双水相体系。,85,86,几种典型的双水相系统,聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇,葡聚糖（,Dex,）,羟丙基葡聚糖,聚乙二醇（,PEG,）葡聚糖（,Dex,）,硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇,羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素,聚乙二醇（,PEG,）,磷酸钾、,硫酸铵,硫酸钠、硫酸镁,87,2.,萃取原理：,利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。,88,3.,应用,胞内酶的提取和精制,:,除去细胞碎片，并使酶得到纯化。,89,几种典型的双水相萃取酶蛋白实例,酶 菌 种 相系统,延胡索酸酶,Brevibacterium sp,.PEG/,盐,天冬氨酸酶,E.coli,PEG/,盐,-,半乳糖苷酶,E.coli,PEG/,盐,亮氨酸脱氢酶,Bacillus sp,.PEG/Dex,乙醇脱氢酶,Bakers yeast PEG/,盐,青霉素酰化酶,E.coli,PEG/,盐,90,双水相萃取法的重要研究方向,亲和萃取（亲和分配）,使用具有生物特异性的配基（,ligand,）来提高分离选择性。,91,亲和萃取酶实例,蛋白质,配基,胰蛋白酶,胰蛋白酶抑制剂,磷酸果糖激酶,三嗪染料,甲酸脱氢酶,三嗪染料,葡糖,-6-,磷酸脱氢酶,三嗪染料,92,（三）超临界流体萃取,兼有蒸馏和溶液萃取的特征，,与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。,超临界流体,(supercritical fluid,，,SCF,）,：超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点,临界点后的流体,。,93,（四）反胶团萃取,1.,反胶团：,又称反胶束（,Reversed Micelles,）,指,表面活性剂,（,由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续,有机 溶剂,中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体,。,反胶团模型,亲水基团向内聚集,94,（正）胶束,反胶束,形成,表面活性剂溶于水，使其浓度超过临界胶束浓度。,表面活性剂溶于非极性溶剂，使其浓度超过临界胶束浓度。,构造,表面活性剂极性基团在外，非极性基团在内，形成非极性核心。,表面活性剂非极性基团在外，极性基团在内，形成极性核心，溶于水后，形成水池（,water pool,）。,功能,溶解非极性物质,溶解极性物质,95,2.,萃取过程,第一步：,将酶从水相中萃取到反胶束相中。,第二步：,将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相,中，实现对蛋白质的反萃取过程。,96,反胶团萃取原理,97,3.,表面活性剂及有机溶剂,反胶团萃取与溶剂萃取的不同，是在有机溶剂中加入了少量表面活性剂。,98,（,1,）表面活性剂,常用：,AOT,(Aerosol OT),（阴离子表面活性剂，琥珀酸,2-,乙基己基酯磺酸钠）。,特点：,易获得，强度好；极性基团小，形成的反胶团空间较大，有利于蛋白质等生物大分子进入。,（,2,）非极性有机溶剂,环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油。,99,4.,优点,1,）萃取率和反萃取率高。,2,）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。,3,）,解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。,4,）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。,5,）成本低。,100,酶的分离纯化,破菌上清或沉淀,离心,加缓冲液,破碎离心,发 酵 菌 体,发 酵 液,粗 包 涵 体,包涵体溶解液,洗脱收集液,包 涵 体,完全洗脱液,超滤,透析,加缓冲,液离心,加缓冲液,重复洗涤,加缓冲,液离心,加缓冲液,上柱纯化,沉淀,粗纯化,精纯化（制）,盐 析、有机溶剂、PI沉淀,粗体溶解液,洗脱收集液,溶解上清,完全洗脱液,超滤,透析,加缓冲,液离心,加缓冲液,溶解,透析置换缓冲,液,加缓冲液,上柱纯化,上清,分离,101,第二节 酶的精制（精纯化）,纯化原理（掌握）,基本原则（掌握）,纯化技术（掌握原理、选择依据）,102,纯化方法依据原理：,溶解度、特异性吸附、电荷、分子大小,酶纯化的基本原则：,建立一个方便灵敏的分析方法,(,纯度、收率,),；,选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤；,选择适宜温度，保持酶活性以避免酶的变性；,抗氧化失活（,DTT,BME,EDTA,etc,）；,其他添加剂，防止酶失活。,第二节 酶的精制（精纯化）,103,酶精纯化常用技术,膜分离技术,柱层析技术,蛋白质结晶,透析,超滤,凝胶过滤（分子筛,/,排阻）层析,离子交换层析,疏水层析,吸附层析,亲和层析,反相层析,104,一、膜分离,借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状、性质的颗粒或分子进行分离的技术。,105,膜分离技术的分类,扩散膜分离,106,（一）扩散膜分离,透析,（,dialysis,）,溶质分子,Y,从高浓度一侧通过膜向低浓度一侧移动,107,1.,透析膜,1）特点：,多孔薄膜，允许小分子通过，阻止大分子通过；,化学惰性，多种溶液中不溶解；（,材料：纤维素衍生物,）,一定的机械强度；,2）透析膜规格选择（表4.11-4.12）,108,2,）透析膜的预处理：目的：除杂质。,3,）透析袋的保存：防腐剂冷藏。,109,蛋白质透析,110,2.,透析方法及装置,透析袋透析简单装置。,A:,透析夹，,B:,透析，,C:,透析示意图,111,3.,透析速度影响因素,P,164,浓度梯度,分子大小和形状,温 度,膜表面积,膜厚度,112,（二）超滤,依据被分离物质分子大小、形状和性质的不同，在外力作用下形成一定压力差，使溶液中物质在超滤膜表面发生分离，从而达到分离、提纯和浓缩产品的目的。,113,1.,超滤膜特点,非对称双膜结构，包括分离层和支撑层。,超滤膜性能指标包括渗透通量和截留率。,114,2.,超滤装置,实验室装置,115,根据所截留物质颗粒大小的不同，分为,：,截留颗粒,直径,操作压力,应用,微滤,0.22,m,0.1MPa,除菌,超滤,20A 0.2,m,0.1 0.7MPa,分离病毒及生物大分子,116,微滤,(,Microfiltration,，,MF),一种静态过滤，随过滤时间延长，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；,117,常规过滤,(A),和超滤,(B),的示意图,A,B,118,119,2.,超滤装置,工业装置,中空纤维系统,120,超滤膜包装置,2.,超滤装置,工业装置,121,3.,超滤膜的选择及使用,截留分子量,流速,材质,膜完整性,清洗与保存,4.,影响流速的因素,溶质分子性质,溶质浓度,压 力,搅 拌,温 度,其 他,122,色谱起源,色谱,组分,色素,石油醚,碳酸钙颗粒,用色彩（,chroma,）和图谱（,graphs,）组成色谱一词（,Chromatography),。,（二）柱层析技术,123,Column Chromatography,124,层析柱的制备与层析操作,柱层析的设备,:,层析柱、蠕动泵（恒流泵）、检测仪、部分收集器、梯度洗脱器。,125,层析设备,层析装置：,梯度混和器,蠕动泵,层析柱,监测仪,记录仪,收集器,126,记录仪,127,低温层析柜,128,129,现代化层析设备,AKTA,层析柱,XK,BPG,130,现代化层析设备,AKTA,131,记录系统,132,良好的线性放大,133,(一)凝胶过滤层析,凝胶过滤（,gel filtration,）又称分子筛层析（,molecular sieve chromatography,）、排阻层析（,exclusion chromatography,）,是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的,分子量不同,而进行分离的技术。,134,（,1,）,.,基本原理,大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；,小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。,135,136,137,Size-exclusion chromatography,138,凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数,Kd,表示：,Ve-Vo,Kd=,Vi,Vo,外水体积,，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（,ml,）,Vi,内水体积,，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（,ml,）,Ve,某组分的洗脱体积,，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（,ml,）,139,凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰,.K,d,=0,时,即,Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。,.K,d,=1,时,即,Ve=Vo+Vi,，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。,.,其它组分,0K,d,1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。,Kd,小的先流出，,Kd,大的后流出。,140,分配系数,Kd,的意义：,1),可定量地衡量各组分的流出顺序。,2),判断分离效果，,Kd,差异大，分离效果好，,Kd,差异小，分离效果差。,141,（,2,）,.,凝胶的种类和性质,1),交联葡聚糖凝胶（,dextran gel),商品名,:Sephadex,型号,Sephadex G,10,至,G-200,G,后的数字为凝胶吸水值的,10,倍。数字越大，交联度越小，孔径越大，分离范围越广。,142,凝胶型号,颗粒大小,/m,溶胀体积,/(ml/g),分离范围（,Mr,）,Sephadex G-10,Sephadex G-15,Sephadex G-25,Sephadex G-50,Sephadex G-75,Sephadex G-100,Sephadex G-150,Sephadex G-200,4,120,4,120,50,150,50,150,40,120,40,120,40,120,40,120,2,3,2.5,3.5,4,6,9,11,12,15,15,20,20,30,20,30,小于,7,10,2,小于,1.5,10,3,1.0,10,3,5.0,10,3,1.5,10,3,3.0,10,4,3.0,10,3,8.0,10,4,4.0,10,3,1.0,10,5,5.0,10,3,3.0,10,5,5.0,10,3,6.0,10,5,葡聚糖凝胶层析介质的有关参数,143,2,）琼脂糖凝胶（,agarose gel),商品名,:Sepharose,（瑞典）,;,Bio-Gel A (,美国）,依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。,144,3,）聚丙烯酰胺凝胶,（,polyacrylamide gel,）,商品名为,Bio-Gel,型号从,Bio-Gel P,2,至,P-300,，,P,值越大，孔径也越大。,以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂聚合成的高分子聚合物。,145,146,（3）,操作：,1,）凝胶的选择和处理,根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。,将干胶悬浮于,510,倍的,蒸馏水中,，充分溶胀，抽气，装柱。,2,）柱的选择,采用,L/D,比值高的柱子，可提高分辨率，但影响流速,。,147,3,）加样,体积不能过多，不超过床体积的,5,，脱盐时可在,10,左右。,4,）洗脱,洗脱液与平衡时用的,buffer,一致。,洗速不可过快，保持恒速。,5,）胶的保存,洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。,用,0.02%NaN,3,防腐。,148,149,4.,应用,1,）脱盐,),生物大分子物质的,分离纯化,3,）分子量的测定,4,）溶液浓缩,150,（二）离子交换层析,（,ion exchange chromatography,，,IEC,）,151,2.,离子交换剂,：,离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。,纤维素,琼脂糖,葡聚糖,载体 电荷基团,O,CH,2,COO,-,Na,+,反离子,1.,原理,:,根据待分离物质带电性质不同的分离,纯化方法。,152,离子交换剂,-,带有电荷基团的,不溶性,载体,-O-CH,2,CH,2,N-H,CH,2,CH,3,CH,2,CH,3,Cl,-,载体,Diethylaminoethyl,(DEAE),阴离子交换剂,(可吸附,带负电的蛋白质,),阳离子交换剂,(可吸附,带正电的蛋白质,),153,两种离子交换剂,阴离子交换剂：,常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基,2,-,羟丙基,阳离子交换剂：,常用羧甲基,CM CH,2,COO,磺丙基,SP C,3,H,6,SO,3,DEAE,C,2,H,4,N,+,(C,2,H,5,),2,H,QAE,C,2,H,4,N,+,(C,2,H,5,),2,CH,2,CH(OH)CH,3,154,化学原料合成,：树脂类物质,载体,天然材料制成：,cellulose,sephadex sepharose,阳离子交换剂,:,电荷基团（）,反离子（）,电荷基团,阴离子交换剂,:,电荷基团（）,反离子（）,如：,DEAE-,Sepharose，,CM-Sepharose,155,离子交换葡聚糖,以,Sephadex G-25,G-50,为骨架，接入离子交换基团。,DEAE,（,QAE,）,Sephadex A-25,，,A-50 CM,（,SP,）,Sephadex C-25,，,C-50,A,：,anion,阴离子,C:cation,阳离子,156,离子交换剂的选择,a.,强、弱离子交换剂的选择：,强型：适用的,pH,范围广,弱型：适用的,pH,范围窄,b.,阴、阳离子交换剂的选择：,酶的稳定性,若,pI,稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂,157,2,）,蛋白,质,的,电荷性质,4,12,14,2,6,8,10,0,系统,pH,+,蛋白质带正电荷,蛋白,质带负电,荷,等,电点,-,pH,值如何影响蛋白质的电荷数,158,实验设计原,理,利用不同的蛋白,质,分子在溶液中所,带电荷,不同，因而,与离子交换剂,有不同吸附力而,分离。,pH6.0,pI 6.0,蛋白,质带,正,电,pI 6.0,蛋白,质带负电,159,2.,阴离子交换剂分离蛋白质,的,过程,平衡,吸附,去吸附,分离结束,再生,+,低盐,高盐,利用不同,盐浓度将,不同蛋白,质,洗,脱下,來,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,Cl,-,160,Ion-exchange chromatography,161,3.,操作,平衡 上样 平衡 洗脱 再生,1,）上样：,上样体积不十分严格。,2,）洗脱,:,增加溶液的离子强度,梯度洗脱法,改变溶液的,pH,值,3,）再生：,用,0.5mol/LNaOH,和,0.5mol/L NaCl,混合溶液或,0.5mol/L HCl,处理。,4.,应用,制备纯化生物大分子,162,图,4-39,梯度溶液的制备方法和洗脱曲线,（,a,）线性梯度；（,b,）凸形梯度；（,c,）凹形梯度；（,d,）编程梯度,163,影响离子交换层析的主要因素,PH,离子强度,层析介质（流速、分辨率）,164,（三）疏水层析,（,Hydrophobic Interaction,Chromatography,HIC,）,从分离纯化的机制看，属吸附层析类。利用疏水层析介质和蛋白质分子都具有一定的疏水性质，根据被分离成分与固定相之间疏水力大小的不同而进行分离。,165,大多数蛋白质具有较强的亲水性，但分子内部存在一个疏水核心，欲让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些疏水补丁（,hydrophobic patch,），或让蛋白质发生局部变性（可逆），暴露出掩藏于分子内的疏水性残基。,原理,:,166,在高盐浓度下，蛋白质发生局部结构可逆改变，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的蛋白质，按其结合力大小，依次进行解吸附。,167,168,2.,吸附剂,亲水性（如,Sepharose,）,基质,固定相 疏水性（如硅胶、树脂）,配体（疏水性基团）（苯基、辛基、烷基）,169,产品名称,载体,配基,生产公司,Phenyl,Sepharose,4FF,琼脂糖凝胶珠,苯基,GE,Octyl,Sepharose 4,FF,琼脂糖凝胶珠,辛基,GE,Butyl sepharose 4FF,琼脂糖凝胶珠,丁基,GE,一些商品疏水层析介质,170,3.,操作,1,）加样：,样品溶液中补加适量的盐。,2,）洗脱：,用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。,3,）再生：,除去固定相吸附的杂质,，用水或,8mol/L,脲素溶液,。,4.,应用,主要用于分离纯化大分子物质。,171,（四）吸附层析,（,adsorption,chromatography,）,1.,原理,利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。,172,173,吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。,吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选择,。,174,2.,吸附剂,吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。,1,）吸附剂的选择：,根据吸附能力强弱分为：,弱吸附剂：蔗糖、淀粉,中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等,强吸附剂：氧化铝、活性炭,175,2,）吸附剂的性质：,活性炭：,强吸附介质，选择性差，除色素。,硅胶：,常用的极性吸附介质，有机小分子吸附。,羟基磷灰石,（,HA,）,Ca,10,(PO,4,),6,.(OH),2,:,微晶型的磷酸钙制品，,表面有,Ca,2+,和,PO,4,3-,两种带电基团；,酸性和中性蛋白质可与,Ca,2+,结合；碱性蛋白质可与,PO,4,3-,结合。,吸附原理是,HA,的,Ca,2+,与蛋白质的负