第四章分子生物学研究法修定版(13年).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,本章内容,掌握：,细菌转化；DNA序列测定；基因敲除；RNA干扰；酵母双杂交；cDNA文库,了解：,其他相关分子技术,5/18/2025,1,1DNA相关技术1.1细菌转化,定义：一个细菌细胞摄入并表达外源DNA的过程,(书上：指一种细菌菌株由于捕获了来自,另一种细菌菌株的？,DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程),（1）CaCl,2,法,转化过程中的受体细菌应是限制修饰系统缺陷型菌株并且0低渗CaCl,2,处理成感受态。,通过短暂的热刺激（42）可以使细菌摄,入外源DNA,（2）电击法（电脉冲导致细胞膜凹陷随着跨膜电压的增加造成疏水性孔洞变为亲水性孔洞）,5/18/2025,2,*外源基因在细菌中的表达,目的基因体外扩增（PCR若是真核需从CDNA文库扩增或cDNA为模板扩增）（,见问题,）,与,载体,连接（酶切）（双酶切，单酶切）,（表达载体/克隆载体、多克隆位点-包含多个(最多20个)限制性酶切位点(restriction site)的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头(polylinker),是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列）,转化,筛选（质粒抗性标记，,蓝白斑,*，（菌落PCR）,诱导表达,5/18/2025,3,1.2基因文库（cDNA文库）的建立,gene bank（library）：一个含有基因组各个DNA片段的克隆的集合。,cDNA：以mRNA为模板在逆转录酶作用下形成的DNA。,cDNA有组织特异性（都是该组织细胞现在表达的基因）,cDNA文库：以mRNA为基础在逆转录酶作用下，逆转录出DNA克隆形成的集合,5/18/2025,6,5/18/2025,7,cDNA文库的建立,1.高质量的mRNA的制备,利用3polyA尾巴，将用生物素标记的寡聚（dT）引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚（dT）引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA,5/18/2025,8,mRNA体外合成DNA(反转录),使用无Rnase 活性的反转录酶,（防止降解mRNA）,在反转录系统中加人寡聚（dT）及随机引物R6，以保证得到全长cDNA,应选用活性较高的反转录酶及甲基化dCTP，保证所获得双链cDNA的方向性,（第一条链甲基化，两端不同的酶切位点以保证第一条链与另一条链区别开。编码表达蛋白的是哪条链?）,5/18/2025,9,5/18/2025,10,5/18/2025,11,克隆,在组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量是极不相同的，根据mRNA分子含量的多寡（丰度）可以将mRNA划分为高丰度、中丰度和低丰度3种不同的类型,5/18/2025,12,克隆数量与涵盖概率有如下关系,N=ln(1-P)/ln(1-1/n),N:克隆数,P：某个基因被文库所包含的概率（要求大于99%）,1/n：每一种低丰度的mRNA占总mRNA的分数。,则根据表中数据，cDNA文库所需要的最少克隆数为,cDNA文库的构建可以保证大规模测序等基因组学研究,5/18/2025,13,1.3SNP技术,SNP 单核苷酸多态性,分子构象由于碱基的不同在电泳或高效液相检测中移动性不同,作用 解释不同个体对药物敏感性差异,犯罪身份，亲子鉴定，器官移植配对筛选,5/18/2025,14,5/18/2025,15,1.4核酸序列分析,人工法：适用于小片段DNA,需要放射性物质，安全性低,酶法（Sanger），又称合成法、末端终止法、双脱氧法,化学法（Maxam和Gilbert）,自动法：适用于较大的片段,序列自动分析仪,*最新方法：,1.来自斯坦福大学应用物理学系的研究人员在2006年8月11日的Science杂志上发表文章，介绍了一种利用单个RNA聚合酶分子运动的DNA测序新方法，受到各方的关注。,2.2011年2月韩国浦项工学大学化学学科金光秀教授 发明的新方法（见下页介绍）,5/18/2025,16,1 研究人员发现在转录中核苷酸将限制转录的速度，聚合酶会在稀有碱基的位置上停滞不前。利用一种能够分辨碱基对的超稳定捕捉装置（ultrastable optical trapping apparatus）监控四种核苷酸的数量受限情况下的转录。从转录暂停记录的排列模型分析中，我们能够确定DNA的序列。该原理的证据证明,核酸酶的前进,可以用来直接提取DNA序列的信息。,2,韩国浦项大学化学学科金光秀教授研发出了一种高速DNA破译方法，可以利用拥有碳原子层的石墨带状体阅读30亿对DNA碱基。当带着人类基因信息的DNA通过纳米大小的小孔的时候，四种DNA碱基都会接触石墨带状体大约1微秒，这样就可以观察DNA碱基接触石墨体后，,石墨体导电性能的变化,。这些信息变化就可以由一台电脑收集，在短短一个小时之内就可以对DNA进行测序。金教授的研究成果不仅仅缩短了测序的时间，而且大大削减了DNA测序成本。,5/18/2025,17,1.4.1 末端终止法,原理：,DNA聚合酶能够利用单链DNA作为模板准确合成互补链,双脱氧的核苷酸可以掺入寡聚核苷酸的末端，但会终止链的继续延伸（,？,）,步骤：,模板分为四份，每份均加入引物，聚合酶和底物核苷酸，,其中一种核苷酸进行放射标记,（如动画中放射性标记A（黄色表示）；,（生化书，偶然性）；,加入放射性标记的引物（M13）,四份分别加入不同的双脱氧核苷酸，给于适当的条件进行体外合成,合成结果进行电泳，通过电泳条带读出核苷酸顺序,动画,5/18/2025,18,1.4.2.化学法（直读法）,原理：利用不同化学试剂对DNA中的碱基发生作用，而后在哌啶的作用下切断核苷酸链，产生大小不同的特异DNA片段,DMS（硫酸二甲脂）,中性作用G（DMS在中性环境中使G上N7位甲基化，后鸟嘌呤与脱氧戊糖间的糖苷键在中性环境下加热断裂，核苷酸链在G处断裂）,酸性（pH=2）下作用G+A,肼,碱性下作用于T+C,加入1mol/L的盐作用于C,5/18/2025,19,步骤：,待测序列末端放射性标记（3端或5端）分四份，分别加入中性DMS，稀酸DMS，碱肼，盐环境肼。及一定量的哌啶,电泳。,放射性自显影。,直接读出。,5/18/2025,20,*,*,*,ACTTCGACAA,1:,ACTTCG,2:,A,ACTTCG,ACTTCGA,ACTTCGACA,ACTTCGACAA,3:,AC,ACT,ACTT,ACTTC,ACTTCGAC,4:,AC,ACTTC,ACTTCGAC,5/18/2025,21,1.4.3 自动测定,基本原理为双脱氧链终止法,采用荧光标记,计算机自动读取结果,5/18/2025,22,现在多使用不同颜色的荧光剂标记双脱氧核苷酸，然后于一个体系内反应并一起电泳，通过颜色不同读取顺序,5/18/2025,23,1.5 DNA与蛋白质相互作用的研究,1.5.1 凝胶滞缓实验（已知DNA片段是否可与特定的蛋白结合）,DNA与某种蛋白结合，由于相对分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，从而使迁移率变小,1.5.2 DNase 足迹实验（确定结合的位点）,用,32,P标记双链DNA末端，用限制性内切酶去掉其中一个末端，得到只有一条链的单个末端标记的双链DNA，,与细胞蛋白提取物混合,5/18/2025,24,加入少量Dnase，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到平均每条DNA只发生一次磷酸二酯键断裂,进行凝胶电泳分离,若蛋白质不与DNA结合，则将产生一系列仅相差一个核苷酸的DNA,若蛋白质与DNA结合，则与蛋白质结合的部分将不产生条带,5/18/2025,25,凝胶滞缓实验,5/18/2025,26,5/18/2025,27,2基因克隆技术,2.1体外基因扩增,PCR（聚合酶链式反应，,Polymerase Chain Reaction,）技术、基因体外扩增、无细胞分子克隆,5/18/2025,28,原理：,双DNA加热变性为单DNA,变性单链作为模板加入DNA聚合酶、底物、引物可以合成新的互补链从而达到扩增的目的,5/18/2025,29,反应体系与过程,双链DNA,底物、聚合酶,一对与待扩增DNA两端互补的引物,过程：,预变性,变性：双DNA解成单DNA，高温（91）,退火：引物同模板结合,延伸：合成链,循环前三步,循环n次，可获得2,n,个DNA分子,*Taq DNA聚合酶是从Thermus aquaticus菌提取的热稳定性酶,Taq具有5-3DNA聚合酶活性和对双链DNA特异的5-3外切核酸酶活性,从细菌体内提出后无3,-5,外切功能,DNA聚合酶中聚合酶1有此校对功能,Taq 耐高温,动画,5/18/2025,30,2.2,反向PCR（reverse PCR）,扩增位于靶DNA区段之外的未知DNA序列,*先用一种在靶DNA区段上无识别位点的,限制性内切酶，切割,靶DNA区段,两侧,的DNA分子,*将切割得到的片段,连接成环形,。,*根据已知的靶DNA序列按向外延伸的要求设计一对,向外引物,，保证被,扩增,的是位于靶DNA区段,两侧的未知DNA序列,*,PCR,即可得到靶DNA区段之外的未知DNA序列,5/18/2025,31,5/18/2025,32,2.3RACE,cDAN,末端快速克隆 目的:获得全长,cDNA,（完整的,cDNA,可通过文库筛选或通过该方法获得，该方法比文库节约时间）,一般扩增特异基因或,DNA,片段需两个特异引物。该方法需,已知某一,cDNA,序列,（,P163：该序列可来自序列表达标签，减法,cDNA,库、差示显示和基因文库筛选）,流程,(P164图),获得,RNA,（组织提取）,去磷酸化（,5“,端磷酸基团）其他的,RNA,都可去，,but,带帽子结构的,mRNA,受保护,去掉帽子结构，加特,异,RNA,寡聚接头,(,其他的,RNA,加不上因为去磷酸基团。,3,的通过,ployA,),以特异性寡聚,dT,（,dT3,端增加一个碱基如：,A,T(dT),G,C,就只能在特定位置启动,DNA,合成）为引物，逆转录合成第一条,cDNA,，包含了,寡聚接头,的互补序列,分别以第一条,cDNA,为模板进行,RACE,（,5RACE-,为获得,5,cDNA,序列,-,以,5,端,寡聚接头的,部分序列和,3,基因特异引物,进行,PCR-,过程见下页图，,5,；,3),；,5/18/2025,33,5/18/2025,34,2.4CDNA差示分析法,筛选特异表达基因,1.因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差式分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群（representation）保证绝大部分遗传信息能被扩增。,2.12/24(实验室多用12/24碱基接头）：每次换接头时12碱基的前4个一样，（与四碱基内切酶的粘性末端互补），后8个与24碱基中的配对，其,中2,4碱基片段作相应的引物,5/18/2025,35,5/18/2025,36,5/18/2025,37,cDNA差示分析法（书)不确切：接头的加法与短接头的去除,5/18/2025,38,3基因表达研究技术3.1酵母双杂交系统原理,(Yeast Two-hybrid System),5/18/2025,39,5/18/2025,40,5/18/2025,41,His,-gal,5/18/2025,42,His,-gal,5/18/2025,43,3.2RNAi技术,2006 Nobel Prize生理学（医学奖),RNA interference与靶基因序列同源的双链RNA所诱导一种序列特异性的转录后基因沉默现象,使细胞出现靶基因缺失的表型.,5/18/2025,44,后基因组研究焦点：基因功能研究,反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides)技术,是指利用人工合成的反义RNA和反义DNA来阻断基因的转录或复制,抑制基因表达,观察功能变化,Knock,Out 法,Antisense,反义寡核苷酸,法,Ribozyme法,指有催化活性的RNA,RNAi法,5/18/2025,45,3.2.1RNAi 发现历程：,1990年,，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但,意想不到,的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！,?,5/18/2025,46,1995年,康奈尔大学 Guo等在对线虫C.elegans的研究中，应用正义链RNA作为对照，研究par-1基因的表达，,意外的发现,，正义链RNA与反义链RNA同样能够抑制目的基因的表达。,5/18/2025,47,5/18/2025,48,3.2.2RNAi机制,Dicer酶,断裂dsRNA产生小干涉RNA,risc):一种RNA-蛋白质复合物,通过与目标mRNA,完全或者部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制功能,Sirna解螺旋 与靶mRNA结合 靶mRNA断裂,Sense-正义链antisense 反义链,5/18/2025,49,short-interfering RNA,加工长链 dsRNA形成 21-23 nt 小片段,Tuschl,2001,5/18/2025,50,Dicer 包含两个 RNAse III结构域,siRNAs,long dsRNA,5/18/2025,51,RISC:RNA-Induced Silencing Complex,Exonuclease,Homology search activity,Endonuclease,Helicase,5,3,Target mRNA,OH3,5P,形成RISC复合物，降解目的mRNA,5/18/2025,52,3.2.3应用（了解）基因治疗方面的应用,抗肿瘤策略 应用RNAi技术抑制肿瘤细胞（如肝癌细胞、胆管癌细胞等）中血管生长因子或其受体的表达，可达到很好的抗肿瘤生长及抗肿瘤转移的目的。,抗器官移植排斥反应 细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T细胞激活的分子，应用与ICAM-1基因序列特异的siRNA阻断 ICAM-1 mRNA和蛋白的表达，可以明显降低大鼠同种移植心的移植物血管病的发生的程度和缺血再灌注损伤。,5/18/2025,53,抗病毒,斯坦福医学院的研究群，把dsRNA放进小老鼠的肝细胞，dsRNA被小老鼠体內的核酸酶分解成许多siRNA。研究发现siRNA具有高度专一性，会与小老鼠体內的丙型肝炎病毒的mRNA相结合，使mRNA分解并失去转译蛋白质的功能。斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎的研究，已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验。且在小老鼠身上，看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果。,5/18/2025,54,3.3基因敲除,通过一定途径使机体特有的基因失活或缺失的技术，通常指应用DNA同源重组原理用设计的同源片段代替靶基因片段，从而达到目的基因失活或缺失的目的,步骤（1）基因载体构建 与细胞内靶基因片段同源的DNA分子重组到带标记的载体上,（2）ES细胞的获得,（3）同源重组如：电穿孔法，显微注射法将重组载体导入胚胎干细胞中，使外源DNA与ES细胞中部分发生同源重组，从而整合到内源基因上得到表达,5/18/2025,55,（4）选择筛选已经重组的细胞,发生同源重组的比率动物是1/100-100000，植物是1/10000-100000，（用标记；PCR等）,（5）表型研究,（6）由于同源重组发生在一条染色体上，要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型需要至少两代遗传,5/18/2025,56,了解：基因敲除作用,确定基因的性质，研究它对机体的影响寻找基因治疗的靶目标,提供廉价异种移植器官如：猪的-1-3半乳糖基转移酶会在猪的表面产生人体超急性免疫排斥反应的糖分子,1999年PPL公司成功在猪体内进行该基因敲除,缺陷 敲除一个基因并不一定获知其功能因为;许多基因的敲除不能造成容易识别的表型,必需的基因敲除后会致死,5/18/2025,57,3.4DNA微列阵技术,某一生物体内全部已知基因分别点到DNA微列阵或基因芯片上，照射紫外光使之永久固定，再用不同发育阶段的cDNA与之杂交就能了解某些基因对特定生长阶段的重要性。,DNA芯片：,无机物：玻璃片、硅胶,有机物：尼龙膜,可用机械手、压电法把DNA固定在载体上，或将含碱基的试剂的液滴滴在芯片上制作基因芯片,动画1,5/18/2025,58,应用：,利用此技术证明人与大猩猩某基因一个外显子相似度为83.5%98.2%,对生物不同发育时期作动态变化分析：De.Risi对酵母的呼吸状态进行了测定,基因诊断：建立正常人的cDNA与芯片杂交图，以及各种病态下的cDNA与芯片杂交图，用待测病人的杂交图与之进行对比确定病症：如食道癌有四个阶段：度异型增生、度异型增生、原位癌以及食道细胞癌，通过基因诊断的方法可以在早期发现并进行治疗。,5/18/2025,59,3.5原位杂交技术,5/18/2025,60,测试题目,1结合在核小体连接DNA上，负责稳定核小体及高级结构的一种组蛋白是（）,2 DNA复制时的RNA引物是由（）酶催化合成的？A DNA聚合酶 B RNA引物酶 C 引发酶 D RNA合成酶,3 核基因mRNA内含子拼接序列为（）,A AGGU B GAUG CGUAG D UGGA,4 超螺旋是有（）的，有（）超螺旋和（）超螺旋两种,5酵母双杂交是用来研究（）A 哺乳动物功能基因的表型 B 酵母细胞的功能基因 C蛋白质的相互作用 D基因的表达调控,6 PCR反应主要有()()()三个步骤,7 简单说明有那些方法可以获得所需要的基因,8 说出5种以上RNA及功能,5/18/2025,61,1.H1 2.C 3.C 4.方向 5.C 6.变性退火延伸,7.(1)PCR 设计特定引物，扩增,(2)探针法 特定探针 从总DNA溶液中获取目的基因,(3)CDNA法，特异的mRNA进行反转录,(4)人工合成 知道蛋白质氨基酸序列，根据,密码子 推断并人工合成,(5)文库,(6)凝胶电泳法，根据目的基因大小，从凝,胶上回收,*外源基因在细菌中的表达,5/18/2025,62,5/18/2025,63,