生物化学：基因表达调控 (2).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物化学,护理学专业本科教材,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Regulation of Gene Expression,第七章,基因表达调控,生物化学,二、色氨酸操纵子,(,一,),色氨酸操纵子：,细菌经多步酶促反应自身合成色氨酸；但一旦环境能够提供色氨酸，细菌就会充分利用外源的色氨酸，而减少或停止合成色氨酸酶系的表达。,生物化学,二、色氨酸操纵子,(,一,),色氨酸操纵子的结构,生物化学,(,二,),转录衰减,trp,trp,高时,trp,低时,mRNA,O,P,I,调节区,结构基因,前导肽,衰减子,色氨酸操纵子,生物化学,衰减子结构,(,attenuator,),核糖体,新生肽链,mRNA,DNA,1,2,3,4,UUUU 3,1.,当色氨酸浓度高时,trp,密码子,转录衰减机制,:,5,生物化学,1,2,3,4,5,核糖体,2.,当色氨酸浓度低时,生物化学,SOS,反应,SOS,基因,紫外线,激活,Rec A,Lex A,阻遏蛋白,与,DNA,损伤修复有关的酶和蛋白质,基因表达,Lex A,阻遏蛋白,操纵序列,DNA,三 其他转录调控方式,生物化学,第三节,真核基因转录的调节系统,生物化学,真核基因表达调控机制发生在染色质活化、基因转录激活、转录后加工、翻译及翻译后加工等水平。,生物化学,一、真核生物基因组结构的特点,(,一,),真核基因组结构庞大,9,哺乳类动物基因组,DNA,约,3 10,碱基对,生物化学,含,2,万,2.5,万个基因，其中,60%,的基因存在可变剪接，约,80%,的可变剪接能够导致蛋白质序列的变化。,人类基因组中,1%,序列编码蛋白质，,5%,10%,的重复基因，其余,80%,90%,的基因组为非编码序列,内含子、调控序列等。,(,二,),单顺反子,（,monocistron,）,即一个编码基因转录生成一个,mRNA,分子，经翻译生成一条多肽链。,(,三,),重复序列,-,真核基因组普遍存在,单拷贝序列,（,一次或数次,）,高度重复序列,（,10,次,）,6,中度重复序列,（,10,10,次,）,4,3,多拷贝序列,生物化学,多顺反子,：细菌由操纵子机制控制转录生成的,mRNA,可表达功能相关的数种蛋白,在基因调控区存在的重复序列可能参与,DNA,复制、转录的调控。,生物化学,(,四,),基因不连续性,非编码序列,-,不被转录,-,基因表达的调控区,内含子：编码基因内部不为蛋白质编码的间隔序列,外显子：编码基因内部编码序列,前体,mRNA,：内含子,+,外显子一起转录的,mRNA,：剪切去除内含子，使外显子相连,二、真核基因表达调控特点,(,一,),RNA,聚合酶,生物化学,RNA pol,、,、,分别负责转录；,各类基因启动序列有不同特点，各种,RNA,聚合酶有共同亚基也有特有亚基；,真核细胞转录和翻译在不同亚细胞结构中进行，各种真核基因转录的,RNA,产物都需要经过剪接修饰等加工过程。,二、真核基因表达调控特点,(,二,),活性染色体结构变化,1.,组蛋白变化,转录活跃的染色质缺乏组蛋白,H1,，其他核心组蛋白亦可被乙酰化修饰。每一种核心组蛋白（,H2A,、,H2B,、,H3,、,H4,）都有两个结构域：一是中心结构域，参与组蛋白和组蛋白的相互作用并帮助,DNA,缠绕形成核小体；二是富含赖氨酸的氨基端结构域，赖氨酸残基在组蛋白转乙酰基酶的作用下被乙酰化。,生物化学,生物化学,乙酰化能降低组蛋白对,DNA,的亲和力，还可使,DNA,对核酸酶的敏感性增高，有利于转录调控因子的结合。当某一个基因不再转录时，在组蛋白脱乙酰基酶的催化下使核小体的乙酰化降低，基因转录趋于静止。,2.DNA,拓扑结构变化,生物化学,SSB,3,5,3,5,Dna B,DNA,拓扑异构酶,Dna A,Dna C,帮助,Dna B,结合到复制起始点上,解螺旋酶,防止单链重新形成双螺旋,和被核酸酶水解,DNA,开放的松散结构使参与转录起始的,RNA,聚合酶和蛋白质因子能够接近该区域。,17,DNA,酶,I,高敏感区：大多位于被转录基因的,5,旁侧,1000bp,范围内，长约,100-200bp有些距离,5,端较远；有些则位于基因的,3,端或位于基因中间。,在转录活跃的区域，缺乏或完全没有核小体结构。,3.DNA,碱基修饰变化,真核,DNA,约有,5%,的胞嘧啶被甲基化，,甲基化范围与基因表达程度呈反比。,转录活跃区,-,很少甲基化；,不表达的基因,-,高度甲基化；,管家基因富含,CpG,岛，胞嘧啶残基均不发生甲基化。,生物化学,(,三,),正性调节占主导,生物化学,真核,RNA,聚合酶对启动子的亲和力很低，仅靠,RNA,聚合酶与启动子序列结合不能启动基因转录，需要依赖,多种激活蛋白的协同作用,。,真核基因转录表达的调控蛋白主要是以激活蛋白作用为主，表达时就需要有激活的蛋白质存在促进转录，因此真核基因表达,以正性调节为主导,。,由于调节蛋白与,DNA,特异序列作用,特异性强,，而多种激活蛋白与,DNA,间同时特异相互作用，使非特异作用更加降低，可使数目巨大的真核基因的调控更特异更精确。,(,四,),转录与翻译分隔进行,(,五,),转录或修饰、加工,生物化学,三、真核基因转录起始调节,(,一,),顺式作用元件：,位于基因前后，参与基因表达调控、可影响转录速率的,DNA,特异序列,1.,启动子,真核基因启动子是,RNA,聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，至少包括一个,转录起始点,以及一个以上的,功能组件,TATA,盒,GC,盒,CAAT,盒,生物化学,生物化学,TATA,盒,，其共有序列是,TATAAAA,。,TATA,盒通常位于转录起始点上游,-25,-30bp,，控制转录起始的准确性及频率。,GC,盒,（,GGGCGG,）和,CAAT,盒,（,GCCAAT,）通常位于转录起始点上游,-30,110bp,区域。,典型的启动子由,TATA,盒及上游的,CAAT,盒和（或）,GC,盒组成，这类启动子通常具有一个一个转录起始点及较高的转录活性；由,TATA,盒及转录起始点即可构成最简单的启动子。,管家基因启动子有长为,1,2kb,富含,GC,的,CpG,岛，称富含,GC,的启动子，这类启动子一般含数个分离的转录起始点。有的启动子既不含,TATA,盒，也没有,GC,富含区，这类启动子可有一个或多个转录起始点，大多转录活性很低或根本没有转录活性，而是在胚胎发育、组织分化或再生过程中受调节。,2.,增强子,（,enhancer,）,指远离转录起始点（,1,30kb,），通过启动子增强转录效率的特异,DNA,序列。,真核生物基因的增强子通常占,100,200bp,长度，每个核心组件常为,8,12bp,，可以单拷贝或多拷贝串联形式存在。,生物化学,生物化学,增强子的作用具有下列特性：,可通过启动子提高同一条,DNA,链上同源或异源基因转录效率，其作用与靶基因的方向及距离无关。,可增强远距离达,1,4kb,的上游或下游基因转录活性，其增强功能与其序列的正反方向无关。,增强子对作用的启动子没有严格选择性，必须与特异的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用。,增强子一般具有组织或细胞特异性。,没有增强子存在，启动子通常不能表现活性；没有启动子时，增强子也无法发挥作用,。,3.,沉默子,（,silencer,）,当沉默子结合特异蛋白因子时，使其附近的启动子失去活性，基因不能表达。沉默子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。,生物化学,(,二,),反式作用因子,由一种基因表达的蛋白质因子，能结合并调节另外基因表达的称反式调节作用。反式作用因子是一类能分别特异识别并结合于,DNA,特定序列，激活或阻遏基因表达的蛋白质因子通常把以反式作用影响转录的因子统称为转录因子。,生物化学,(,二,),反式作用因子,1.,转录调节因子分类,（,按功能特性,）,*,基本转录因子,是,RNA,聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白质因子，决定三种,RNA,(m,RNA,、,tRNA,及,rRNA,),转录的类别。,生物化学,如,RNA pol,的转录因子包括,TF,D,、,TF,A,、,TF,B,、,TF,E,及,TF,F,等，这些因子对,TATA,盒的识别及转录起始是必需的。,*,特异转录因子,为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。,转录激活因子,-,通过蛋白质,-DNA,、蛋白质,-,蛋白质相互作用起正性转录调节作用的因子,转录抑制因子,-,生物化学,*,特异转录因子,为个别基因转录所必需，决定该基因的时间、空间特异性表达。,转录激活因子,-,通过蛋白质,-DNA,、蛋白质,-,蛋白质相互作用起正性转录调节作用的因子,转录抑制因子,-,过蛋白质,-DNA,、蛋白质,-,蛋白质相互作用产生负性调节效应的因子,生物化学,2.,转录调节因子结构,DNA,结合域,转录激活域,TF,蛋白质,-,蛋白质结合域,（二聚化结构域）,谷氨酰胺富含域,酸性激活域,脯氨酸富含域,生物化学,最常见的,DNA,结合域：,1.,锌指,（,zinc finger,）,最常见的,DNA,结合域结构形式，通过顺序中,Cys,和,His,残基与,Zn,螯合而形成环状结构。其,N,端形成一对反向,-,折叠，,C,端形成,-,螺旋，后者促进锌指与,DNA,大沟结合。,常结合,GC,盒,生物化学,1,2,3,表示锌离子,生物化学,2.,-,螺旋,常结合,CAAT,盒,生物化学,(,三,),mRNA,转录激活及其调节,pol,TFH,TAF,TFF,TAF,TAF,TFA,TFB,TBP,真核,RNA,聚合酶,在转录因子帮助下，形成的转录起始复合物,TATA,DNA,TBP,相关因子,生物化学,真核基因转录调节是,复杂的、多样的：,*,不同的,DNA,元件组合可产生多种类型的转录调节方式；,*,多种转录因子又可结合相同或不同的,DNA,元件。,*,转录因子与,DNA,元件结合后，对转录激活过程所产生的效果各异，有正性调节或负性调节之分。,生物化学,生物化学,基因表达的概念：基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。,基因表达的方式：基本表达,-,管家基因；诱导和阻遏表达；协调表达,基因转录起始调节的因素：特异,DNA,序列,-,顺式作用元件；转录调节蛋白,-,反式作用因子；,RNA,聚合酶活性,原核基因转录调节系统：乳糖操纵子；色氨酸操纵子,真核基因转录起始调节：参与转录调控的,DNA,序列,-,顺式作用元件：启动子、增强子、沉默子；转录调节蛋白质因子,-,反式作用因子,第八章 基因重组与分子生物学技术,齐炜炜,生化教研室,一、基因重组技术,1,基因重组技术的概念,2,基因重组技术原理,3,基因重组技术基本过程,二、分子生物学常用技术,1.,核酸分子杂交与探针技术,2.,分子印迹技术,3.,聚合酶链反应技术,4.DNA,序列分析技术,学习要点：,DNA,RNA,protein,复制,转录,翻译,逆转录,RNA,复制,遗传分子生物学中心法则,第一节,基因,重组技术,基因重组,(gene recombination),:,基因在染色体分子内或分子间的重新排布；,DNA,片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。,基因工程,(genetic engineering,）,:,1973,年科恩等科学家在体外首次将大肠杆菌两个不同的抗药性质粒结合，构成杂合质粒，重新导入细菌，能够复制和表达抗药性。,基因工程,(genetic engineering,）,:,采用人工方法将不同来源的,DNA,进行重组，并将重组后的,DNA,引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程；,在分子水平上对基因进行操作的技术,。,实现该过程所采用的方法以及其相关的工作，又称为,重组,DNA,技术,（,recombinant,DNA,technology,）或,分子克隆,(molecular cloning),。,基因重组技术已被广泛应用于基因修饰和改造、克隆动物、培育抗病植物、开发新药及临床诊断等。,相关实验：,19,73,年,Stanley,Cohen,等进行的,杂合质粒,实验,197,4,年,Stanley,Cohen,等用,金黄色葡萄球菌中的抗药性质粒与大肠杆菌的抗药性质粒结合,1997年英国学者克隆出,“,多莉,”,羊,人类可以按照自己的意图对遗传信息的传递过程进行人为控制，将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达，从而创造出人类需要的蛋白质表达产物和遗传修饰生物体,一、基因重组基本过程,*,分,离目的基因；,载体和目的基因的,切,割；,载体和目的基因的连,接,；,重组,DNA,的,转,化、,转,染和扩增；,重组,DNA,的,筛,选和表达。,目的基因：,与重组,DNA,工作最终目的相关的基因，为获取所需,要的基因或蛋白质；,两大类：,基因组,DNA,和反转录合成的双链,cDNA,重组体：,目的基因与载体连接，具有自我复制的能力,重组体的筛选：,即筛选出成功转化带有重组体的阳性细胞克隆。,转化后的细胞进行扩增、繁殖，获得大量带重组体,DNA,的细胞繁殖群体。这样通过无性繁殖获得的大量,DNA,分子都是同一祖先的相同拷贝，称,DNA,克隆。,分为三个步骤：构建重组,DNA,分子、引入受体细胞和筛选克隆。,基因重组示意图,二、基因载体,游离的外源,DNA,不能复制，携带外源基因的复制子成为,基因载体,。基因工程中常用的载体,(vector),主要包括,质粒,(plasmid),、,噬菌体,(phage),和,病毒,(virus),三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。,1,质粒,是存在于细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的,共价、闭环、小分子双链,DNA,，具有,独立复制,的能力，通常带有细菌的,抗药基因,。,最早使用的质粒,DNA,是人工构建的,pBR322,，该质粒分子大小为,4.3kb,，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含,EcoR,，,BamH,，,Hind,等单一的限制酶切点。,质粒,pUC19,的分子结构,基因载体应具备特点*,1.,具有,独立,复制能力,，,在细胞中能大量繁殖,，从而使目的基因大量扩增,2.,作为表达载体应能利用宿主的酶系统，,表达目的基因,（表达能力）,3.,具有适当的限制性内切,酶识别和切割位点（,酶切位点）,4.,细胞内稳定性高（,持续表达和复制）,5.,具有供筛选用的（,遗传标记）,6.,相对分子量小（,一定的容量）,2,噬菌体,DNA,可通过转染方式将其,DNA,送入细菌体内进行增殖。常用的克隆载体的噬菌体,DNA,有,噬菌体和,M13,噬菌体,。重组噬菌体,DNA,在体外被蛋白包裹成噬菌体颗粒才能转染宿主菌导入外源,DNA,。,2,噬菌体,DNA,噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单个或两个的限制酶切点。,作为插入型载体允许在切口处插入长,5,7kb,外源,DNA,片段，适用于,cDNA,的克隆；或作为置换型的载体，其两切点间的片段，可以用,5,20kb,的外源,DNA,替换，适用于基因组,DNA,克隆。,2,噬菌体,DNA-M13:,环状单链,DNA,，其在宿主内复制时形成双链,DNA,，称为复制型,-,半乳糖苷酶,的启动子及,链,的,DNA,序列,，作为筛选标志,突变型,lac E.coli,可表达该酶的片段（酶的,C,端区）。当宿主和转入载体同时表达、两个片段时,，通过片段互补机制形成具有活性的,-,半乳糖苷酶，可使人工底物,X-gal,转变为蓝色。,LacZ,基因编码的,肽链与失去了正常氨基端的,半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为,互补；,如果插入的外源基因是在载体,lacZ,链基因内，则会干扰,lacZ,的表达，利用,lac E.coli,为转染或感染细胞，在含,X-gal,的培养基上生长时会出现白色菌落。这一现象可用于重组体筛选，又称蓝白斑实验,。,3,柯斯质粒载体,又称粘粒，是经改造过的质粒，是具有质粒和噬菌体载体双重特点的大容量载体，既含有质粒的复制位点、抗药标记及限制性内切酶位点，又含有为包装,DNA,进入噬菌体颗粒的,DNA,序列，即,cos,位点,。,用柯斯质粒克隆时，,35,45kb,的外源,DNA,连接到线性载体,DNA,，形成柯斯位点作为外源,DNA,两侧翼的结构，且两个的方向相同，即两个黏性位点之间是完整的质粒基因和外源,DNA,。,进行体外包装时，黏性位点被噬菌体的,A,蛋白切断，两个柯斯位点之间的,DNA,包装为成熟的噬菌体颗粒。,转染大肠埃希菌时，线状的重组,DNA,被注入细胞内。在细胞内通过黏性末端而环化，环化后的分子含有完整的柯斯质粒载体，像质粒一样繁殖并使宿主菌表现抗药性，可用含抗生素的培养基进行培养,。,4,动物病毒载体,具有在动物细胞中被识别的复制表达体系，可用于真核细胞的基因转移，尤其是以基因治疗为目的的系统，主要是因为病毒基因组的结构相对简单，分子背景清楚，易于改造和操作，且转染率高。,现在较为常用的病毒载体有反转录病毒、腺病毒和痘苗病毒等。,4,动物病毒载体,SV40-,猴空泡病毒,40,，通过感染方式将其,DNA,送入哺乳动物细胞中进行增殖。,SV40,病毒的基因组是一种环形双链的,DNA,，基因组,5.2kb,，病毒的直径,45nm,，病毒成熟部位细胞核，无被膜，,72,个核壳粒亚单位，这种大小很适于基因操作。同时它也是第一个完成基因组,DNA,全序列分析的动物病毒。,理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：,能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要 有较高的自主复制能力。,容易进入宿主细胞，而且进入效率越高 越好。,容易插入外来核酸片段，插入后不影响 其进入宿主细胞和在细胞中的复制。,容易从宿主细胞中分离纯化出来。,有容易被识别筛选的标志。,(,一,)DNA,重组技术中最常用的工具酶,酶类,主要用途,限制性核酸内切酶,识别,DNA,特定序列，切断,DNA,链,DNA,聚合酶,I,（,1,）缺口平移制作标记,DNA,探针；（,2,）合成,cDNA,的第二条链；（,3,）填补双链,DNA3,末端；（,4,）,DNA,序列分析,反转录酶,（,1,）合成,cDNA,；（,2,）替代,DNA,聚合酶,进行填补，标记或,DNA,序列分析,末端核苷酸转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,三、工具酶,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,基因工程诞生的技术突破,限制性内切酶（,restriction enzymes,）,1970,年,H.O.Smith,等分离出第一种限制性核酸内切酶。,Werner Arber,理论预见限制酶,Daniel Nathans,用限制酶切得,SV40 DNA,片断,Hamilton O.Smith,得到第一个限制酶,1978,年,Nobel,生理或医学奖,（二）限制性核酸内切酶*,可以识别,DNA,的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链,DNA,，被称为,基因工程的手术刀,，广泛使用。已发现多种细菌都含有这类限制,修饰酶体系。,作用,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源,DNA，,保护自身,DNA。,分类,、,（基因工程技术中常用型）,（二）限制性核酸内切酶种类,类酶识别序列特点,回文结构,(,palindrome),切口：,平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,回文结构：,II,类限制内切酶要求严格的识别序列和切割位点，大部分,II,类酶识别,DNA,中,4-8bp,具有反转对称的序列。,（二）限制性核酸内切酶作用特点,产生,5,突出粘性末端,(cohesive end):,以,EcoR I,为例：,5GAATT C3,5G-pTTAAC3,3C TTAAG5,3 CTTAA p-OH G5,产生3突出的粘性末端：,以,Pst,为例：,5CTGCAG3,5CTGCAOH-pG3,3GACGTC5,3Gp-OHACGTC5,产生平末端,(blunt end):,Nru,为例：,5GTTAAC3,5GTTOH-pAAC3,3CAATTG5,3CAAp-OHTTG5,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease),在重组,DNA,技术中有重要地位,限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近,1800,多种，可根据它们对,DNA,有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因工程提供有力工具。,配伍末端：,识别序列不同，但切割,DNA,后产生相同类型的粘性末端。,