第五章酶学.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,1926,年,J.,Sumner,第一次,从,刀豆中,制备,脲酶,结晶，提出酶化学本质是,蛋白质,的观点。,1982,1983,年，,Cech,Altman,和,Pace,三个实验室证实,某些,RNA,也具有一定催化活性,（催化寡聚核苷酸的水解及聚合），突破了酶是蛋白质的传统概念。,现已知的酶数目达几千种。酶学是,发酵工程,的理论基础之一。,附着在,E.coli,DNA,上的,DNA Poly,：,酶的生物学意义,：生物体内化学反应变得,容易,和,迅速,进行（大肠杆菌生命周期20分钟）。,除具有催化活性的,RNA,（,核酶,）,之外，,大多数,酶的,化学本质,都是,蛋白质,。,2.酶的,化学本质,酶的相对分子质量很大，不能通过半透膜；由氨基酸组成，是两性电解质；使蛋白质变性失活的因素均可使酶变性失活；能被蛋白酶水解而丧失活性；所有高度纯化，且达到均一程度的酶都是单纯蛋白或蛋白质与小分子物质构成的络合物。,3.酶是一种生物催化剂,酶,enzyme；,核酶,ribozyme。,核酶,（具有催化功能的,RNA,）,1980,以前，已知所有的生物催化剂，其化学本质都是,蛋白质,。,80年代初，美国科罗拉多大学博尔德分校的,Thomas,Cech,和美国耶鲁大学,Sidney,Altman,各自独立发现,RNA,具有生物催化功能，此发现被认为是近十年生化领域最令人鼓舞的发现，此二人分亨1989诺贝尔化学奖。,自我剪接,ribozyme,自我剪切,ribozyme,催化分子间反应,ribozyme,生物,催化剂,ribozyme,种类,二、酶的催化特性,酶具有,一般催化剂,的特征:,促进反应而不参加反应；,反应前后数量和成分不发生改变；,加速反应，而不能改变反应的平衡点。,酶与,一般催化剂,的区别,酶的特性：,高效性,：,比非生物催化剂催化活性高出,10,6,10,13,倍,。,专一性,：酶对底物具有严格的选择性。,敏感性,：对环境条件极为敏感。,温和性,：酶促反应条件温和；,可调节性,：酶活性和酶合成速度的调节。,CuZn-SOD Cu,2+,Zn,2+,Mn-SOD Mn,2+,过氧化物酶,Fe,2+,或,Fe,3+,II,型限制性核酸内切酶,Mg,2+,羧肽酶,Zn,2+,酶,辅因子,2,、根据酶蛋白的大小分三类,单体酶：,只有,一条多肽链,，分子量小,(1.3,3.5,万,),。数量少，多为,水解酶,，如核糖核酸酶、胰蛋白酶、溶菌酶，多为,胞外酶,。,寡聚酶：,1个以上亚基,组成，易分开，亚基相同或不同，分子量较大,(3.5,几百万,),。聚合形式有活性，解聚形式无活性。多是,调节酶,，代谢调控中起重要作用，如己糖激酶、,3-,磷酸甘油醛脱氢酶，多为,胞内酶,。,多酶复合体：,几种酶,靠,共价键,彼此嵌合而成，分子量很大,(,几百万,),。如：,脂肪酸合成酶,、,-,氧化酶,、,-,酮戊二酸脱氢酶系,、,丙酮酸脱氢酶系,。,1.酶的命名,(1),习惯命名法,按,作用底物,命名。如淀粉酶,蛋白酶,核酸酶等。,按,催化反应,命名。如脱氢酶、转移酶等。,作用底物,+,催化反应,命名。如：琥珀酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶等。,底物,+,催化反应,+,酶来源,或,其它特点,命名。如：胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性或碱性磷酸酯酶等。,习惯命名法简单但缺乏系统性,四、酶的命名及分类,(2),国际系统命名法,1961年,国际酶学会议提出每种酶有两个名称：,系统名,和,习惯名,。,系统名：,包括确切的,底物,名称,、,反应,性质,及,反应,名称,。底物有两种时,同时列出,中间加分号“,：,”；底物中有一种是,水,时,可省略,如,淀粉水解酶,可直接称为,淀粉酶,。,习惯名：,用习惯命名法给酶命名。,酶命名的两种方法：,系统名,、,习惯名,。,系统名,：,包括,所有底物,的,名称,和,反应类型,。,乳酸+,NAD,+,丙酮酸+,NADH+H,+,乳酸：,NAD,+,氧化还原酶,习惯名,：,只取,一个,最适,底物,的名称和反应类型。,乳酸：,NAD,+,氧化还原酶,乳酸脱氢酶,1961年国际酶学委员会（,Enzyme Committee,EC,）,根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成,6大类,：,氧,、,转,、,水,、,裂,、,异,、,合,。,1,氧化还原,酶类：主要催化,氢,的转移或,电子,传递的氧化还原反应。,A,H,2,+B（,O,2,）,A+B,H,2,（,H,2,O,2,，,H,2,O,）,脱氢,酶类：催化直接从底物上,脱氢,的反应。,A,H,2,+B,A+B,H,2,（,需,辅酶,或,辅酶,）,2.酶的分类和系统编号,氧化,酶类,a.,催化底物脱氢，氧化生成,H,2,O,2,：,A,H,2,+,O,2,A+,H,2,O,2,（,需,FAD,或,FMN,）,b.,催化底物脱氢，氧化生成,H,2,O,：,2,A,H,2,+,O,2,2,A+2,H,2,O,c.,过氧化物酶,RO,O,+,H,2,O,2,RO+H,2,O+,O,2,d.,加氧酶,（,双加,氧酶和,单加,氧酶）,O,2,+,OH,OH,C=,O,C=,O,OH,OH,（顺，顺-已二烯二酸）,R,H,+,O,2,+,还原型,辅因子,R,O,H,+H,2,O,+,氧化型,辅因子,（,单加,氧酶,羟化酶,）,2,转移,酶类,：催化化合物中某些基团的转移。,A-,X,+B,A+B-,X,转移,碳基,、,酮基,或,醛基,、,酰基,、,糖基,、,烃基,、,含氮基,、,含磷基,和,含硫基,的酶。,根据,X,分成,8个亚类,：,3,水解,酶类：催化加水分解作用。,AB+,H,2,O,A-,OH,+B-,H,4,裂解,酶类（,裂合,酶类）：,催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。,AB,A +B,CC,键:,+,C,O,2,CO,键:,+,H,2,O,CH,3,C,=O,C,OO,H,丙酮酸,CH,3,C,=O,H,乙醛,C,H,2,COOH,H,OC,HCOOH,苹果酸,丙酮酸脱羧酶,延胡索酸酶,HCCOOH,HOOC,C,H,延胡索酸,CN,键:,COOH,C,H,N,H,2,C,H,2,COOH,COOH,C,H,HC,COOH,+,N,H,3,延胡索酸,天冬氨酸,5,异构,酶类,：催化 各种异构体之间的互变。,A,B,常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类,6,合成,酶类（,连接,酶,）：,催化有,ATP,参加的合成反应。,A+B+,ATP,A-B+,ADP,+,Pi,乳酸脱氢酶,EC,1.,1.,1.,27,第1,大类,，,氧化还原酶,第1,亚类,，氧化基团,CHOH,第1,亚亚类,，,H,受体为,NAD,+,该酶在亚亚类,中的,流水编号,系统编号（四码编号）：,国际分类的盲区：,忽略了酶的物种差异和组织差异,。,SOD,：EC1.15.1.1，,只有一个名称和编号,2,O,2,-,+2H,+,H,2,O,2,+O,2,三类不同的,SOD（,超氧化物歧化酶,）：,CuZn-SOD,真核生物,细胞质,中,Mn-SOD,真核生物,线粒体,中,Fe-SOD,同是,CuZn-SOD，,来自牛,红细胞,与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。,在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。,第二节 酶 的 专 一 性,一、酶的专一性,酶对底物的选择性和对反应的确定性，称为,酶的专一性,(specificity),。,酶的专一性由,酶蛋白分子,的结构特性，特别是其,活性部位,的,结构特性,所决定,。,一种酶只能作用于某一种或某一类物质，表现为,底物专一性,；一种酶只能催化一定的化学反应，表现为,反应专一性,，两者互相联系。,酶专一性的生理意义,:,具有高度专一性的酶及由它们组成的酶系是生物体新陈代谢有条不紊顺利进行的重要保证。,酶作用的专一性,酶的,专一性,结构,专一性,立体异构,专一性,族,（,基团,）专一性,绝对,专一性,相对,专一性,键,专一性,2.,相对专一性,(relative specificity),能作用于结构类似的,一系列,底物。,相对专一性分:,族专一性,和,键专一性,两类。,族,(,基团,),专一性,(group specificity),酶对底物中的,化学键,及其,一端基团有要求,，而对键的另一端的基团无要求。,键专一性,(bond specificity),酶只对底物的,化学键,有要求，而对键,两端,基团,无要求,。这类酶的专一性最低。如：,酯酶,。,酯酶,R,COO,-,+,R,OH+H,+,R,CO,R,+H,2,O,O,酶对底物的选择性有宽严之别，有,结构专一性,和,立体异构专一性,。,二、酶的结构专一性,1.,绝对专一性,(absolute specificity),如：,脲酶,只催化尿素分解。,只能作用于,某一,底物，对底物的化学键及其两端乃至整个分子的结构有绝对要求。这称为酶的,绝对专一性,。,三、立体异构专一性,(stereochemical specificity),1.,光学专一性,(optical specificity),对具有,旋光异构体,的底物，酶只作用于其中的一种。如：,L-,氨基酸氧化酶只能作用于,L-,AA,，而不能作用于,D-,AA,。,2.,几何专一性,(geometrical specificity),对具有,几何异构体,的底物，酶只作用于其中的一种。如：延胡索酸酶只能催化延胡索酸（,反,丁烯二酸）生成苹果酸，而不能催化,顺,丁烯二酸生成苹果酸。,3.,选择对称分子中两个等同基团之一,酶能够区分对称分子中的两个,等同基团,，只作用其中之一。如：甘油激酶只能催化甘油生成,甘油,-,1-,磷酸,，而不能生成,甘油,-,3-,磷酸,。,一、酶的,一级结构,和催化功能的关系,1.,酶的必需基团,第三节 酶的结构与功能的关系,必需,基团,酶分子中,一定部位,上，与催化作用有关的,功能基团,（,-OH、-SH,、,-,咪唑基,、,-,NH,2,、,-COOH,），,称,酶的必需基团,。,结合,基团,催化,基团,2,.,酶原激活,酶原,(,zymogen,):,生物体内有些酶(多是水解酶)刚合成时为无活性酶的前体，称酶原。,酶原激活,(,zymogen,activation):,酶原在一定条件下转化成有活性酶的过程。,酶原激活的原理：,去掉酶分子中部分肽段，引起酶分子空间结构的变化，,形成或暴露出酶的活性中心,，无活性的酶原转变为有活性的酶。,酶原激活剂,(activator)：,激活酶原的物质。,激活剂可以是金属离子、氢离子，也可以是酶。,不同酶原的激活剂不同，有的激活剂可激活多种酶原，如胰蛋白酶可激活动物消化系统的多种酶原。,胰蛋白酶原,N-,端被切除一个六肽而激活：,S,S,胰蛋白酶原的激活过程,天,异,缬,丝,胰蛋白酶,静电引力,或氢键,游离的六肽,胰蛋白酶原,X,-,S-S-,丝,183,-,S-S-,X,缬,天,天,天,赖,S,S,组,肠激酶,胰蛋白酶,组,46,甘,缬,缬,天,天,赖,异,天,天,3.共价修饰,一些,化学试剂,与某些氨基酸,侧链,上的,功能基团,发生结合、氧化或还原等反应，生成,共价修饰,物，使,酶分子,的一些基团发生,结构和性质,上的,变化,。,不同氨基酸侧链基团所使用的修饰剂不同，同一侧链基团也可用不同修饰剂修饰。,修饰,-NH,2,：,顺丁烯二酸酐、乙酸酐、二硝基氟苯（,DNFB,）,等；,修饰,-COOH,：,乙醇,-,盐酸试剂；,修饰,-,咪唑基,：,溴丙酮、二乙基焦磷酸盐以及光氧化；,修饰,-,胍基,：丙二醛、,2,，,3-,丁二酮或环己二酮；,修饰,-SH,：,碘乙酸、对氯汞苯甲酸、磷碘苯甲酸等；,修饰,-,OH,：,二异丙基氟磷酸（,DFP,）。,细胞内,一些酶存在,天然共价修饰,作用，以实现酶的,活性态,与,非活性态,的互相,转变,。这种酶多与代谢速度的调节有关，称为,调节酶,。,细胞内酶的共价修饰,：,磷酸化,与,去磷酸化,、,乙酰化,与,去乙酰化,、,甲基化,与,去甲基化,等。,不同调节酶的修饰情况不同，有的酶接上一个基团后有活性，去掉这个基团后失去活性；有的酶则刚好相反。,R,R,C,C,R,R,C,C,P,酶活性增加,/,降低,-,磷酸基团、乙酰基、甲基等，,和调节基团共价、可逆结合,酶分子,酶,ATP,ADP,酶的化学修饰（共价修饰）调节,R,R,C,C,P,酶活性增加/降低,-磷酸基团、乙酰基、甲基等，,和调节基团共价、可逆结合,酶分子,磷酸酶,ATP,ADP,R,R,C,C,酶的化学修饰（共价修饰）调节,1.,酶的活性中心,酶分子上,必需基团,比较集中，并构成一定,空间构象,，能将,底物转化为产物,的,结构区域,，称为,酶的活性中心,（,active site,）,。,活性中心,结合中心,决定,底物类型,（,酶的专一性,）。,催化中心,决定,催化类型,（,反应的性质,）,。,结合中心,（与底物结合的部位）,催化中心,（促进底物发生化学变化部位）,酶的活性中心,包括,：,二、酶的活性与其,高级结构,的关系,酶蛋白一级结构的,主键,是,肽键,，肽键数目不同，其催化功能也不同。,二硫键,（-,S-S,-）,断裂将使酶变性而丧失其催化功能；但二硫键断开，,空间构象不受破坏时,，,酶活性并不完全丧失,，如果二硫键复原，酶又重新恢复原有的生物活性。,酶的,一级结构,是酶的基本化学结构，是,催化功能的基础,。,一级结构的改变,可使酶的,催化功能,发生相应的,改变,。,酶活性中心示意图,活性中心,结合,中心,必需基团,催化,中心,酶,维持酶构象的必需基团,其它部分,单纯酶,和,结合酶,构成活性中心的,基团和构象不同,:,单纯酶的活性中心：,由位于,同一,或,不同肽链,上的少数,AA,残基,或这些残基上的,必需基团,，通过肽链的折叠、盘绕，在空间,构象上相互靠近,形成。,结合酶的活性中心：,可以是,辅酶,分子；,辅酶,分子上的某,一部分,结构；,与,辅酶,分子结构紧密,偶联,的蛋白质的,结构区域,。,酶分子一般有一个活性中心,个别的有几个；,活性中心,一般只有,1,个,催化,中心,含2,3个,AA,残基；,结合,中心,有,1,个,或,数,个,含,AA,残基数目不等。,牛胰核糖核酸酶,(,RNase,),三维结构,：,橘色为底物,RNA,上的,UpC,，,活性中心,有,三个,AA,残基：蓝色为,His,12,，绿色为,His,119,，,粉色为,Lys,41,。,酶活中心,一般位于酶分子,表面的裂缝,中。,构成酶活性中心有,7个,高频率氨基酸,：,Tyr，Ser,，,Cys,，,His，Lys,，,Asp，Glu,。,催化类似化学反应的,同一类酶,的酶活性中心的一级结构的,AA,残基顺序,具有,相似性,，这可以解释酶的,相对专一性,。,酶活性中心一级结构,AA,残基顺序,在,种系进化,上有严格,保守性,。,酶活性,中心以外的部分,对于维持酶蛋白分子的空间构象，保持活性中心结构的,稳定性,是必要的。,2.,酶活性中心的一级结构,结 论,酶蛋白必须具有特定的一级结构，才有形成酶活性中心的可能，才能赋予酶一定的催化专一性。,3.,酶的二、三级结构与酶活性的关系,二、三级结构,是维持酶活性的,必须构象,。有时为形成正确的催化部位，二、三级结构需发生改变，“,诱导契合学说,”以此为基础。,只要酶保持一定,空间构象,，使酶活性中心必需基团的相对位置保持恒定，,一级结构,中个别肽键的,断裂,，乃至某些区域,小片段,的,去除,，都,不影响酶的活性,。,牛胰核糖核酸酶分子的切断与重组。,具,四级结构,的酶，按功能分为两类：一类与,催化作用,有关，一类与,代谢调节,有关。,与催化作用有关的酶,，由几个相同或不同的亚基组成，,每个亚基都有一个活性中心,。,四级结构完整时,，催化功能充分发挥，,四级结构被破坏时,，亚基被分离，如分离方法适当，亚基仍保留各自催化功能。,具代谢调节作用的酶,（,寡聚蛋白,），其活性通过亚基聚合与解聚来调节。有的,聚合态有活性,，如脂肪酸合成需要的乙酰,CoA,羧化酶；有的,解聚态有活性,，如,cAMP,依赖性蛋白激酶。,4.酶的四级结构与酶活性的关系,R,R,C,C,R,R,R,R,C,C,C,C,酶活性增加/降低,-生理小分子物质：代谢产物、底物、其他和调节基团非共价、可逆结合,酶的变构调节,酶分子,R,R,C,C,R,R,C,C,酶活性增加/降低,R,R,C,C,-生理小分子物质：代谢产物、底物、其他和调节基团非共价、可逆结合,酶的变构调节,酶分子,同工酶,（,isozyme,或,isoenzyme,）：,催化,相同化学反应,，但,酶蛋白,本身的分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显,差异,的,一组酶,，即酶分子,结构不同,而,活性中心相似,的,一类酶,。,乳酸脱氢酶,1959年发现的,第一个,同工酶，催化反应为：,5.酶的高级结构与酶活性的关系,乳酸脱氢酶（,LDH,）,有,5种,同工酶:,LDH,1,LDH,2,LDH,3,LDH,4,LDH,5,(,H,4,)(H,3,M)(H,2,M,2,)(HM,3,)(,M,4,),H,M,电泳图谱阳极到阴极的,5,个区带依次为,:,LDH,1,、,LDH,2,、,LDH,3,、,LDH,4,、,LDH,5,。,心肌,肝脏,H,心肌型,；,M,骨骼肌型,人体心肝和骨骼肌,LDH,同工酶谱,组织器官,LDH,1,LDH,2,LDH,3,LDH,4,LDH,5,（,占总,LDH,活性的百分比）,心,3570,2845 216 06 05,肝 08 210 333 627 308,骨骼肌 110 418 838 936,4097,正常血清,27.12.8 34.7 4.3 20.9 2.4 11.7 3.3 5.7 2.9,1,2,3,4,5,酶活性,迁移位置,酶活性,迁移位置,a,b,LDH,同工酶电泳图谱,1,2,3,4,5,（,a）,正常人,（,b）,心肌梗塞病人,LDH,是,糖酵解,（糖的,无氧分解代谢,）的关键酶，可以催化丙酮酸还原成乳酸，也可以催化乳酸脱氢氧化为丙酮酸。,LDH,同工酶,有,组织特异性,，,功能也不完全相同,。,厌氧,环境的器官，如,骨骼肌,中,LD,H,5,含量高，主要催化丙酮酸还原为乳酸，进行,无氧代谢,；,有氧,环境的器官，如,心,脏,、脑及肾脏中,LD,H,1,含量高，因氧气充足，催化乳酸氧化为丙酮酸，进行,有氧代谢,，为机体提供更多的能量。,同工酶,具有,器官,特异性,或,细胞部位,特异性,。,同工酶是研究代谢调节、生物进化、分子遗传、个体发育等的有利工具，在酶学、生物学和医学中均占有重要地位。,第四节 酶催化反应的机制,活化能,：分子由常态转变为活化状态所需的能量。指一定温度下，1,mol,反应物全部进入活化状态所需的自由能。,活化分子,(activated molecule)：,反应体系中超过分子平均能量，能参加化学反应的分子。,能阈,：活化分子含有能参加化学反应的最低能量称为化学反应的能阈或能障(,energy barrier),。,一、酶催化作用的本质,降低活化能,酶的催化作用与分子活化能,化学反应自由能方程式:,G,=,H,-,TS,（,G,是总自由能的变化,，,H,是总热能的变化，,S,是熵的变化）,当,G,0,，,反应,不能,自发进行。,当,G,0,，,反应能,自发进行,。,使反应达到能阈的两条途径:,A.,给反应物注入一定,能量,使其活化；,B.,用适当催化剂,降低能阈,。,酶催化作用的,实质,是,降低反应活化能,，使反应在较低能量水平上进行，从而加速化学反应。,二、酶催化作用的,中间产物学说,E +,S,ES,E +,P,（,酶）（,底物,）（,中间产物,）（酶）（,产物,）,中间产物存在的证明：,1.同位素,32,P,标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；,2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。,例:,H,2,O,2,+A,H,2,A+2,H,2,O,过氧化物酶,+,H,2,O,2,（H,2,O,2-,过氧化物酶）,（褐色）,（红色）,645583548498,nm,561530.5nm,（H,2,O,2-,过氧化物酶）,+,A,H,2,过氧化物酶,+,A+2,H,2,O,（,红色）,（褐色）,过氧化物酶,对于,双底物,反应，酶先与第一底物,S,1,结合成中间产物,ES,1,，,ES,1,再与第二底物,S,2,起作用：,S,1,+E,ES,1,+,S,2,P,1,+,P,2,+E,辅酶,参加的催化反应中，辅酶与,S,1,分子的一部分结合，并将这一部分转移给,S,2,，形成新的产物。,中间产物,学说,酶的反应历程和工作方式,酶促反应中底物先与酶结合成,不稳定,的中间产物，然后再分解释放出产物和酶。,过渡态,：反应物分子处于,被激活,的状态，是反应途径中分子具有,最高能量,的形式，是一个短暂的分子瞬间，此瞬间分子的某些键正在断裂和形成。,.酶与底物的过渡态互补，,亲和力最强,，利于反应向,E+S ES,方向进行。,.酶与底物结合时，,释放出能量,，使,ES,过渡态能级降低，利于底物跨越能垒，使酶促反应增加。3.底物同酶结合成,中间复合物,是一种,非共价结合,，靠氢键、离子键、范德华力等次级键维系。,酶与反应的过渡态互补,三、酶催化专一性的机制,1、锁钥学说,2、,诱导契合学说,锁 钥 学 说,认为整个酶分子的天然构象是具有,刚性结构,的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。,诱 导 契 合 学 说,该学说认为酶是,柔性结构,，其表面并,没有,一种与底物互补的,固定形状,，而只是由于底物的,诱导,才形成了,互补形状,，结合形成,中间产物,，引起底物发生反应。,3.,结构性质互补假说,(structure-property complementary theory),认为底物与酶活性中心的,空间结构,是,互补,的；底物分子结合在酶的,裂隙或凹陷中的活性中心,；,裂隙,内的,非极性,利于底物结合。,结构性质互补假说,胰凝乳蛋白酶（,Chymotrypsin),对蛋白质的催化作用,4,.“,三点附着”假说,(“three-point attachment”theory),由,A.Ogster,提出，解释甘油激酶识别甘油分子,C,1,，催化分子形成甘油,-1-,磷酸。说明有,立体异构专一性,的酶对于有立体异构体的底物的识别由,酶活性中心的构象决定,。,“三点附着”假说,四、酶催化高效性的机制,-影响酶高效性的因素,1.,共价催化,2.,酸碱催化,3.,邻近定向效应,4.,张力学说（诱导契合）,底物和酶形成,共价键,，形成一个统一分子，使酶催化基团利于催化，降低能阈。,酶活性中心或辅酶上的,亲核基团,（如,Ser,的,-,OH,、,Cys,的,-,HS,、,His,的,咪唑基,），作为,电子供体,与底物的,亲电子基团,（如脂肪酸中羧基,C,原子和磷酸基中的,P,原子）形成不稳定的,共价中间产物,，再快速形成产物。,1),共价催化,（,亲核、亲电子催化,）,含亲核基团的,E,催化反应（,R,为酰基）：,形成不稳定的,共价,中间物,可大大加速反应。,2),酸碱催化,催化有机反应中,最普通,、,最有效,的方式,。,影响酸碱催化反应速度的两个因素:,A.,酸碱强度,：,His,咪唑基,的解离常数为6，在,pH6,附近,给出,质子和,结合,质子能力相同，是,最活泼,的催化基团。,B.,给出质子或结合质子的速度：,咪唑基,最快,，半寿期小于,10,-10,秒。,酶促反应,的酸碱催化是,广义的酸碱催化,，即由质子供体和质子受体参与的催化。,His,的,咪唑基,既是一个很强的,亲核基团,，又是一个有效的,广义酸碱功能基,。咪唑基的解离常数为,6.0,，在近,生理,pH,（即,中性,）条件下，它,一半,以,酸,形式存在，,一半,以,碱,形式存在，故,咪唑基,是,最有效,、,最活泼,的一个,催化功能基团,。另一方面咪唑基,供出,或,接受质子,的速度几乎相等，且,十分迅速,。所以，,His,在大多数蛋白质中虽然含量很少，却很重要。,酶蛋白中的,广义酸碱功能基,：,-,COOH,、-,NH,2,、-,SH,、,酚基,、,咪唑基,。,3,),邻 近 定 向 效 应,一方面底物在酶活性中心的有效,浓度,大大,增加,，利于提高反应速度；,另一方面，底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格,定位,，反应具有高效率和专一性特点。,酶,A,B,互相靠近,的底物分子间，底物与酶活性部位的,基团,间有严格的,定向,关系。,4),“,张力”,和,“形变”,+,-,+,-,-,-,+,+,通过电荷等相互作用，底物张力变形激活形成,过渡态,稳定的底物,张力学说,：酶活性中心某些基团或离子使底物敏感键上某些基团的电子云密度增高或降低，产生“,电子张力,”，牵拉底物敏感键使其变形、断裂。,第五节 酶促反应动力学,酶促反应动力学,：是研究酶促反应速度和影响反应速度各种因素的科学。,影响酶促反应速度,v,的因素,：,1.,S,底物浓度,；2.,E,酶浓度,；3.,温度,；,4.,pH,值,；5.,激活剂,；6.,抑制剂,。,一、酶促反应速度的测量,用,一定时间内,底物,S,的减少量,或产物,P,的生成量,来表示酶促反应速度（,v,）。,产,物,0 时 间,初速度,酶促反应速度逐渐降低,酶促反应的时间进展曲线,测定反应的,初速度,(,V,0,),。,V,0,：反应,速度,与,时间,成,正比,。,反应,10min,或,S,消耗,5%,V,0,。,二、,s,对,v,的影响,单底物,酶促反应，包括,3,水解,酶、,5,异构,酶及大部分,4,裂解,酶催化的反应。,S,一级,反应,v=k,S,零级,反应,v=k,E,混合,级反应,V,max,v,在,E、pH、,温度等条件不变的情况下，,单底物,浓度,S,和反应速度,V,的关系：,零级反应,：,s,饱和时,再增加,s，v,不再增加，趋于恒定，,v,与,s,无关,。此时的,v,为酶促反应,最大速度,（,Vmax,）。,一级反应,：底物浓度,s,低时，反应速度,v,随,s,增加而急剧增加，,v,与,s,成,正比,。,混合级反应,：,s,较高时，,v,随,s,增加的程度不显著，,v,与,s,不成正比,。,用,中间产物学说,解释,S,与,v,关系,曲线的,二相现象,：,当,S,很,低时,，有多余的,E,没与,S,结合，随着,S,的,增加,，,ES,的浓度不断,增高,。,当,S,较,高时,，溶液中的,E,全部与,S,结合成,ES,，虽,增加,S,也,不会,有,更多,的,ES,生成。,S +E,ES,E+P,k,1,k,2,k,3,设,k,m,=,k,2,+,k,3,k,1,v,=,V,max,S,k,m,+,S,（,k,m,S,，,v,V,max,，,v,=,k,S,；,k,m,S,，,v,=,V,max,，,v,=,k,E,）,1913年，,Michaelis,和,Menten,提出定量描述,S,与酶反应速度,v,关系的,米氏方程,：,Km,为,米氏常数,，,是,ES,分解,速度常数(,k,2,+,k,3,),与,合成,速度常数(,k,1,),的,比值,，,是酶促反应总的,平衡常数,。,1.米氏方程,2,.,米氏常数的意义,(1),物理意义,当,S,=,Km,时,1,v=,Vmax,2,Km,是酶促反应速度为,最大反应速度一半时,的,底物浓度。,单位,：,mol,/,L,。,(2),关于,Km,的几点说明,Km,是酶的特征常数,之一。不同,E,有不同,Km,，,Km,只与,E,性质,有关,;,与,E,无关,，,Km,一般为,10,-2,10,-6,mol/L,。,Km,的,应用是,有条件的,，,Km,是在一定底物、温度和,pH,条件下的值。,同,一种酶,有,几种底物,就有,几个,Km,值。,Km,反映酶同底物的亲和力,反比,。,Km,大,，酶与底物的,亲和力,小,；,Km,小,，酶与底物的,亲和力,大,。,可以,判断酶的专一性,和,最适底物,（天然底物,），,一种酶如催化几种底物，其中,Km,值最小,的为,最适底物,。,已知,v,，,求,S,或由已知的,S,，,求,v,。,若反应速度达到,Vmax,的,x%,，则,S,为：,X,S=,Km,100-X,(3),米氏常数,Km,的应用,可以,判断,不同来源的酶或相同来源在不同发育阶段、不同生理状态下,催化相同反应,的酶,是否为同一种酶,。,16,、已知过氧化氢酶的,K,m,为,2.510,mol/L,，当底物,H,2,O,2,浓度为,25mmol/L,时，求其反应速度达到最大反应速度的百分数。,Vmax.S 2.510,mol/L,.Vmax,v=,K,m+S 2.510,2.510,mol/L,=2.5/5 Vmax,=50%Vmax,了解酶的,S,在体内具有的浓度水平,s,Km，v,Vmax,，,合理的,s,；,s,Km，v,Vmax,，,大部分酶闲置,；,s,Km，v,Vmax,，,不是生理状态的,s,，不符合实际情况。,判断酶促反应的方向和途径,对于催化正、逆反应的酶，测,Km,可推测该酶催化正逆反应的效率及主要催化方向。,当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于,k,m,最小,的酶。,判断抑制剂的类型,丙酮酸,乳酸,乙酰,CoA,乙醛,乳酸,脱氢,酶（,1.710,-5,）,丙酮酸,脱氢,酶,（1.310,-3,）,丙酮酸,脱羧,酶（1.010,-3,）,3.米氏常数的求法,取米氏方程的倒数形式：,1,Km,1,1,=,+,v,Vmax,S,Vmax,斜率=,Km,/,Vmax,-1,/,Km,1,/,Vmax,(1)测,Km,和,v,的方法很多，最常用的是,Lineweaver,Burk,作图法,双倒数作图法,。,1/,v,1/S,以,1/,对,1/,S,作图，则,Km=-1/x,。,缺点,：实验点过于集中在直线左端，不易准确。,(2),Eadie-Hofstee,作图法（,/,S,法,）,将米氏方程改写：,K,m,+S=,V,max,S,两边除以,S，,整理：,=-,K,m,/S+,V,max,以,对,/,S,作图，,斜率,为,-,K,m,。,1/,v,斜率=,1/,Vmax,-,Km,Km/Vmax,-4,-2,0,2,4,6,8,10,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,S,S/v,(3),Hanes,作图法(,S,/,S,法),以,S/v,对,S,作图可得一直线,，,斜率,为,1,/,V,max,，纵轴截距为,K,m,/,V,max,。,将双倒数方程两边,同乘以,S,，,可得：,S/v=,S/,V,max,+,K,m,/,V,max,(4),Eisenthal,和,Cornish-Bowden,直接线性作图法,V,max,=v,+,vK,m,/,S,1/,v,-4,-2,0,2,4,6,8,10,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,S,v,-4,-2,0,2,4,6,8,10,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,V,max,K,m,-4,-2,0,2,4,6,8,10,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,S,v,S,不需计算，可,直读,：,K,m,、,V,max,。,4.,多底物酶促反应动力学,1,氧化还原,酶类、,2,转移,酶类、,6,合成,酶类催化的反应属于,双底物反应,。,E,双底物反应通式：,A+B,P+Q,两种底物的浓度在反应中均变化，产生两种或多种产物。,如一种,S,1,固定，另一种,S,2,变化，视为单底物反应，遵从米氏反应动力学,。,(1),序列机制,(,sequential reactions),主要特征：底物的结合和产物的释放,有一定顺序,，产物不能在底物完全结合前释放。即底物,A,和,B,均需结合到,E,上，然后反应产生,P,和,Q,。,E+A+B,AEB,PEQ,P+Q+E,这类反应称为,序列反应,，又分为：,有序反应,和,随机反应,。,双底物与酶,按序,结合，产物,按序,释放。,如,Co,和,Co,为辅酶的脱氢酶催化的反应。,有序反应,二底物与酶,随机,结合，产物,随机,释放。,如某些激酶和少数脱氢酶催化的反应。,随机反应,二底物,交替,与酶结合，产物也,交替,释放,，各种底物不能同时与酶形成多元复合物。,(2),乒乓反应（双置换反应）,属乒乓机制的酶大多,具有辅酶,，如谷丙转氨酶等,结合酶,催化的反应。,序列机制,（,有序反应,和,随机反应,）双底物反应速度方程：,(3)双底物反应动力学方程,Vmax,AB,V=,K,A,K,B,+K,B,A+K,A,B+AB,乒乓机制,双底物反应速度方程：,Vmax,AB,V=,K,B,A+K,A,B+AB,K,A,：S,A,与,E,结合的解离常数。,这说明双底物反应中，如一个底物的浓度恒定，另一底物的浓度可变，则视为单底物反应，仍遵从米氏动力学。,如：,Vmax,AB,V=,K,B,A+K,A,B+AB,用,A,去除分子和分母，当,A,时,1/A,0,Vmax,B,得：,V=,K,B,+B,如一个底物浓度,无穷大,，用这个底物浓度,(A,或,B),同时去除分子分母，则得另一个底物的米氏方程。,酶浓度,反应速度,三、,E,对,v,的影响,1.条件,（1）温度：固定,（2）,pH,值：固定,（3）底物,浓度,S,E,酶浓度,v=k E,2.,酶浓度,E,与反应速度,v,成,正比,。,是测定酶活力的根据之一。,1.,两种不同影响,温度升高，,反应,速度加,快,；,温度升高，热,变性,速度加,快,。,T,v,最适温度,四、,温度,对,v,的影响,2.,温度系数,Q,10,温度每升高10所增加的反应速率。,酶促反应,Q,10,：,12倍,；化学反应,Q,10,：23倍。,2、酶的最适温度,恒温动物,体的酶，最适温度,35,40,；,植物,体内的酶，最适温度,40,50,；,细菌,Taq,DNA,聚合酶70。,酶的最适温度,：酶活力（酶促反应速度）最大时的温度，为该酶的最适温度,。,酶的最适温度,是,非特征性常数,，与酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂以及酶促反应时间时间的长短有关。,酶的最适温度与时间的关系：,温度升高促使酶蛋白变性，是随着时间进行累加的。因此，不同反应时间测得的“最适温度”不同，它,随反应时间延长而降低,。,掌握温度对酶作用影响的实践意义：,临床上的低温麻醉是利用,低温,能降低酶活性，以减慢新陈代谢这一特性；,相反，,高温,灭菌则是利用高温使酶蛋白和菌体蛋白变性失活，导致细菌死亡的特性。,1.,pH,影响酶活力的原因,A.,影响,酶蛋白构象,，过酸或过碱会使酶,变性,。,B.,影响,酶分子,中一些,基团解离,状态，尤其是酶,活性中心,残基的解离状态，最终影响,ES,形成。,C.,影响,底物分子,中一些,基团解离,。,五、,pH,对,v,的影响,2,酶的最适,pH,非特征性常数,酶活力,（酶促反应速度）最大时介质的,pH。,最适,pH,不是常数,，它因,底物,性质及浓度、,缓冲液,性质及浓度、,介质,的离子强度、,温度,和酶作用,时间,等因素的不同而不同。,最适,pH,下，酶表现最大活力。高于或低于最适,pH，,酶活力均下降。,3.,体内多数酶最适,pH,7,，少数例外。多数酶最适,pH,为6,8,，动物酶,pH6.58.5，,植物、微生物酶,pH4.56.5,。,多数,pH-,酶活曲线是,钟,罩,形,，也有半钟形甚至直线形,。,酶最适,pH,往往和它的等电点不一致；,经过部分修饰的酶，其最适,pH,通常不变；,酶在试管反应中的最适,pH,与它所在的正常细胞的生理,pH,值并不一定完全相同。,酶的激活剂：,凡能提高酶活性，加速酶促反应进行的物质统称,酶的激活剂,或,活化剂,。,五、,激活剂,对,v,的影响,酶的激活,：使已,有,活性的酶活性,增高,。,酶原的激活,：使,无,活性的酶原变成,有,活性的酶。,酶的激活与酶原的激活不同:,A.,