GB∕T 40251-2021 牡蛎单孢子虫病诊断规程 原位杂交法.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 中华人民共和国国家标准GB/T 40251-2021 牡航单子包子虫病诊断规程原位杂交法Code of diagnosis for MSX disease of oysters-In situ hybridization method 2021-05-21发布国家市场监督管理总局申+国家标准化管理委员会保W2021-12-01实施GB/T 40251-2021 目IJ1=1 本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。本文件主要起草人:白昌明、杨冰、王崇明、黄佳、李清、万晓援、辛鲁生、李晨、余卫忠。I 1 范围牡蜘单子包子虫病诊断规程原位杂交法GB/T 40251-2021 本文件规定了牡蜘单抱子虫病诊断规程中病原定位方法的要求，针对主要病原尼氏单子包子虫CHa户losoridiumnelso仆，给出了原位杂交检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。本文件适用于尼氏单子包子虫在牡蜘中感染程度的评估和确诊;其他贝类也可参照执行O2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款o其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SC/T 7205.1-2007 牡蜘包纳米虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。AP:碱性磷酸酶Calkalinephosphatase) BCIP: 5-澳-4-氯-3-口号|睐磷酸-甲苯胶盐C5-bromo-4-chloro-3-indolyl phospha te p-tol uidine sal t) DAFA:戴维森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液Cda vidson s acoho-formalin-acetic acid fixa tive) DIG:地高辛Cdigoxigenin) EDTA-Na2.2H20:二水合乙二胶四乙酸二铀CEthylenediaminetetraacetic acid, disodium di hydrate) MgC2 6日20:六水合氧化馍Cmagnesium chloride hexahydrate) NaCl:氧化饷Csodi um chloride) Na2 HP04 12H2 0:十二水合磷酸氢二铀Csodiumphosphate dibasic dodecahydrate) Na3C6 H507 .2H20:二水合拧朦酸三铀Csodiumcitrate dihydrate) NBT:氧化硝基囚氮瞠蓝C4-Nitroblue tetrazolium chloride) KH2P04 :磷酸二氢锦Cpotassiumphosphate monobasic) KCl:氯化伺Cpotassi um chloride) PBS:磷酸盐缓冲液Cphosphate buffer saline buffer) SSC:拘橡酸铀缓冲液Csalinesodium citrate buffer) Tris:三起甲基氨基甲皖CTrishydroxymethylJaminomethane)GB/T 40251-2021 Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基耻(Polyethyleneglycol tert-octylphenyl ether) 5 试剂或材料5.1 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸倡水或去离子水或相当纯度的水。5.2 NaCl。5.3 Na3C6Hs0 7 . 2HzO。5.4 KCl。5.5 Naz HP04 12Hz 0 。5.6 KHzP04 0 5.7 Tris。5.8 Triton X-100。5.9 MgClz 6HzO 。5.10 EDTA-Naz . 2HzO。5.11 NBT。5.12 BCIP。5.13 蛋白酶K。5.14 多聚赖氨酸(相对分子质量25000)。5.15 聚乙烯醇(相对分子质量3000070 000)。5.16 盐酸左旋咪瞠。5.17 f卑斯麦棕Y。5.18 牛血清白蛋白。5.19 聚煎糖400。5.20 聚乙烯毗咯皖酬360。5.21 寡聚核昔酸探针MSX1347，序列:5 -ATG-TGT-TGG-TGA-CGC-TAA-CCG-3，合成时用DIG标记的脱氧核糖核昔尿略睫代替脱氧核糖核昔胸腺略皖残基。5.22 阳性对照:已知受尼氏单子包子虫感染，且原位杂交结果显示阳性的贝类组织样本。5.23 阴性对照:已知未受尼氏单抱子虫感染，且原位杂交结果显示阴性的贝类组织样本。5.24 石蜡(熔点52oC54 OC):切片级。5.25 甲酷肢。5.26 丹哈特液(Denhardts)。5.27 蛙精DNA。5.28 硫酸葡聚糖。5.29 山羊血清。5.30 二甲基甲眈胶。5.31 浓盐酸。5.32 碱性磷酸酶偶联的DIG抗体(AP-抗DIG，0.75U/,u.L,4 oC):生化试剂。5.33 二甲苯。5.34 中性树胶:生物染色用。5.35 元水乙醇。5.36 95%乙醇。5.37 甲醒(37%)。5.38 冰醋酸。5.39 过滤海水:经纱网(二三200目)过滤的海水。5.40 DAFA固定液:按附录A的A.1配制。5.41 80%乙醇:按A.2配制。5.42 70%乙醇:按A.3配制。5.43 50%乙醇:按A.4配制。5.44 500 ,ug/ mL多聚赖氨酸:按A.5配制。5.45 2 X SSC:按A.7配制o5.46 1 X SSC:按A.8配制。5.47 0.5 X SSC:按A.9配制。5.48 PBS:按A.10配制。5.49 100g/mL蛋白酶K:按A.12配制。5.50 0.4 %甲瞪:按A.13配制。5.51 杂交缓冲液:按A.14配制。5.52 缓冲液1:按A.16配制。5.53 缓冲液ll:按A.17配制。5.54 缓冲液皿:按A.19配制O5.55 缓冲液凹:按A.21配制。5.56 显色液:按A.23配制。5.57 0.5 % .卑斯麦棕Y(Bismark brown Y):按A.24配制。6 仪器设备6.1 石蜡切片机:满足4m7m厚度的石蜡连续切片要求。6.2 显微镜:配备高倍镜(40X)和油镜(100X)。6.3 微量移液器:量程0.5L10L、200，uLl 000L。6.4 普通冰箱。6.5 切片保湿孵育箱。6.6 展片水浴锅。6.7 烘片机。7 样晶7.1 采样对象牡蜘、扇贝和蛤等易感双壳贝类。7.2 采样数量、方法和保存运输GB/T 40251-2021 采样数量、方法和保存运输应符合SC/T7205.1-2007附录B的要求。海水温度高于10OC，且盐度高于15%。时为采样的最佳时期。7.3 样品的采集稚贝(附着后2mm)和幼贝(2mm30 mm)取内脏团;成贝(30mm)取胃、肠道、闭壳肌和外套膜。GB/T 40251-2021 8 试验步骤8.1 组织切片制备8.1.1 脱水组织块依次浸入盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中;流程如下:70%乙醇(1h 45 min)80%乙醇(1 h 45 min)80%乙醇(1h 45 min)95%乙醇(45min)95%乙醇(45min)无水乙醇(45min) 无水乙醇(45min)。8.1.2 透明脱水后的组织块依次浸入盛有无水乙醇:二甲苯(1:1)混合液和二甲苯溶液的烧杯中，流程如下:无水乙醇:二甲苯(1: 1) (25 min)二甲苯(20min)二甲苯(20min)。8.1.3 浸蜡恒温箱温度调节至高于石蜡熔点，流程如下:透明后的组织块依次浸入两个盛有融化石蜡的烧杯中各80min。8.1.4 包埋将恒温箱温度调节至高于石蜡熔点进行熔蜡，将熔蜡倒入包埋盒与包埋模具，也可用折叠纸盒;用预温的慑子迅速夹取组织块，切面朝下平放在模具底部;轻轻提起模具，置于冰上使其冷却凝固。8.1.5 切片用蜡铲或刀片将包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，保留组织周围附着宽2mm3 mm的石蜡。用石蜡切片机切片，厚度5m。对每个石蜡包埋块至少切取两张不连续的切片。8.1.6 展片将切片平放于展片水浴锅水面上，待伸展平整后，用涂有多聚赖氨酸的载玻片捞出;置于烘片机上或烘箱内，450C烘片2h。8.2 原位杂交8.2.1 组织切片(包括阴性对照和阳性对照)依次通过二甲苯(2次，5min/次)、元水乙醇(2次，10min/ 次)、95%乙醇(2次，10s/次)、80%乙醇(2次，10s/次)、50%乙醇(1次，10s) ，然后用双蒸水冲洗2次(每次3min)。8.2.2 切片平放在切片保湿孵育箱中，吸取500L100g/mL蛋白酶K悔液，加到每张组织切片上，37 oC孵育15min。8.2.3 把组织切片上的蛋白酶K海液吸净，然后将其浸人预冷到4oC的0.4%甲醒恪液中5min。8.2.4 室温下，用2XSSC浸洗组织切片5min。8.2.5 把组织切片平放在切片保湿孵育箱中，添加500L杂交缓冲液至每张组织切片，42oC孵育60 min。8.2.6 添加500L含2ng/fJ-L DIG标记的寡聚核昔酸探针杂交混合液至每张组织切片，置于90oC 95 oC平板烘片机上保温10mi丑。8.2.7 将组织切片置于平整的冰面上浮冷1mino 4 GB/T 40251-2021 8.2.8 在切片保温孵育箱内42oc下孵育16h18 h。8.2.9 依次用缓冲液2X SSC(5 min，室温)、2X SSC( 5 min，室温)、1X SSC( 5 min，室温)、1X SSC (5 min，室温)、0.5X SSCClO min, 42 OC)、0.5X SSCClO min,42 OC)浸洗组织切片，然后将组织切片放入缓冲液1cl min2 min，室温)。8.2.10 加500L缓冲液E封闭组织切片，37oc温浴30min。8.2.11 用缓冲液E将AP-抗DIG稀释至0.75U/ILLClL 0.75 U/ILL AP-广LDIG加到1mL缓冲液E中)，添加250L至每张组织切片，在湿盒中370C温浴3h。8.2.12 用缓冲液II(2次，5min/次，室温)、缓冲液皿(2次，5min/次，室温)浸洗组织切片。8.2.13 吸500L显色液于每张组织切片上，在暗处于室温放置1h3 h，随时观察显色情况，当阳性对照有明显显色或阴性对照开始普遍出现非特异性显色，立即终止显色。8.2.14 把组织切片置于缓冲液N中15min终止反应。8.2.15 组织切片依次在双蒸水cl次，10s)、0.5%1卑斯麦棕YCl次，1min)、95%乙醇(3次，10s/次)、元水乙醇(3次，10s/次)、二甲苯(4次，10s/次)中浸洗。8.2.16 空气自然干燥后，滴加2滴中性树胶，封片。8.2.17 显微镜下(400倍)，寻找着色明显的蓝黑色杂交信号，并拍照。9 结果判定9.1 检测结果成立条件阳性对照样品组织病灶部位观察到明显的蓝黑色杂交信号，阴性对照样品组织中未观察到任何的蓝黑色杂交信号，实验有效。9.2 检测结果判定检测样品组织中观察到蓝黑色杂交信号(参见附录B)，则原位杂交检测结果为阳性，判定为尼氏单抱子虫感染;待测样品组织中未观察到蓝黑色杂交信号，则原位杂交检测结果为阴性。牡蜘单子包子虫病及其主要病原简介参见附录C。GB/T 40251-2021 A.1 DAFA固定液95%乙醇甲MC37%)冰醋酸过滤海水?昆匀，室温密封贮存。A.2 80%乙醇95%乙醇加水定容至1昆匀，室温贮存。A.3 70%Z醇95%乙醇加水定容至混匀，室温贮存。A.4 50%乙醇95%乙醇力口水定容至?昆匀，室温贮存。A.5 500g/mL多聚赖氨酸多聚赖氨酸(相对分子质量25000) 加水定容至混匀，4oc贮存。A.6 20 x SSC NaCl Na3CGHs0 7 .2H20 加水溶解定容至调节pH至高压蒸气灭菌后，室温贮存。A.7 2xSSC 20XSSC 水6 附录A(规范性)试剂配方330 mL 220 mL 115 mL 335 mL 800 mL 950 mL 700 mL 950 mL 500 mL 950 mL 5 mg 10 mL 175.32 g 88.23 g 1 000 mL 7.0 100 mL 900 mL GB/T 40251-2021 A.8 1 xSSC 20X SSC 50 mL 950 mL A.9 0.5 x SSC 20X SSC 50 mL 1 950 mL A.10 PBS KCl 0.2 g NaCl 8 g Naz HPOI 12Hz 0 2.9 g KHzP04 0.2 g 加水定容至1 000 mL A.11 10 mg/mL蛋白酶K蛋白酶K100 mg 加水定容至10 mL 分装于无菌离心管中(0.25mL/管)，一20oc下保存。A.12 100g/mL蛋白酶K10 mg/mL蛋白酶K0.25 mL PBS 24.75 mL 用前临时配制，混匀，4oc存放。A.13 0.4%甲醒甲&(37%)5.4 mL 水500 mL 倒掉前可重复使用4次，用前预冷。A.14 杂交缓冲液20XSSC 10 mL 100%甲毗胶25 mL 20X丹哈特液(Denhardts) 2.5 mL 10 mg/mL蛙精DNA2.5 mL 25%硫酸葡聚糖10 mL 1昆匀，4oc贮存oA.15 10丹晗特液牛血清白蛋白聚蔚糖400聚乙烯口比咯烧酬360加水溶解并定容至90 mL 24 mg 10 mL 4.5L 3.5L 2.5 g 500 mL 100 mg 0.931 mL 0.402 mL 100 mg 2 mL 0.4 g 0.4 g 0.4 g 100 mL 0.45m的滤器过滤，5mL/支分装，-20oC贮存。A.28 25%硫酸葡聚精硫酸葡聚糖加水定容至低热搅拌片刻使之溶解，-20oC保存。A.29 10 mg/mL蛙精DNA鱼主精DNA水25 g 100 mL 250 mg 25 mL GB/T 40251-2021 将蛙精DNA纳盐加入水中，用玻璃棒搅拌直至完全溶解。用6号针头的注射器反复抽打数次。在100oC水浴中加热10min，立即放于冰浴中悴冷，分装于无菌小试管中，-20 oC保存。使用前在100 oC水浴中加热5min，然后萍冷。GB/T 40251-2021 原位杂交法示例见图B.l。2012Else叽衍Inc.说明:蓝黑颗粒为杂交信号(箭头所示)。附录B(资料性)尼氏单于包子虫原位杂交检测结果示例图B.1长牡蜗(Crassostreagigs)感染尼氏单子包子虫原位杂交检测结果10 附录C(资料性)牡蜻单子包子虫病及其病原简介GB/T 40251-2021 牡蜘单子包子虫病是由尼氏单于包子虫CHaLosoridiumneLsoni)感染牡蜘等双壳贝类血细胞、结缔组织和消化道上皮，引起靶组织坏死和个体死亡的疫病。该病1957年发生于美国的切萨皮克湾和特拉华湾的美洲|牡蜘(Crassostreavirginica)中。由于最初认为该疫病与一种未知的球形多核体寄生虫有关，因此又被称作MSXCMultinucleateSphere X)病。牡蜘单抱子虫病的主要宿主除美协|牡蜘外，还有长牡蜘CCrassostrea gigas)和海湾扇贝CArgo户ectenirradians) ，几乎易感宿主所有组织器官的上皮和结缔组织均可被尼氏单子包子虫感染，于包子形成阶段仅在消化道上皮中被观察到。尼氏单子包子虫在全球的分布比较广泛，如美国的佛罗里达州北部、马萨诸塞州和缅因州、法国、日本和韩国等。1993年，曾在我国山东和辽宁养殖海湾扇贝中发现单子包子虫未定种CHa户Losoridiumsp.)。近年来，利用分子生物学方法，自我国北方海区养殖长牡蜘和海湾扇贝中检测到尼氏单袍子虫DNA。牡虫厉单子包子虫病在北半球主要发生在5月中旬到10月底的夏季高温季节，死亡高峰集中在8月到9月，死亡率可高达90%。高盐环境下患牡!昕单子包子虫病的牡!昕死亡率明显增高。