生物化学：基因表达调控 (2).ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物化学,护理学专业本科教材,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Regulation of Gene Expression,第七章,基因表达调控,生物化学,二、色氨酸操纵子,(,一,),色氨酸操纵子：,细菌经多步酶促反应自身合成色氨酸；但一旦环境能够提供色氨酸，细菌就会充分利用外源的色氨酸，而减少或停止合成色氨酸酶系的表达。,生物化学,二、色氨酸操纵子,(,一,),色氨酸操纵子的结构,生物化学,(,二,),转录衰减,trp,trp,高时,trp,低时,mRNA,O,P,I,调节区,结构基因,前导肽,衰减子,色氨酸操纵子,生物化学,衰减子结构,(,attenuator,),核糖体,新生肽链,mRNA,DNA,1,2,3,4,UUUU 3,1.,当色氨酸浓度高时,trp,密码子,转录衰减机制,:,5,生物化学,1,2,3,4,5,核糖体,2.,当色氨酸浓度低时,生物化学,SOS,反应,SOS,基因,紫外线,激活,Rec A,Lex A,阻遏蛋白,与,DNA,损伤修复有关的酶和蛋白质,基因表达,Lex A,阻遏蛋白,操纵序列,DNA,三 其他转录调控方式,生物化学,第三节,真核基因转录的调节系统,生物化学,真核基因表达调控机制发生在染色质活化、基因转录激活、转录后加工、翻译及翻译后加工等水平。,生物化学,一、真核生物基因组结构的特点,(,一,),真核基因组结构庞大,9,哺乳类动物基因组,DNA,约,3 10,碱基对,生物化学,含,2,万,2.5,万个基因，其中,60%,的基因存在可变剪接，约,80%,的可变剪接能够导致蛋白质序列的变化。,人类基因组中,1%,序列编码蛋白质，,5%,10%,的重复基因，其余,80%,90%,的基因组为非编码序列,内含子、调控序列等。,(,二,),单顺反子,（,monocistron,）,即一个编码基因转录生成一个,mRNA,分子，经翻译生成一条多肽链。,(,三,),重复序列,-,真核基因组普遍存在,单拷贝序列,（,一次或数次,）,高度重复序列,（,10,次,）,6,中度重复序列,（,10,10,次,）,4,3,多拷贝序列,生物化学,多顺反子,：细菌由操纵子机制控制转录生成的,mRNA,可表达功能相关的数种蛋白,在基因调控区存在的重复序列可能参与,DNA,复制、转录的调控。,生物化学,(,四,),基因不连续性,非编码序列,-,不被转录,-,基因表达的调控区,内含子：编码基因内部不为蛋白质编码的间隔序列,外显子：编码基因内部编码序列,前体,mRNA,：内含子,+,外显子一起转录的,mRNA,：剪切去除内含子，使外显子相连,二、真核基因表达调控特点,(,一,),RNA,聚合酶,生物化学,RNA pol,、,、,分别负责转录；,各类基因启动序列有不同特点，各种,RNA,聚合酶有共同亚基也有特有亚基；,真核细胞转录和翻译在不同亚细胞结构中进行，各种真核基因转录的,RNA,产物都需要经过剪接修饰等加工过程。,二、真核基因表达调控特点,(,二,),活性染色体结构变化,1.,组蛋白变化,转录活跃的染色质缺乏组蛋白,H1,，其他核心组蛋白亦可被乙酰化修饰。每一种核心组蛋白（,H2A,、,H2B,、,H3,、,H4,）都有两个结构域：一是中心结构域，参与组蛋白和组蛋白的相互作用并帮助,DNA,缠绕形成核小体；二是富含赖氨酸的氨基端结构域，赖氨酸残基在组蛋白转乙酰基酶的作用下被乙酰化。,生物化学,生物化学,乙酰化能降低组蛋白对,DNA,的亲和力，还可使,DNA,对核酸酶的敏感性增高，有利于转录调控因子的结合。当某一个基因不再转录时，在组蛋白脱乙酰基酶的催化下使核小体的乙酰化降低，基因转录趋于静止。,2.DNA,拓扑结构变化,生物化学,SSB,3,5,3,5,Dna B,DNA,拓扑异构酶,Dna A,Dna C,帮助,Dna B,结合到复制起始点上,解螺旋酶,防止单链重新形成双螺旋,和被核酸酶水解,DNA,开放的松散结构使参与转录起始的,RNA,聚合酶和蛋白质因子能够接近该区域。,17,DNA,酶,I,高敏感区：大多位于被转录基因的,5,旁侧,1000bp,范围内，长约,100-200bp,；有些距离,5,端较远；有些则位于基因的,3,端或位于基因中间。,在转录活跃的区域，缺乏或完全没有核小体结构。,3.DNA,碱基修饰变化,真核,DNA,约有,5%,的胞嘧啶被甲基化，,甲基化范围与基因表达程度呈反比。,转录活跃区,-,很少甲基化；,不表达的基因,-,高度甲基化；,管家基因富含,CpG,岛，胞嘧啶残基均不发生甲基化。,生物化学,(,三,),正性调节占主导,生物化学,真核,RNA,聚合酶对启动子的亲和力很低，仅靠,RNA,聚合酶与启动子序列结合不能启动基因转录，需要依赖,多种激活蛋白的协同作用,。,真核基因转录表达的调控蛋白主要是以激活蛋白作用为主，表达时就需要有激活的蛋白质存在促进转录，因此真核基因表达,以正性调节为主导,。,由于调节蛋白与,DNA,特异序列作用,特异性强,，而多种激活蛋白与,DNA,间同时特异相互作用，使非特异作用更加降低，可使数目巨大的真核基因的调控更特异更精确。,(,四,),转录与翻译分隔进行,(,五,),转录或修饰、加工,生物化学,三、真核基因转录起始调节,(,一,),顺式作用元件：,位于基因前后，参与基因表达调控、可影响转录速率的,DNA,特异序列,1.,启动子,真核基因启动子是,RNA,聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个,转录起始点,以及一个以上的,功能组件,TATA,盒,GC,盒,CAAT,盒,生物化学,生物化学,TATA,盒,，其共有序列是,TATAAAA,。,TATA,盒通常位于转录起始点上游,-25,-30bp,，控制转录起始的准确性及频率。,GC,盒,（,GGGCGG,）和,CAAT,盒,（,GCCAAT,）通常位于转录起始点上游,-30,110bp,区域。,典型的启动子由,TATA,盒及上游的,CAAT,盒和（或）,GC,盒组成，这类启动子通常具有一个一个转录起始点及较高的转录活性；由,TATA,盒及转录起始点即可构成最简单的启动子。,管家基因启动子有长为,1,2kb,富含,GC,的,CpG,岛，称富含,GC,的启动子，这类启动子一般含数个分离的转录起始点。有的启动子既不含,TATA,盒，也没有,GC,富含区，这类启动子可有一个或多个转录起始点，大多转录活性很低或根本没有转录活性，而是在胚胎发育、组织分化或再生过程中受调节。,2.,增强子,（,enhancer,）,指远离转录起始点（,1,30kb,），通过启动子增强转录效率的特异,DNA,序列。,真核生物基因的增强子通常占,100,200bp,长度，每个核心组件常为,8,12bp,，可以单拷贝或多拷贝串联形式存在。,生物化学,生物化学,增强子的作用具有下列特性：,可通过启动子提高同一条,DNA,链上同源或异源基因转录效率，其作用与靶基因的方向及距离无关。,可增强远距离达,1,4kb,的上游或下游基因转录活性，其增强功能与其序列的正反方向无关。,增强子对作用的启动子没有严格选择性，必须与特异的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。,增强子一般具有组织或细胞特异性。,没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用,。,3.,沉默子,（,silencer,）,当沉默子结合特异蛋白因子时，使其附近的启动子失去活性，基因不能表达。沉默子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。,生物化学,(,二,),反式作用因子,由一种基因表达的蛋白质因子，能结合并调节另外基因表达的称反式调节作用。反式作用因子是一类能分别特异识别并结合于,DNA,特定序列，激活或阻遏基因表达的蛋白质因子，通常把以反式作用影响转录的因子统称为转录因子。,生物化学,(,二,),反式作用因子,1.,转录调节因子分类,（,按功能特性,）,*,基本转录因子,是,RNA,聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白质因子，决定三种,RNA,(m,RNA,、,tRNA,及,rRNA,),转录的类别。,生物化学,如,RNA pol,的转录因子包括,TF,D,、,TF,A,、,TF,B,、,TF,E,及,TF,F,等，这些因子对,TATA,盒的识别及转录起始是必需的。,*,特异转录因子,为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。,转录激活因子,-,通过蛋白质,-DNA,、蛋白质,-,蛋白质相互作用起正性转录调节作用的因子,转录抑制因子,-,生物化学,*,特异转录因子,为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。,转录激活因子,-,通过蛋白质,-DNA,、蛋白质,-,蛋白质相互作用起正性转录调节作用的因子,转录抑制因子,-,过蛋白质,-DNA,、蛋白质,-,蛋白质相互作用产生负性调节效应的因子,生物化学,2.,转录调节因子结构,DNA,结合域,转录激活域,TF,蛋白质,-,蛋白质结合域,（二聚化结构域）,谷氨酰胺富含域,酸性激活域,脯氨酸富含域,生物化学,最常见的,DNA,结合域：,1.,锌指,（,zinc finger,）,最常见的,DNA,结合域结构形式，通过顺序中,Cys,和,His,残基与,Zn,螯合而形成环状结构。其,N,端形成一对反向,-,折叠，,C,端形成,-,螺旋，后者促进锌指与,DNA,大沟结合。,常结合,GC,盒,生物化学,1,2,3,表示锌离子,生物化学,2.,-,螺旋,常结合,CAAT,盒,生物化学,(,三,),mRNA,转录激活及其调节,pol,TFH,TAF,TFF,TAF,TAF,TFA,TFB,TBP,真核,RNA,聚合酶,在转录因子帮助下，形成的转录起始复合物,TATA,DNA,TBP,相关因子,生物化学,真核基因转录调节是,复杂的、多样的：,*,不同的,DNA,元件组合可产生多种类型的转录调节方式；,*,多种转录因子又可结合相同或不同的,DNA,元件。,*,转录因子与,DNA,元件结合后，对转录激活过程所产生的效果各异，有正性调节或负性调节之分。,生物化学,生物化学,基因表达的概念：基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。,基因表达的方式：基本表达,-,管家基因；诱导和阻遏表达；协调表达,基因转录起始调节的因素：特异,DNA,序列,-,顺式作用元件；转录调节蛋白,-,反式作用因子；,RNA,聚合酶活性,原核基因转录调节系统：乳糖操纵子；色氨酸操纵子,真核基因转录起始调节：参与转录调控的,DNA,序列,-,顺式作用元件：启动子、增强子、沉默子；转录调节蛋白质因子,-,反式作用因子,第八章 基因重组与分子生物学技术,齐炜炜,生化教研室,一、基因重组技术,1,基因重组技术的概念,2,基因重组技术原理,3,基因重组技术基本过程,二、分子生物学常用技术,1.,核酸分子杂交与探针技术,2.,分子印迹技术,3.,聚合酶链反应技术,4.DNA,序列分析技术,学习要点：,DNA,RNA,protein,复制,转录,翻译,逆转录,RNA,复制,遗传分子生物学中心法则,第一节,基因,重组技术,基因重组,(gene recombination),:,基因在染色体分子内或分子间的重新排布；,DNA,片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。,基因工程,(genetic engineering,）,:,1973,年科恩等科学家在体外首次将大肠杆菌两个不同的抗药性质粒结合，构成杂合质粒，重新导入细菌，能够复制和表达抗药性。,基因工程,(genetic engineering,）,:,采用人工方法将不同来源的,DNA,进行重组，并将重组后的,DNA,引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程；,在分子水平上对基因进行操作的技术,。,实现该过程所采用的方法以及其相关的工作，又称为,重组,DNA,技术,（,recombinant,DNA,technology,）或,分子克隆,(molecular cloning),。,基因重组技术已被广泛应用于基因修饰和改造、克隆动物、培育抗病植物、开发新药及临床诊断等。,相关实验：,19,73,年,Stanley,Cohen,等进行的,杂合质粒,实验,197,4,年,Stanley,Cohen,等用,金黄色葡萄球菌中的抗药性质粒与大肠杆菌的抗药性质粒结合,1997年英国学者克隆出,“,多莉,”,羊,人类可以按照自己的意图对遗传信息的传递过程进行人为控制，将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达，从而创造出人类需要的蛋白质表达产物和遗传修饰生物体,一、基因重组基本过程,*,分,离目的基因；,载体和目的基因的,切,割；,载体和目的基因的连,接,；,重组,DNA,的,转,化、,转,染和扩增；,重组,DNA,的,筛,选和表达。,目的基因：,与重组,DNA,工作最终目的相关的基因，为获取所需,要的基因或蛋白质；,两大类：,基因组,DNA,和反转录合成的双链,cDNA,重组体：,目的基因与载体连接，具有自我复制的能力,重组体的筛选：,即筛选出成功转化带有重组体的阳性细胞克隆。,转化后的细胞进行扩增、繁殖，获得大量带重组体,DNA,的细胞繁殖群体。这样通过无性繁殖获得的大量,DNA,分子都是同一祖先的相同拷贝，称,DNA,克隆。,分为三个步骤：构建重组,DNA,分子、引入受体细胞和筛选克隆。,基因重组示意图,二、基因载体,游离的外源,DNA,不能复制，携带外源基因的复制子成为,基因载体,。基因工程中常用的载体,(vector),主要包括,质粒,(plasmid),、,噬菌体,(phage),和,病毒,(virus),三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。,1,质粒,是存在于细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的,共价、闭环、小分子双链,DNA,，具有,独立复制,的能力，通常带有细菌的,抗药基因,。,最早使用的质粒,DNA,是人工构建的,pBR322,，该质粒分子大小为,4.3kb,，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含,EcoR,，,BamH,，,Hind,等单一的限制酶切点。,质粒,pUC19,的分子结构,基因载体应具备特点*,1.,具有,独立,复制能力,，,在细胞中能大量繁殖,，从而使目的基因大量扩增,2.,作为表达载体应能利用宿主的酶系统，,表达目的基因,（表达能力）,3.,具有适当的限制性内切,酶识别和切割位点（,酶切位点）,4.,细胞内稳定性高（,持续表达和复制）,5.,具有供筛选用的（,遗传标记）,6.,相对分子量小（,一定的容量）,2,噬菌体,DNA,可通过转染方式将其,DNA,送入细菌体内进行增殖。常用的克隆载体的噬菌体,DNA,有,噬菌体和,M13,噬菌体,。重组噬菌体,DNA,在体外被蛋白包裹成噬菌体颗粒才能转染宿主菌导入外源,DNA,。,2,噬菌体,DNA,噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单个或两个的限制酶切点。,作为插入型载体允许在切口处插入长,5,7kb,外源,DNA,片段，适用于,cDNA,的克隆；或作为置换型的载体，其两切点间的片段，可以用,5,20kb,的外源,DNA,替换，适用于基因组,DNA,克隆。,2,噬菌体,DNA-M13:,环状单链,DNA,，其在宿主内复制时形成双链,DNA,，称为复制型,-,半乳糖苷酶,的启动子及,链,的,DNA,序列,，作为筛选标志,突变型,lac E.coli,可表达该酶的片段（酶的,C,端区）。当宿主和转入载体同时表达、两个片段时,，通过片段互补机制形成具有活性的,-,半乳糖苷酶，可使人工底物,X-gal,转变为蓝色。,LacZ,基因编码的,肽链与失去了正常氨基端的,半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为,互补；,如果插入的外源基因是在载体,lacZ,链基因内，则会干扰,lacZ,的表达，利用,lac E.coli,为转染或感染细胞，在含,X-gal,的培养基上生长时会出现白色菌落。这一现象可用于重组体筛选，又称蓝白斑实验,。,3,柯斯质粒载体,又称粘粒，是经改造过的质粒，是具有质粒和噬菌体载体双重特点的大容量载体，既含有质粒的复制位点、抗药标记及限制性内切酶位点，又含有为包装,DNA,进入噬菌体颗粒的,DNA,序列，即,cos,位点,。,用柯斯质粒克隆时，,35,45kb,的外源,DNA,连接到线性载体,DNA,，形成柯斯位点作为外源,DNA,两侧翼的结构，且两个的方向相同，即两个黏性位点之间是完整的质粒基因和外源,DNA,。,进行体外包装时，黏性位点被噬菌体的,A,蛋白切断，两个柯斯位点之间的,DNA,包装为成熟的噬菌体颗粒。,转染大肠埃希菌时，线状的重组,DNA,被注入细胞内。在细胞内通过黏性末端而环化，环化后的分子含有完整的柯斯质粒载体，像质粒一样繁殖并使宿主菌表现抗药性，可用含抗生素的培养基进行培养,。,4,动物病毒载体,具有在动物细胞中被识别的复制表达体系，可用于真核细胞的基因转移，尤其是以基因治疗为目的的系统，主要是因为病毒基因组的结构相对简单，分子背景清楚，易于改造和操作，且转染率高。,现在较为常用的病毒载体有反转录病毒、腺病毒和痘苗病毒等。,4,动物病毒载体,SV40-,猴空泡病毒,40,，通过感染方式将其,DNA,送入哺乳动物细胞中进行增殖。,SV40,病毒的基因组是一种环形双链的,DNA,，基因组,5.2kb,，病毒的直径,45nm,，病毒成熟部位细胞核，无被膜，,72,个核壳粒亚单位，这种大小很适于基因操作。同时它也是第一个完成基因组,DNA,全序列分析的动物病毒。,理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：,能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要 有较高的自主复制能力。,容易进入宿主细胞，而且进入效率越高 越好。,容易插入外来核酸片段，插入后不影响 其进入宿主细胞和在细胞中的复制。,容易从宿主细胞中分离纯化出来。,有容易被识别筛选的标志。,(,一,)DNA,重组技术中最常用的工具酶,酶类,主要用途,限制性核酸内切酶,识别,DNA,特定序列，切断,DNA,链,DNA,聚合酶,I,（,1,）缺口平移制作标记,DNA,探针；（,2,）合成,cDNA,的第二条链；（,3,）填补双链,DNA3,末端；（,4,）,DNA,序列分析,反转录酶,（,1,）合成,cDNA,；（,2,）替代,DNA,聚合酶,进行填补，标记或,DNA,序列分析,末端核苷酸转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,三、工具酶,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,基因工程诞生的技术突破,限制性内切酶（,restriction enzymes,）,1970,年,H.O.Smith,等分离出第一种限制性核酸内切酶。,Werner Arber,理论预见限制酶,Daniel Nathans,用限制酶切得,SV40 DNA,片断,Hamilton O.Smith,得到第一个限制酶,1978,年,Nobel,生理或医学奖,（二）限制性核酸内切酶*,可以识别,DNA,的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链,DNA,，被称为,基因工程的手术刀,，广泛使用。已发现多种细菌都含有这类限制,修饰酶体系。,作用,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源,DNA，,保护自身,DNA。,分类,、,（基因工程技术中常用型）,（二）限制性核酸内切酶种类,类酶识别序列特点,回文结构,(,palindrome),切口：,平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,回文结构：,II,类限制内切酶要求严格的识别序列和切割位点，大部分,II,类酶识别,DNA,中,4-8bp,具有反转对称的序列。,（二）限制性核酸内切酶作用特点,产生,5,突出粘性末端,(cohesive end):,以,EcoR I,为例：,5GAATT C3,5G-pTTAAC3,3C TTAAG5,3 CTTAA p-OH G5,产生3突出的粘性末端：,以,Pst,为例：,5CTGCAG3,5CTGCAOH-pG3,3GACGTC5,3Gp-OHACGTC5,产生平末端,(blunt end):,Nru,为例：,5GTTAAC3,5GTTOH-pAAC3,3CAATTG5,3CAAp-OHTTG5,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease),在重组,DNA,技术中有重要地位,限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近,1800,多种，可根据它们对,DNA,有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因工程提供有力工具。,配伍末端：,识别序列不同，但切割,DNA,后产生相同类型的粘性末端。,