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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。,第四章,普通毒性作用及其试验与评价方法,1/50,1 急性毒性作用,2 亚慢性和慢性毒性作用,3 蓄积毒性,4 局部毒性作用,2/50,1 急性毒性作用,一、急性毒性和急性毒性试验目标,二、急性毒性试验,三、急性毒性分级,急性毒性作用,3/50,一、急性毒性和急性毒性试验目标,急性毒性,(acute toxicity)是指机体(人或试验动物),一次接触或24小时内屡次接触,化学物后在,短期,内所发生,毒性效应,，包含普通行为、外观改变、大致形态改变以及死亡效应。,急性毒性作用,4/50,一、急性毒性和急性毒性试验目标,目标,测试和求出化学毒物对一个或几个试验动物致死量(以,LD,50,表示,)以及其它急性毒性参数，了解急性毒作用强度。,并经过观察动物中毒表现和死亡情况，了解急性毒作用性质、可能靶器官和致死原因，提供化学毒物急性中毒资料、初步,评价对人体产生损害危险性,。,探求化学毒物急性毒性,剂量反应关系,与中毒特征。,为亚慢性、慢性毒性作用试验染毒剂量设计提供参考依据。,研究化学毒物急性中毒预防和抢救治疗办法。,为毒理学机制研究提供线索,。,急性毒性作用,5/50,一、急性毒性和急性毒性试验目标,急性毒性试验惯用毒性参数：,LD,50,/LC,50,Z,ac,（LD,50,/Lim,ac,）,LD,84,/LD,16,(或LC,84,LC,16,),剂量反应曲线斜率,急性毒性作用,6/50,毒作用带,急性毒作用带（acute toxic effect zone,Z,ac,）,为半数致死剂量与急性阈剂量比值，表示为：,Z,ac,=LD,50,/Lim,ac,Z,ac,值小，说明化学物质从产生轻微损害到造成急性死亡剂量范围窄，引发死亡危险性大；反之，则说明引发死亡危险性小。,7/50,二、急性毒性试验,(一)试验动物,标准：,急性毒性试验要求选择对化学毒物代谢和毒效应表现与人反应尽可能一致试验动物。,动物易于取得,品系纯化,价格较低和易于喂养等条件。,急性毒性作用,8/50,二、急性毒性试验,1试验动物种属和品系,最好用两种种属动物,啮齿类:,小鼠、大鼠、豚鼠或家兔,非啮齿类：,狗或猴。,急性皮肤毒性试验,可选取成年大、小鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。,急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验,则优先考虑大、小鼠。,急性毒性作用,9/50,二、急性毒性试验,试验动物年纪和体重：,急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕动物。比如：大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、狗46kg。(小犬),同一批试验动物体重变异范围不应超出该批动物平均体重20。,急性毒性作用,10/50,品 系,周龄 Wistar SD,雌性雄性雌性雄性,354565052,4919786101,5134134130150,6166187172206,7209233210262,8214297240318,9232325258365,10246370272399,大鼠体重与周龄关系,11/50,小鼠体重与周龄关系,品 系,周龄 昆明 BALB/c C57BL/6 615,雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性,01.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58,15.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64,27.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96,313.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83,421.35 22.6011.6012.4512.2012.5715.7519.00,527.90 33.2514.7516.1016.9018.1020.7522.58,632.80 39.2515.6017.4018.4020.5021.8825.96,734.70 39.9016.1018.6519.0021.6023.1227.96,834.80 40.0518.1620.2520.2522.4024.1628.83,12/50,二、急性毒性试验,3.试验动物性别：,急性毒性试验主要内容是求LD,50,，除特殊要求外，普通急性毒性试验对动物性别要求为,雌雄各半,。,假如在预试验时发觉化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应敏感性有显著差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自LD,50,。,假如试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物LD,50,测试。,急性毒性作用,13/50,二、急性毒性试验,4.动物数量与随机分组：,大、小鼠等小动物 每组10只，兔每组8只,狗等大动物 每组6只,分组标准随机化标准,普通要求设5-7组,5.禁食：,经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食,大鼠、小鼠隔夜进食；染毒后禁食4h,大动物每日早晨喂食前染毒,染毒后继续禁食24h，但在禁食时要保障饮水。,6.试验动物预检：,选择健康动物,12周检疫期,急性毒性作用,14/50,二、急性毒性试验,（二）试验动物喂养环境,恒定温度：223,湿度：3070%,照度：昼夜各半,饲料合格、饮水合格、垫料合格,急性毒性作用,15/50,二、急性毒性试验,（三）染毒路径选择:,染毒路径（exposure routes）选择需考虑：,模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物路径和方式,；,有利于不一样化学物之间急性毒性大小比较,；,受试物性质和用途；各种受试物毒性评价程序要求等。,最惯用染毒路径为,经口、经呼吸道、经皮及注射路径。,急性毒性作用,16/50,对同一个毒理学试验应该用同一个、同一批号受试物,受试物成份和配方必须固定,如是异构体混合物，异构体百分比必须固定,活性成份百分含量和可检测杂质浓度也,应固定,受试物在贮存期内稳定性和在饲料中稳定性,必须进行研究并汇报,受试物应一次备齐全部试验用量,受试样品,17/50,二、急性毒性试验,经口(胃肠道)接触,:,灌胃:,小鼠0.2,1.0ml/只或0.1,0.5ml/10g,大鼠一次灌胃体积不超出5ml/只,家兔不超出10ml/2kg,狗不超出50ml/10kg,吞咽胶囊:,经呼吸道接触,:,静式吸入,动式吸入,经皮肤接触,:,注射路径接触:,急性毒性作用,18/50,二、急性毒性试验,（四）染毒剂量与分组:,1查阅文件,了解化学毒物结构式、分子量、常温常压下状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特征，生产批号及纯度，杂质成份与含量等。,确定使用哪一个计算方法求LD,50,，然后再设计剂量分组。LD,50,计算方法惯用寇氏法、概率单位法、霍氏法等。,找出与受试化学毒物结构与理化性质近似化学物毒性资料，并以文件资料中相同动物种系和相同接触路径所测得LD,50,(LC,50,)值作为受试化学物,预期毒性中值,。,急性毒性作用,19/50,二、急性毒性试验,2预试验,设定以此预期值作为待测化学物中间剂量组，并在该剂量上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。,依据确定剂量组进行染毒。,依据预试验死亡资料,确定组距。,可依据以下公式计算出剂量分组：,i=(lgLD,90,-lgLD,10,)(n-1)或：i=(lgLD,100,-lgLD,0,)(n-1),式中i为组距(相邻两个剂量组对数剂量之差)；,n为设计剂量组数。,急性毒性作用,20/50,组距(对数)或,式中：n-设计剂量组数,21/50,二、急性毒性试验,3正式试验,普通来说，依据试验设计所选取LD,50,计算方法来确定组数。比如几率单位法、寇氏法普通设610个剂量组；霍氏法固定设4个剂量组。求得i值后以最低剂量组(LD,0,或LD,10,)对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组对数剂量，依这类推直至最高剂量组，查各自反对数即得出各组剂量真实值。,1 2 3 4 5,LgLD,0,LgLD,0,+i LgLD,0,+2i LgLD,0,+3i LgLD,0,+4i,另一个方法：,算出公比 r,急性毒性作用,22/50,二、急性毒性试验,（五）试验周期与毒效应观察,1.中毒症状,急性毒性作用,23/50,二、急性毒性试验,2.体重,在观察试验动物中毒症状过程中，应同时观察体重改变。,体重能够反应动物中毒后整体改变。,体重改变原因很多：,若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食降低甚至拒食，表现为体重减轻。,若化学毒物引发腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。,若化学毒物影响水摄取或肾功效急性损伤，也可能在体重上反应出来。,所以，对存活动物尤其是对低于LD,50,剂量组存活动物应在观察期14天内称量其体重改变方便了解受试物引发毒效应连续时间。,急性毒性作用,24/50,二、急性毒性试验,3.病理检验及其它指标:,急性毒性试验中，,对死亡动物,均应及时进行大致解剖和病理组织学检验，肉眼观察主要脏器大致病理改变，如脏器大小、外观、色泽改变，有没有充血、出血、水肿或其它改变，对有改变脏器进行取材做组织病理学检验。,观察期结束后对存活动物,进行大致病理检验必要时做组织病理学检验。依据试验需要可深入扩大观察项目。如体温、心电图、脑电图或进行一些生化指标测定等。,急性毒性作用,25/50,二、急性毒性试验,4.死亡和死亡时间,重点观察和统计每只动物死亡时间，尤其是最早出现死亡时间以及各个剂量组动物死亡数。对分析中毒死亡时间规律含有一定意义，可为深入研究化学物毒作用机制提供参考。,急性毒性作用,LD,50,测定与计算,26/50,二、急性毒性试验,(六)经典急性毒性试验不足,1.消耗动物量大,2.取得信息有限,3.测得LD,50,仅仅是一个近似值,4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单症状观察是不够，更需要是生理学、血液学及其它化验检验所提供深入细致毒性信息。,急性毒性作用,27/50,三、急性毒性分级与评价,外源化学物急性毒性分级（WHO）,毒性,分级,大鼠一次经口LD,50,(mg/kg),6只大鼠吸入4小时，死亡24只浓度(ppm),兔经皮LD,50,(/mg/kg),对人可能致死预计量,g/kg,总量(g/60kg),剧毒,1,10,5,15,1000,急性毒性作用,28/50,29/50,我国食品毒理急性毒性分级法(1994),急性毒性分级,大鼠经口LD,50,(mg/kg),大致相当于70kg人致死量,6级(极毒),1,稍尝,15000,1050克,急性毒性作用,30/50,一,亚慢性毒性作用：,亚慢性毒性概念,亚慢性毒性试验目标,亚慢性毒性试验设计,二 慢性毒性作用：,慢性毒性概念,慢性毒性试验目标,慢性毒性试验设计,2 亚慢性和慢性毒性试验,亚慢性和慢性毒性试验,31/50,(一)概念：,亚慢性毒性,(subchronic toxicity)是指人或试验动物,连续接触,较长时间、较大剂量,外源化合物所引发毒性效应。,慢性毒性,(chronic toxicity)是指人或试验动物,长久(甚至终生)重复接触,低剂量,化学毒物所产生毒性效应。,亚慢性和慢性毒性试验,一、亚慢性和慢性毒性试验概念、目标,32/50,（二）试验目标：,1.确定受试物亚慢性和慢性毒性效应谱，对在急性及亚急性毒性试验中发觉毒作用提供新信息，,并发觉在急性及亚急性毒性试验中未发觉毒作用；,2.研究受试物亚慢性和慢性毒作用,靶器官,；,3.研究受试物亚慢性和慢性毒性,剂量反应(效应)关系,，确定其观察到有害作用最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用剂量（NOAEL），提出此受试物安全限量参考值；,4.研究受试物亚慢性和慢性毒性损害,可逆性,；,5.亚慢性毒性试验为慢性毒性试验剂量设计及观察指标选择提供依据；,6.确定不一样动物物种对受试物亚慢性和慢性毒效应差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据。,亚慢性和慢性毒性试验,一、亚慢性和慢性毒性试验概念、目标,33/50,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,（一）试验动物选择,亚慢性和慢性毒性试验,亚慢性毒性试验,年纪：,大鼠80100g,狗 812月,小鼠1015g,数量：,小动物20,大动物6,性别：,雌雄各半,慢性毒性试验,年纪：,大鼠 5070g,狗 8月,小鼠 初断乳,数量：,小动物40,大动物8,性别：,雌雄各半,34/50,（二）试验动物染毒期限：,工业毒理学 36个月,食品毒理学 6个月1年,环境毒理学 6个月1年,致癌试验 靠近或等于动物预期寿命,亚慢性和慢性毒性试验,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,35/50,经消化道,经呼吸道,经皮肤,亚慢性和慢性毒性试验,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,（三）试验动物染毒方式,36/50,亚慢性毒性剂量选择,阴性对照组,低剂量组,中剂量组,高剂量组,急性毒性阈剂量,1/201/5 LD,50,组距：310倍，最低大于2倍,慢性毒性剂量选择,阴性对照组,低剂量组,中剂量组,高剂量组,亚慢性阈剂量或其1/51/2,1/10,LD,50,组距：25倍，最低大于2倍,（四）试验分组和剂量设计,亚慢性和慢性毒性试验,37/50,（五）观察指标,亚慢性和慢性毒性试验,38/50,1.普通综合性观察指标：,外观体征、行为活动、体重、食物利用率,2.普通化验指标：,血常规；尿液检验；SGPT SGOT等,3.系统尸解和病理学检验：,（1）,脏器湿重、脏器系数（,脏/体比值,）,（,如肝/体比，即(全肝湿重/体重),100,）,（2）,病理学检验,4.特异性指标：,亚慢性和慢性毒性试验,（五）观察指标,39/50,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,40/50,一、,基本概念,二,、,蓄积毒性试验方法及其评价,蓄积作用及其评价,3 蓄积毒性,41/50,化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。不过，当化学毒物重复屡次给动物染毒，化学毒物进入机体速度(或总量)超出代谢转化速度和排泄速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐步增加并贮留，这种现象称为化学毒物,蓄积作用,(accumulation)。,蓄积作用及其评价,一、基本概念,42/50,蓄积性毒性作用分类：,物质蓄积,(material accumulation),机体少许重复屡次接触毒物，其量逐步积累，可分析检测出该物质增加过程，量随时间延长而增加，直至中毒阈值产生毒作用,功效蓄积,(functional accumulation),机体少许重复屡次接触毒物，每次引发功效损伤逐步积累，当积累到一定程度时出现毒性效应，而检测伎俩却查不出体内毒物存在或增加。,蓄积作用及其评价,一、基本概念,43/50,二、蓄积毒性试验方法及其评价,化学毒物,蓄积作用是发生慢性中毒物质基础,，,所以研究化学毒物在机体内蓄积性是评价化学毒物能否引发潜在慢性毒性依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数主要依据。,蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性主要内容之一，,目标是经过试验求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性强弱，,并为慢性毒性试验及其它相关毒性试验剂量选择提供参考。,蓄积作用及其评价,44/50,(一),蓄积系数法,蓄积系数,(accumulation coefficient)是屡次染毒使半数动物出现效应(或死亡)累积剂量ED,50,(n)与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)剂量ED,50,(1)比值，即：,KED,50,(n)/ED,50,(1),KLD,50,(n)/LD,50,(1),蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,45/50,1固定剂量法：,普通常选取,大、小鼠灌胃或腹腔注射,方法进行染毒。先求出LD,50,，然后选取相同条件40只(或更多)试验动物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组最少20只，雌雄各半。试验组在120l50LD,50,范围内选定一个剂量，,每日以固定剂量、定时和相同路径进行染毒,试验期间观察统计每组动物死亡数。,当试验组累积发生二分之一动物死亡即可终止试验,。此时，计算累积总接触剂量LD,50,(n)，依据公式计算K值，然后依表65进行评价。但若接触剂量已累积到达5个LD,50,剂量，也可终止试验。,蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,46/50,2剂量递增法：,在试验期间，当化学毒物引发动物,累积死亡二分之一时即可终止试验,，计算K值进行评价。普通来说，在试验第2l天也可结束试验，因为这之前假如动物没有死亡或死亡数不足二分之一，说明其累积剂量已达5.26LD,50,，即K5。使用本方法时要注意染毒期间定时(每4天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒物染毒绝对量。,蓄积作用及其评价,47/50,3剂量固定20天蓄积法：,它通常采取经口灌胃染毒方式，将动物随机分为5个组，包含阴性,对照组,和1/20 LD,50,、l/10 LD,50,、1/5 LD,50,和1/2 LD,50,四个剂量组,，每组动物数10只，雌雄各半。每日染毒一次，连续染毒20天。观察每组雌雄累计死亡动物数量。试验结束时依据以下标准进行评定：各剂量组均无死亡，即为蓄积性不显著；如仅1/2LD,50,剂量组有死亡，其它组均无死亡，则为弱蓄积性；如1/20LD,50,剂量组无死亡，其它各组间死亡数有剂量反应关系时，则为中等蓄积性；如1/20LD,50,剂量组有死亡，且有剂量反应关系，则为强蓄积性。,蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,48/50,(二)生物半减期法：,生物半减期(biological half-life，t,1/2,)法是用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内蓄积作用。,化学毒物在体内蓄积速度和量与机体单位时间内吸收该物质速度以及去除速度相关。即使化学毒物以相等时间间距恒速地吸收入血液，该物质在一定剂量范围内在机体蓄积量也不呈直线无限地增加，而是呈曲线形上升并有一定极限。这是因为化学物质吸收进入机体同时体内也发生着代谢转化及去除过程(包含血中化学毒物向组织脏器分配过程)。当化学毒物吸收过程与代谢转化去除过程到达平衡时，其蓄积量基本上不再增加。,普通来说，t,1/2,d较短化学毒物到达蓄主动限所需时间也短，t,1/2,长者到达蓄主动限时间也长。,蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,49/50,四、局部毒作用,1.皮肤原发性刺激试验,2.皮肤致敏反应试验,3.光致敏反应,4.光刺激试验,5.眼刺激试验,6.其它粘膜刺激试验,7.替换（体外）试验,局部作用,50/50,
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