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标题文本,正文级别 1,正文级别 2,正文级别 3,正文级别 4,正文级别 5,*,李涵乔 罗忠育 汤不器,P53基因表达检测RT-PCR,1,实验目的,根据GenBank中P53基因的部分序列(GenBank登录号:AH007667.2)，设计引物，确定RT-PCR的参数，检测P53基因在血细胞中的表达情况。,2,CONTENTS,02,03,在Genbank中查找p53基因,04,反转录的引物,05,PCR参数设定,目录,01,检测p53基因的表达,基因表达的检测方法,3,01,基因检测的方法,4,基因检测的方法,在蛋白质水平,在DNA水平,在mrna水平,Northern印记杂交,RT-PCR,.,5,mRNA水平上,Reverse Transcription PCR,RNA提取,cDNA,反转录,PCR,Northern 印记杂交,Northern,印记杂交,基因表达水平,6,RT-PCR,RT-PCR(反转录PCR技术),RNA的反转录（reverse transcription）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。,其原理是先在反转录酶的作用下，以mRNA为模板合成cDNA，再以此cDNA为模版进行PCR反应,低丰度的mRNA通过RT-PCR得以扩增，便于检测,7,1,2,3,随机六聚体引物,：用此种方法时，体系中所有,RNA,分子全部充当了,cDNA,第一链模板，,PCR,引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的,cDNA,中,96%,来源于,rRNA,。,特异性引物,：用含目标,RNA,的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的,cDNA,，导致更为特异的,PCR,扩增。,RT-PCR所用的引物,Oligo(dT),：是一种对,mRNA,特异的方法。因绝大多数真核细胞,mRNA,具有3端,Poly(A),尾，此引物与其配对，仅,mRNA,可被转录，特异地将mRNA从总RNA中分离出来,8,02,在Genbank中查找p53基因,9,查找p53基因序列,使用genbank，p53登陆号AH007667.2,www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank,10,11,12,13,14,03,引物设计,15,1,5,2,6,3,7,4,8,引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性,产物不能形成二级结构,引物长度一般在,1530,碱基之间,G+C,含量在,40%60%,之间,碱基要随机分布,引物自身及之间不能有连续,4,个碱基的互补,引物,5,端可以修饰,引物,3,端不可修饰,引物,3,端要避开密码子的第,3,位,引物设计的原则,16,Primer premier 5.0,PrimerPremier5.0,是由加拿大的,Premier,公司开发的专业用于,PCR,或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗口（,Genetank,），引物设计窗口（,PrimerDesign,），酶切分析窗口（,RestrictionSites,）和纹基分析窗口（,Motif,），这里我们主要介绍其引物设计功能。,引物设计,17,启动界面,引物设计,18,在此输入需扩增的,DNA,序列,引物设计,19,引物设计,20,引物设计,21,引物设计,22,引物设计,23,引物设计,24,Hairpin,：发夹结构,Dimer,：二聚体,False Priming,：错配,Cross Dimer,：交叉二聚体,引物设计,25,引物设计,26,引物设计,27,保存,选择满意的引物,引物设计,28,所选引物,引物设计,29,04,确定RT-PCR的参数,30,确定RT-PCR的参数,确定四项参数,循环次数,27次,延伸温度和时间,73度 60秒,退火温度和时间,55度 45秒,变性温度和时间,94度 30秒,变性,退火,循环次数,延伸,31,确定RT-PCR的参数,一、变性温度和时间,变性：cDNA在较高温度下（93-98）由双链变性解链成单链，有利,于与引物结合。,温度与时间：预变性95 1min,变性95 30s或9715s,（变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。在变性中，温度太高或反应时间过长，会导致酶活性的损失。）,模板DNA变性不充分是PCR失败的主要原因。,32,确定RT-PCR的参数,二、退火温度和时间,退火：变性的DNA单链快速冷却至（37-65）使引物与DNA单链结合。,退火温度决定PCR的特异性（增加退火温度会增加引物的识别，同时可降低引物3端核苷酸的错误延伸。）,而引物退火温度和所需时间长短取决于反应体系中的基本组成及扩增引物的长度和浓度。,退火时间：3060s,退火温度：比扩增引物的Tm值低5,33,确定RT-PCR的参数,三、延伸温度与时间,引物延伸温度一般为72（70-75），此时Taq DNA聚合酶活性最高,不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性,亦会影响其产量。,延伸的时间决定于扩增模板的长度，小于1kb的片段一般1min左右，而10kb的片段可能需要15min或更长时间。,34,确定RT-PCR的参数,四、循环次数,理论上20-25个循环后，扩增DNA产物累计可达最大值，实际操作中25-30较合理。,需要进一步增加产量时，可将第一次PCR产物稀释后再扩增，而不要盲目增加循环数，以免增加非特异扩增。,35,确定RT-PCR的参数,常用底物浓度,Taq,聚合酶浓度,1.0-2.5U/100L,引物浓度,0.1-0.5mol/L,dNTP,的浓度,20-200mol/L,Mg,离子浓度,0.5-2.5mmol/L,四、确定反应底物浓度,36,05,检测p53基因的表达,37,出现的原因以及解决方法,1.假阳性：常常由于实验材料的啮齿类动物p53基因为突变型,2.出现非特异性扩增带：一旦出现了非特异性扩增，就考虑及时更换引物，或者采取高温退火等措施,3.假阴性：少加了东西或者酶失活了，或退火温度太高，模板质量问题等，解决办法就是检查是否少加东西降低退火温度或者做个梯度，可以相应提高镁离子浓度，仍然失败后可以考虑二次PCR。,基因表达检测,38,电泳结果分析,1.Marker（DNA分子量标准）,2.cDNA,3.假阳性对照（出现的PCR扩增条带一致，有时更整齐更明亮）,4.假阴性对照（什么条带没有）,1 2 3 4,基因表达检测,39,常见异常结果,1.假阳性：出现的条带数与目的靶序列条带一致，有时其他条带更整齐，亮度更高,2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带,3.假阴性：什么条带都不出现,基因表达检测,40,出现的原因以及解决方法,1.假阳性：常常由于实验材料的啮齿类动物p53基因为突变型,2.出现非特异性扩增带：一旦出现了非特异性扩增，就考虑及时更换引物，或者采取高温退火等措施,3.假阴性：少加了东西或者酶失活了，或退火温度太高，模板质量问题等，解决办法就是检查是否少加东西降低退火温度或者做个梯度，可以相应提高镁离子浓度，仍然失败后可以考虑二次PCR。,基因表达检测,41,Thank you,42,