临床基因扩增检验操作规范市公开课一等奖省优质课赛课一等奖课件.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,一、临床基因扩增检验试验室,规范化设置及其各室功效,二、各阶段操作要求,三、PCR污染与对策,四、因操作欠规范造成问题分析,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第1页,一、临床基因扩增检验试验室 规范化设置及其各室功效,规范化设置：,要求参考,临床基因扩增检验试验室管理暂行方法,（卫医发 10号文）附件,临床基因扩增检验试验室基本设置标准,。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第2页,1,.,四个隔开工作区域中每一区域都须有,专用,仪器设备。,2,.明确,标识,，如加样器或试剂等。,3.,单一方向,次序，从试剂贮存和准备区、标本,制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简,称扩增区）至产物分析区。,4.,使用,不一样颜色,或有显著区分标志工作服。,5.,试验室,清洁,应按试剂贮存和准备区至扩增,产物分析区方向进行。,6.,各自,清洁用具。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第3页,各室功效：,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第4页,（一）试剂贮存和准备区,功效：,贮存试剂制备、试剂分装和主反应混合液制备,。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第5页,含反应混合液离心管或试管在,冰冻前,都应快速离心数秒。,戴手套。,工作结束后必须马上对工作区进行,清洁,。试验台表面，使用可移动紫外灯（254nm波长）照射，普通照射过夜。,试验室及其设备使用必须有,日常统计,。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第6页,（二）标本制备区,功效：,临床标本保留，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA合成。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第7页,要,正确,使用加样器。,正压条件防止从邻近区进入本区气溶胶污染。,为防止样本间交叉污染，加入待测核酸后，必须,盖好,含反应混合液反应管。,对含有潜在传染危险性材料，必须有,明确,样本处理和灭活程序。,用过加样器吸头必须放入专门消毒容器内。,用于RNA扩增检测样本制备好以后，应,马上,进行cDNA合成。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第8页,（三）扩增区,功效：,DNA或cDNA扩增,。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第9页,已制备DNA模板和合成cDNA加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。,在巢式PCR测定中，第二次加样必须在本区内进行。,可降低本区气压以防止气溶胶从本区漏出。,如有加样则应在超净台内进行。,打开反应管前快速离心数秒。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第10页,（四）扩增产物分析区,功效：,扩增片段测定。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第11页,膜上微孔板上探针杂交方法、Southern转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。,本区是最主要扩增产物污染起源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质，注意试验人员,安全防护,。,负压条件。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第12页,二、各阶段操作要求,测定分析前标本采集处理、测定中核酸提取、扩增和产物分析以及测定后结果汇报等。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第13页,（一）标本采集,临床标本包含,EDTA,或,枸橼酸钠,抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。,EDTA和枸橼酸盐是首选抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因,肝素是Taq酶强抑制剂,。,玻璃器皿在使用前应高压处理，250,烘烤,4小时以上可使RNA酶永久性失活。,临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测血标本应尽快（,3小时以内,）分离血浆，以防止RNA降解。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第14页,（二）标本稳定化处理,DNA：不需特殊稳定化处理。,RNA：异硫氰酸胍盐（GITC）可使,DNA酶和RNA酶失活。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第15页,（三）标本运输,可在常温下经过邮寄运输，如用于DNA扩增检测EDTA抗凝全血及用于RNA扩增检测,GITC,稳定化处理标本。,未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运输。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第16页,（四）标本贮存,1.血清/血浆等-70,2.用于DNA测定已,纯化核酸,样本 4,3.用于RNA测定已纯化核酸样本-80,4.用乙醇沉淀核酸样本-20,5.GITC处理RNA标本在室温可保留7天,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第17页,（五）标本处理（核酸提取）,抑制物,可能起源于：,标本本身（如血红素及其前体或降解产物）。,核酸提取过程中残留有机溶剂（如酚、氯仿等）。,痰须液化处理。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第18页,操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）,注意：,离心管不能插得过低，以防进水；,水浴时不能加盖，防管盖爆开；,水浴时间须准确，101 min；,水浴时不能走开；,左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第19页,（六）靶核酸逆转录（RT）和扩增,有各种原因可引发核酸扩增检测,假阴性,结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg+浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。,扩增仪孔中热传导,均一性,极为主要。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第20页,RT-PCR操作注意：,标本必须新鲜；,做RNA标本枪头离心管必须无菌；,冰上操作；,处理完后须马上上机，不能放置；,注意左右手分开。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第21页,（七）扩增产物分析,扩增产物测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第22页,实时荧光定量PCR,在荧光定量PCR基础上实时监测PCR全过程，最终经过曲线进行定量分析。,与普通荧光定量PCR使用荧光强度定量不一样，实时荧光PCR普通使用,Ct,（每个反应荧光信号到达设定域值所经循环数）定量，,Ct,与模板初始拷贝数对数成线性关系。,实时荧光PCR优点：,精密度高，重复性能好。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第23页,TaqMan荧光定量PCR原理,探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标识，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光；,探针与模板杂交在引物区间内，当扩促进行时，Taq DNA聚合酶5-3外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭基团分开，受激产生荧光信号；,荧光信号强度与扩增产物量成正比；,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第24页,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第25页,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第26页,三、PCR污染与对策,PCR污染分环境污染与反应液污染二种。常见PCR污染源有三个：,第一、标本间交叉污染；,第二、试验室中克隆质粒污染；,第三、PCR,产物,污染（,Carryover,）。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第27页,要预防PCR污染，必须做好以下3个步骤工作：,（一）污染预防,（二）污染源追踪,（三）污染源处理,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第28页,（一）污染预防,操作PCR时，按照下述规则可有效地预防PCR污染。,1、PCR前处理及后处理要在不一样隔,离工作台上或房间内进行。,2、分装试剂，标识批号,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第29页,3、改进试验操作：,(1)带一次性手套；,(2)防止反应液飞溅；,(3)用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于,空气，以免产物气溶胶污染；,(4)操作多份样品时，要先将可混匀成份,(dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准,混合液(Master mix)；,(5)制备反应混合液时，最终加入样品DNA，,加入DNA后，在进行下一步操作前要盖紧,反应管。,4、检验结果可重复性。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第30页,（二）污染源追踪,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第31页,1、阳、阴性对照,选择阳性对照时，应选择扩增,弱,，,且,重复性好,样品。,阴性对照选择一定要小心。,不含模板DNAPCR试剂对照。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第32页,2、常见环境污染源有,(1)点杂交点样器；,(2)切片机；,(3)离心机；,(4)切胶用刀或微解剖刀；,(5)浓缩用具，真空瓶；,(6)电泳装置和紫外灯箱；,(7)干冰/乙醇或水溶锅；,(8)冰箱门把手、冷冻架和门把手。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第33页,追踪可疑环境污染源,用去离子浸湿灭菌棉签擦试可疑部分,在,0.1ml,去离子水中浸泡；,取,5l,作PCR反应；,电泳检验结果。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第34页,（三）污染源处理,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第35页,1.环境污染处理法,（1）,稀酸处理法,。,对擦试试验阳性部位或器件可用1mol/LHCl擦洗或浸泡残留DNA。,（2）,紫外法,：,UV照射波长普通选择254/300nm，需考虑PCR产物长度与产物序列中碱基分布。UV对长片段（,500bp,以上）有效，而对短片段效果不大。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第36页,2.反应液污染处理法,(1),DNaseI法,：,PCR混合液（不加模板和Taq酶）中加入0.5U DNaseI，室温下作用30min后，加热灭活，加入模板和Taq酶后即可进行正常PCR。,优点：廉价，不需知道扩增DNA序列。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第37页,(2),内切酶法,：,选择识别四个碱基内切酶（如MspI等），最好几个适用，可克服其识别序列特异缺点。方法同上，只是DnaseI由内切酶（MspI10U）代替，作用时间延长到1.01.5h。,(3),紫外照射法,：,反应中不加模板与Taq酶。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第38页,(4),尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法,：,dUTP代替反应中dTTP，使产物中含大量dU，UNG可去除dU，使失去dU位置，阻止Taq酶延伸。PCR正常循环前，用UNG处理PCR反应混合液可消除PCR产物污染，而UNG在正常PCR循环变性一步就会失活，所以，对含dU新合成PCR产物没有影响。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第39页,T A T A T,A T A T A,PCR,A U A,U A U,UNG,A A,A,加热,A A,A,PCR,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第40页,该法,优点,：,去除任河起源（包含引物在内）,污染；,因为污染产物有大量dU存在，,所以，UNG处理会彻底消除污染。,UNG处理与PCR扩增可在同一试管,内进行。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第41页,四、因操作欠规范造成问题分析,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第42页,（一）试验室仪器设备,1、设备不齐全、不配套，使得试验结果不稳定，引发假性结果。,旋涡混合器,，微量加样器，正规紫外透射仪。,RNA PCR样品处理时，血清（或血浆）中加入强,烈变性剂后，血样中蛋白变性、结块。,吸头与微量加样器不配套。,2、PCR热循环仪差异或质量问题。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第43页,移液器：,禁止大力往返拧动；,禁止调至容量之外使用；,第二档为排空档，不得作吸收之用；,吸头应浸入液面23mm处吸收；,禁止将有液体移液器平放或倒置；,混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，重复吸收液体，将沉淀重复混匀，溶解；,每七天用75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第44页,离心机：,离心前，离心管须配平；,将调速档打至0档位，才能打开电源开关，逐步升高转速，直至即定转速；,定时旋钮不能强行归零；,转头未停顿时，禁止打开盖板。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第45页,（二）试验室布局不合理引发污染问题,1、样品处理不进行隔离，,样品中各种核酸片,段均会经过空气进行传输,。,2、PCR结果检测试验室和其它试验室在一,起，,会出现严重扩增子污染,。,3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公,用，,也会造成严重污染。,4、试验室操作垃圾（,吸头、离心管、样品杯 等,）乱,放，,飘散在空气中核酸片段、病原微生物可造成试验室,污染。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第46页,（三）PCR操作中存在问题分析,1.阳性变阴性,2.阴性变阳性,3.PCR结果不稳定,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第47页,1.阳性变阴性,(,1)有些阳性病人，经过PCR检测后为阴性，可能有两种情况：,一是采集标本方法或部位不正确，,二是假如病人取样部位病原体消失，需依据病人病理情况采样。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第48页,(2)标本保留不妥，可引发PCR失败。,搜集标本乱放（未放冰箱），病原体破裂，检测核酸降解，失去了PCR检测模板或造成标本污染。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第49页,2.阴性变阳性,常见原 因有以下6点：,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第50页,加入试剂或样品时引发交叉污染,（最好在加完全部其它反应成份，包含预防蒸发用矿物油后才吸加,模板DNA,，将模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套手指轻轻单击管侧壁，以摇匀液体，再作瞬时离心10秒，使水相和有机相分开）。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第51页,加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可经过使用有滤筛吸头防止污染,（将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别反应，全部并非即用管都应盖严）。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第52页,打开标本管盖引发样品飞溅,（打开前须瞬间离心）,操作时手套引发交叉污染,（拿过模板DNA管后应更换手套）,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第53页,不明原因引发公用试剂如液体石蜡等污染,（必须设置一个不含模板DNA但含PCR系统中全部其它成份对照反应。这一对照管须在准备好全部其它PCR以后才进行吸加）。,试验室污染,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第54页,3.PCR检测结果不稳定,（1）样品处理方法不妥，标本中杂质很多，,血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。,蛋白质DNA电泳带拖尾,血红素中卟啉化合物抑制Taq酶活性,代谢产物干扰引物配对,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第55页,（2）操作不妥带来后果,主要指不能严格按照说明进行操作造成PCR检测失败。,如HCV RNA PCR样品处理试剂A、B、C和75%乙醇操作过程。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第56页,50l血清标本,(标本可用血清或血浆，尽可能防止使用肝素做抗凝剂，,防止重复冻融),加200l试剂A后马上混匀,(试剂A是强烈,变性剂,，不但要将病毒外壳变性裂解，释放,核酸，而且要将样品中包含其它蛋白（包含RNase）变性，,以防止蛋白进入PCR反应体系（RNase降解RNA模板），干,扰PCR扩增；,混匀,这一步至关主要，一定要振荡混合均匀才,能到达充分变性结果。),加入试剂B（氯仿、异戊醇）50l混匀,（抽取变性剂及变性蛋白，分离出核酸，一样必须充分,混匀,，不然也会引发PCR检测失败),Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第57页,14 000r/min离心5min取上清80100l,(取上清一定要,小心,，不能抽取中间蛋白沉淀层，不然,因核酸沉淀中含有变性蛋白，引发PCR检测失败),加等体积试剂C14 000r/min离心10min，弃上清,(将核酸从水溶液中沉淀浓缩),用75%乙醇洗一次,(除去与核酸共沉淀盐及杂质),干燥备用,(干燥后，切勿将管子,倒置,或掉落，预防沉淀飞出管底),Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第58页,在痰标本处理时液化是十分主要，痰没有彻底液化，病原体不能完全释放出来；反之液化过分会使病原体裂解，造成PCR检测失败。,总之，,样品处理,对PCR检测是至关主要，是造成PCR检测失败最常见原因之一。,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第59页,谢谢,Evaluation only.,Created with Aspose.Slides for.NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0.,Copyright-Aspose Pty Ltd.,第60页,