酶工程制药专题知识.pptx

,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,酶工程制药专题知识,酶工程制药专题知识,第1页,提酶及,电泳,酶工程制药专题知识,第2页,酶在医药领域应用（,1,）,1,、,在疾病诊疗方面应用,包含两个方面：一是依据体内原有酶活力改变来诊疗一些疾病，如利用谷丙转氨酶活力升高来诊疗肝炎；二是用酶测定体液中一些物质量诊疗疾病，如利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量，诊疗糖尿病等。,2,、在疾病治疗方面应用,种类很多，主要有：蛋白酶，主要用于消化不良和食欲不振等；溶菌酶，含有抗菌、消炎、镇痛等作用；超氧化物歧化酶，含有抗辐射、抗氧化作用；,L-,天冬酰胺酶，用于治疗白血病；尿激酶，含有溶血栓作用；其它相关酶制剂，如细胞色素,c,等。,酶工程制药专题知识,第3页,酶在医药领域应用（,2,）,3,、在药品生产方面应用,酶在药品制造方面应用是利用酶催化作用将前体物质转化为药品。这方面应用日益增多。如：利用青霉素酰化酶制造半合成青霉素和头孢霉素、利用,-,酪氨酸酶制造多巴、利用核苷磷酸化酶生产阿糖腺苷、利用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素等。,4,、在分析检测方面应用,用酶进行物质分析检测方法统称为酶法检测或酶法分析。酶法检测是以酶专一性为基础、以酶作用后物质改变为依据来进行。依据酶反应不一样，酶法检测能够分成单酶反应、多酶偶联反应和酶标免疫反应等。,酶工程制药专题知识,第4页,第一节 概 述,一、酶特征,酶,(enzyme),是由活细胞产生含有特殊催化功效一类蛋白质。也称为生物催化剂。,酶促反应：指反应物（或称底物）在酶催化作用下所进行反应。,酶工程制药专题知识,第5页,酶普通特征：,参加化学反应过程时能加紧反应速度；,降低反应活化能；,不改变反应性质即不改变反应平衡点；,反应前后其数量和性质不变。,酶工程制药专题知识,第6页,酶独自特点：,催化效率高,专一性强,反应条件温和,催化活性受到调整和控制,酶工程制药专题知识,第7页,酶分类：,1961,年国际生物化学联合会酶学委员会,按酶所催化反应类型,将酶分成,6,大类：,氧化还原酶类；,转移酶类；,水解酶类；,裂合酶类；,异构酶类；,合成酶,(,或称连接酶,),类。,酶工程制药专题知识,第8页,二、酶工程介绍,酶工程（,Enzyme engineering,）,是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成一门新技术学科。它是,从应用目标出发研究酶、应用酶特异性催化功效，并经过工程化将对应原料转化成有用物质技术,。,酶工程制药专题知识,第9页,酶工程历史,在,20,世纪,20,年代初就出现了酶工程，在当初，主要是指自然酶制剂在工业上大规模应用。,酶固定化技术诞生：,1953,年，,Grubhoger,和,Schleith,首先将羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等，用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂进行,固定,，提出了酶固定化技术。,1969,年，日本学者首先应用,固定化酶技术,成功地拆分了,DL-,氨基酸。,酶工程制药专题知识,第10页,1971,年，第一届国际酶工程会议提出,酶工程内容,主要是：酶生产、分离纯化、酶固定化、酶及固定化酶反应器、酶与固定化酶应用等。,伴随科学发展和酶技术研究深入，酶应用所包括面越来越广，在工业、农业、医药和食品等领域中应用都有广泛应用。,酶工程制药专题知识,第11页,酶工程内容,酶,分离,、,提纯,、大批量生产及新酶和酶应用开发；,酶和细胞,固定化,及,酶反应器,研究,(,包含酶传感器、反应检测等,),；,酶生产中基因工程技术,应用及遗传修饰酶,(,突变酶,),研究；,酶分子,改造与化学修饰,、以及酶,结构与功效,之间关系研究；,有机相中酶,反应研究；,酶,抑制剂、激活剂,开发及应用研究；,抗体酶、核酸酶,研究；,模拟酶、合成酶及酶分子,人工设计、合成研究。,酶工程制药专题知识,第12页,第二节 酶起源和生产,一、酶起源,早期酶生产是以动物、植物为主要原料，如从猪颌下腺中提取激肽释放酶，从菠萝中制取菠萝蛋白酶，从木瓜汁液中制取木瓜蛋白酶等。但伴随酶制剂应用范围日益扩充，单纯依赖动植物起源酶已不能满足要求，而且动、植物原料生长周期长、起源有限、受地理、气候、季节等原因影响，不适于大规模生产。,动植物组织和细胞培养；微生物,酶工程制药专题知识,第13页,利用微生物生产酶制剂，突出优点是：,微生物种类繁多，凡是动植物体内存在酶，几乎都能够从微生物中得到。,微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并能够经过控制培养条件来提升酶产量。,微生物含有较强适应性，经过各种遗传变异伎俩，能培育出高产菌株。,酶工程制药专题知识,第14页,二、酶生产菌（,1,）,对菌种要求,作为酶制剂生产菌应有特定要求：,产酶量高，酶性质应符合要求，而且是产生胞外酶菌；,不是致病菌、系统发育上与病源体无关、不产生毒素；,稳定性好，不易变异、退化、感染噬菌体；,能利用廉价原料，发酵周期短，易于培养。,酶工程制药专题知识,第15页,二、酶生产菌（,2,）,生产菌起源,生产菌种能够从菌种保藏机构和相关研究部门取得，但大量工作应该是从自然界中分离筛选。自然界是产酶菌种主要起源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。筛选产酶菌方法与其它发酵微生物筛选方法基础一致。,基因工程不停改良生产菌取得菌种,酶工程制药专题知识,第16页,二、酶生产菌（,3,）,当前常见产酶微生物,大肠杆菌,(,E,coli,),是应用最广泛产酶菌，普通分泌胞内酶，需经细胞破碎才能分离得到。,用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、,半乳糖苷酶等。,酶工程制药专题知识,第17页,二、酶生产菌（,4,）,枯草杆菌,：主要用于发酵生产,-,淀粉酶、,葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等。,啤酒酵母,：主要用于酿造啤酒、酒精、饮料和面包，生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶等。,曲霉,(,黑曲霉和黄曲霉,),：用于生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶等。,青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌,等用于生产对应酶。,酶工程制药专题知识,第18页,第三节 酶和细胞固定化,酶反应几乎都是在水溶液中进行，居于均相反应。均相酶反应系统中游离酶,只能一次性使用,，不但,造成酶浪费,，而且会增加产品,分离难度和费用,，影响产品质量，另外,溶液酶很不稳定,，轻易变性和失活。,假如能将酶制剂制成既能保持其原有催化活性、性能稳定、又不随水流动固定化状态，即固定化酶,(Immobilized enzyme),，可大大提升酶利用率,。,酶工程制药专题知识,第19页,一、固定化酶制备,固定化酶定义：,固定化酶,是指限制或固定于特定空间位置酶。是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，又能发挥催化作用酶制剂。,酶固定化,：,经过载体等将酶限制或固定于特定空间位置，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，又能发挥催化作用酶制剂过程。,酶工程制药专题知识,第20页,固定化酶特点,酶类可大致分为天然酶和修饰酶，,固定化酶属于修饰酶,。,固定化酶与天然酶相比，有以下,优点,：,可屡次使用，活性不变,反应后，酶与底物和产物易分开，产物,中无残留酶，易纯化，产品质量高。,反应条件易控制。,酶利用效率高。,比水溶性酶更适合于多酶反应。,酶工程制药专题知识,第21页,酶和细胞,固定化方法,酶和细胞固定化方法,载体结正当 交联法 包埋法,网格型 微囊型,物理吸附法 离子结正当 共价结正当 热处理（细胞）,酶工程制药专题知识,第22页,载体结正当,载体结正当将酶结合于不溶性载体上一个固定化方法。,物理吸附法：,用物理方法将酶吸附于,不溶性,载体上一个固定化方法。,无机栽体,：活性炭、多孔玻璃、酸性白土、氧化铝、硅胶、膨润土等；,天然高分子载体,：淀粉、谷蛋白等；,大孔型合成树脂、陶瓷等载体最近也已被应用；,另外含有疏水基载体,(,丁基或己基,-,葡聚糖凝胶,),，以及以单宁作为配基纤维素衍生物等可作为载体。,酶工程制药专题知识,第23页,物理吸附法优点、缺点,理吸附法,优点,：,操作简单，可选取不一样电荷和不一样形状载体，固定化与纯化可同时实现。酶失活后载体不变。,缺点,：最适吸附酶量无规律可循，不一样载体和不一样酶其吸附条件不一样，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，同时酶与载体之间结协力不强，易于脱落，造成酶活力下降并污染产物。,酶工程制药专题知识,第24页,离子结正当：,离子结正当,是酶经过离子键结合于含有离子交换基水不溶性载体上固定化方法。,载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，如,DEAE-,纤维素、,Amberlite CG-50,、,XE-97,、,IR-45,和,Dowex-50,等。,酶工程制药专题知识,第25页,离子结正当优缺点,优点,：操作简单，处理条件温和，酶高级结构和活性中心氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高固定化酶。,缺点,：载体和酶结协力比较弱，轻易受缓冲液种类或,pH,影响，在,离子强度,高条件下进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落现象。,酶工程制药专题知识,第26页,共价结正当,共价结正当,是酶以共价键结合于载体上固定化方法，也就是将酶分子上非活性部位功效团与载体表面反应基团进行共价结合方法。,当前研究最广泛、内容最丰富固定化方法，其原理是酶分子上,功效团,，如氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基等和载体表面反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在载体上。,酶工程制药专题知识,第27页,共价结正当优缺点,优点,：酶与载体结合牢靠，普通不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。,缺点,：与离子结正当和物理吸附法相比，反应条件苛刻，,操作复杂,，而且采取了比较强烈反应条件，会引发酶蛋白高级结构改变，破坏个别,活性中心,，所以往往不能得到比活高固定化酶，甚至酶底物专一性会发生改变。,酶工程制药专题知识,第28页,交联法,交联法,是用,双功效,或,多功效试剂,使酶与酶或微生物细胞与细胞之间彼此连接成,网络,结构而使酶固定化技术。,常见,交联剂,有戊二醛、双重氮联苯胺,-2,，,2-,二磺酸、,1,5-,二氟,-2,4-,二硝基苯及己二酰亚胺二甲酯等。,交联法与共价结正当一样也是利用,共价键,固定酶，所不一样是它能够,不使用载体,。,酶工程制药专题知识,第29页,交联法又可分为,4,种：,交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法、载体交联法,。,交联酶法,：向酶溶液中加入多功效试剂，在一定条件下形成固定化酶技术。反应速度与酶浓度、试剂浓度、,pH,、离子强度、温度及反应时间相关。如,0.2%,木瓜蛋白酶和,0.3%,戊二醛在,pH5.27.2,，,0,，,24h,完成反应。,酶与辅助蛋白交联法,：在酶溶液中加入辅助蛋白交联过程。辅助蛋白有：明胶、胶原、及动物血清白蛋白等。,酶工程制药专题知识,第30页,吸附交联法,：是吸附与交联相结合技术，其过程是先将酶吸附到载体上再与交联剂反应方法。,所得固定化酶称为壳状固定化酶。此法兼备吸附与交联双重优点，即提升固定化酶机械强度又提升酶与载体结合能力，酶分布于载体表面与底物接触良好。,载体交联法,：同一多功效试剂分子个别化学集团与载体偶联而另一个别化学基团与酶分子偶联方法。,酶工程制药专题知识,第31页,交联法特点,反应条件激烈，酶活回收较低。因为酶功效团，如氨基、酚基、羧基、巯基等参加了反应，会引发酶活性中心结构改变，造成酶活性下降。,改进方法,：在被交联酶溶液中添加一定量辅助蛋白如牛血清白蛋白，以提升固定化酶稳定性。,酶工程制药专题知识,第32页,最常见交联剂是戊二醛，它二个醛基与酶分子游离氨基反应形成,schiff,碱，彼此交联，其方式以下：,酶工程制药专题知识,第33页,包埋法,网格型包埋法,：,将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中称为网格型；,微囊化包埋法,：,将酶或细胞包埋在高分子半透膜中称为微囊型。,纤维包埋法,：,将可形成纤维高聚物溶于与水不混溶有机溶剂中，再与酶溶液混合与乳化，然后将乳化液经喷头挤入促凝剂（甲苯、石油醚）中形成纤维，可将酶纤维装成酶柱或织成酶布使用。,酶工程制药专题知识,第34页,包埋法优缺点,优点,：普通不需要酶蛋白氨基酸残基参加反应，极少改变酶高级结构，酶活回收率较高。,缺点,：化学聚合反应包埋酶轻易失活，所以必须合理设计反应条件。,适用范围,：小分子底物和产物酶，不适合大分子底物和产物酶。,酶工程制药专题知识,第35页,酶和细胞固定化模式,酶工程制药专题知识,第36页,选择性热变性法,此法专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理,使细胞膜蛋白变性,但,不使酶变性,而使酶固定于细胞内方法。,酶工程制药专题知识,第37页,酶和细胞固定化载体,对载体要求,:,固定化过程中不引发酶变性；,对酸碱有一定耐受性；,有一定机械强度；,有一定亲水性及良好稳定性；,有一定疏松网状结构，颗粒均匀；,共价结合时含有可活化基团；,有耐受酶和微生物细胞能力；,廉价易得。,酶工程制药专题知识,第38页,吸附载体,吸附法有,物理吸附,和,离子吸附,两种：,物理吸附,所用载体有,无机物,和,有机物,。,酶工程制药专题知识,第39页,包埋载体,:,当前，工业上应用包埋载体主要为,卡拉胶、海藻胶,等。,共价结合载体,:,用共价结正当制备固定化酶或细胞所用载体有,纤维素,、,Sephadex A200,、,琼脂,、,琼脂糖,、,苯胺多孔玻璃,等。,酶工程制药专题知识,第40页,酶工程制药专题知识,第41页,固定化酶制备技术,吸附法制备固定化酶技术,离子交换吸附法,是将解离状态酶溶液与离子交换剂混合后，洗去未吸附酶和杂质即得固定化酶。本方法中离子交换剂结合蛋白质能力较强。,影响载体吸附原因,:,溶液,pH,、离子强度、温度、蛋白质浓度及载体比表面积等。,酶工程制药专题知识,第42页,包埋法制备固定化酶技术,凝胶包埋法,是将酶或细胞限制于高聚物网格中技术；,微囊化法,是将酶或细胞定位于不一样构型膜外壳内技术。,纤维包埋法,酶工程制药专题知识,第43页,交联法制备固定化酶技术,交联酶法,是向酶液中加人多功效试剂，在一定条件下使酶分子内或分子间彼此连接成网络结构而形成固定化酶技术。反应速度与酶浓度、试剂浓度、,pH,、离子强度、温度和反应时间相关。,交联酶法,酶,辅助蛋白交联法,吸附交联法,载体交联法,酶工程制药专题知识,第44页,共价结正当制备固定化酶技术,共价结正当是经过酶分子非活性基团与载体表面活泼基团之间发生化学反应而形成共价键连接法。,共价结正当制备固定化酶,优点,:,酶与载体结合牢靠，稳定性好。,缺点,:,载体需要活化，固定化操作复杂，反应条件比较猛烈，酶轻易失活和产生空间位阻效应。,用于载体活化方法有：日前用于载体活化方法有酰基化、芳基化、烷基化及氨甲酰化等。,酶工程制药专题知识,第45页,二、固定化细胞制备,固定化细胞定义,将细胞限制或定位于特定空间位置方法称为细胞固定化技术。,被限制或定位于特定空间位置细胞称为固定化细胞。,细胞固定化技术是酶固定化技术发展，所以固定化细胞也称为第二代固定化酶。固定化细胞主要是利用细胞内酶和酶系，它应用比固定化酶更为普遍。已在医药、食品、化工、医疗诊疗、农业、分析、环境保护、能源开发及理论研究中广泛应用。,酶工程制药专题知识,第46页,固定化细胞特点,有细胞特征，生物催化剂功效和固相催化剂特点。,优点,：,无须进行酶分离纯化,保持酶原始状态，酶回收率高,细胞内酶比固定化酶稳定性高,细胞内酶附因子可自主再生,细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应,抗污染能力强,酶工程制药专题知识,第47页,固定化细胞制备技术,固定化细胞制备方法有载体结正当、包埋法、交联法及无载体法等。,载体结正当,是将细胞悬液直接与水不溶性,载体相结合固定化方法。,酶工程制药专题知识,第48页,包埋法,将细胞定位于凝胶网格内技术为包埋法。,这是固定化细胞中应用最多方法。常见载体有卡拉胶、聚乙烯醇、琼脂、明胶及海藻胶等。,酶工程制药专题知识,第49页,交联法,用多功效试剂对细胞进行交联固,定化方法。,无载体法,靠细胞本身絮凝作用制备固定,化细胞技术。,酶工程制药专题知识,第50页,三、固定化方法与载体选择依据,固定化方法选择,固定化酶应用安全性,尽管固定化生物催化剂比化学催化剂更为安全，但也需要按照药品和食品领域检验标推作出必要检验。,固定化酶在操作中稳定性,在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长久重复使用，在经济上有极强竞争力。,固定化成本,固定化成本包含酶、载体和试剂费用，也包含水、电、气、设备及劳务投资。,酶工程制药专题知识,第51页,载体选择,为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶及海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈纲碎屑等，也都是有应用前途载体。载体选择还应考虑底物性质等原因。,酶工程制药专题知识,第52页,固定化方法及其特征比较,酶工程制药专题知识,第53页,四、固定化酶形状与性质,固定化酶形状,颗粒状固定化酶,颗粒状固定化酶包含酶珠、酶块、酶片和酶粉等。,纤维状固定化酶,一些材料，如三醋酸纤维素，用适当溶剂溶解后与酶混合，再采取喷丝方法就可制成酶纤维。,酶工程制药专题知识,第54页,膜状固定化酶,膜状固定化酶也称为酶膜，能够经过共价结正当将酶偶联到滤膜上制备，也能够将酶和一些材料如火棉胶、硝酸纤维素、骨胶原和明胶等，用戊二醛交联或其它方法处理后制成膜状。,管状固定化酶,管状固定化酶称为酶管，一些管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺等，经活化后与酶偶联即得固定化酶管。,酶工程制药专题知识,第55页,固定化酶性质,天然酶经过固定化后即成为固定化酶，可能会造成酶学性质和酶活力改变。,酶活力改变,酶经过固定化后活力大都,下降,，其原因主要是酶活性中心主要氨基酸与载体发生了结合，酶空间结构发生了改变或酶与底物结合时存在空间位阻效应。,酶工程制药专题知识,第56页,酶稳定性改变,固定化酶稳定性包含对温度、,pH,、蛋白酶变性剂和抑制剂耐受程度。蛋白酶经过固定化后，限制了酶分子之间相互作用，阻止了其自溶，稳定性,显著增加,。,操作稳定性,贮藏稳定性,热稳定性,对蛋白酶稳定性,酶工程制药专题知识,第57页,操作稳定性,操作稳定性是能否实际应用关键原因。操作稳定性通常见半衰期表示，固定化酶活力下降为初活力二分之一时所经历连续操作时间称为半衰期。,固定化酶稳定性测定过程必须注明测定和处理条件，通常,半哀期到达,1,个月以上时，含有工业应用价值,。,酶工程制药专题知识,第58页,贮藏稳定性,酶经过固定化后最好马上投入使用，不然活力会逐步降低。若需长久贮存，可在贮存液中添加底物、产物、抑制剂和防腐剂等，并于低温下放置。,热稳定性,热稳定性高能够提升反应温度和反应速度，提升效率。许多酶如乳酸脱氢酶和脲酶等，,固定化后热稳定性均比游离酶高,。,酶工程制药专题知识,第59页,对蛋白酶稳定性,大多数天然酶经固定化后,对蛋白酶耐受力提升,，可能因为空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶颗粒内部。如用尼龙、聚丙烯酰胺凝胶包埋固定化天门冬酰胺酶对蛋白酶极为稳定，而在一样条件下游离酶几乎完全失活。所以，在工业生产中应用固定化酶是极为有利。,酶工程制药专题知识,第60页,酶学特征改变,底物专一性,：,酶经过固定化后，因为位阻效应，对高分子底物活性显著下降。,最适,pH,：,酶经固定化后，其反应最适,pH,可能发生改变，其改变与酶蛋白和载体带电性质相关。需要调整料液,pH,使固定化酶到达最大催化速度。,酶工程制药专题知识,第61页,最适温度,：,酶经过固定化后可能造成其空间结构更为稳定，大多数酶经固定化后，最适温度升高。,米氏常数（,K,m),：,K,m,值是表示酶和底物亲和力大小客观指标。天然酶经固定化后，其,K,m,值均发生改变，底物不一样增加幅度不一样。,最大反应速度（,V,m),：,大多数天然酶经固定化后，其,V,m,与天然酶相同或靠近，但固定化方法不一样也有差异，如多孔玻璃共价结合转化酶，其,V,m,与天然酶相同，但用聚丙烯酰胺包埋转化酶，,V,m,比天然酶小,10,。,酶工程制药专题知识,第62页,五、固定化细胞形状与性质,固定化细胞形状,因为细胞固定化技术是酶固定化技术延伸，许多方法都相同，所以许多固定化细胞形状与固定化酶形状相同，如珠状、块状、片状或纤维状等,酶工程制药专题知识,第63页,固定化细胞性质,细胞被固定化后，其中酶性质、稳定性、最适,pH,、最适温度和,K,m,值改变基础上,与固定化酶相仿,。细胞固定化主要是利用胞内酶，所以,固定化细胞主要用于催化小分子底物反应，而不适于大分子底物。,酶工程制药专题知识,第64页,六、评价固定化酶（细胞）指标,1,、固定化酶活力测定方法,酶活力,:,在单位时间内单位体积中,底物,降低许,或,产物,增加量来表示。,分批测定法,连续测定法,影响酶活力测定原因较多，如测定环境、,pH,、温度、离子强度、酶浓度、激活剂、振荡和搅拌速度以及固定化酶颗粒大小改变等均影响酶活力测定。,酶工程制药专题知识,第65页,2,、偶联率及相对活力测定方法,影响酶固有性质诸原因综合效应及固定化期间引发酶失活可用偶联率或相对活力来表示。固定化酶活力回收率是指固定化后固定化酶（细胞）所显示活力占被固定等当量游离酶（细胞）总活力百分数。,偶联率,=,（加入酶活力,-,上清液酶活力）,/,加入蛋白活力,100%,活力回收率,=,固定化酶总活力,/,加入酶总活力,100%,相对活力,=,固定化酶总活力,/,（加入酶总活力,-,上清液中未偶联酶活力）,100%,偶联率,=1,时，表示反应控制好，固定化或扩散限制引发酶失活不显著；偶联率,1,时，扩散限制对酶活力有影响；偶联率,1,时，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因,。,酶工程制药专题知识,第66页,第四节,固定化酶和固定化 细胞反应器,一、反应器类型和特点,间歇式搅拌罐反应器,用于游离酶反应后随即放料。,连续流动搅拌罐反应器,连续进料、连续出料,酶工程制药专题知识,第67页,填充床反应器,固定化酶填充于床层内。反应器内流体流动形态为平推流形。底物以恒定流速经过反应床。,流化床反应器,底物以足够大流速向上经过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，到达混合目标。,酶工程制药专题知识,第68页,循环反应器,个别反应液流出和新加入底物流入液混合，在进入反应床进行循环。,连续流动搅拌罐,-,超滤膜反应器,这是由连续流动搅拌罐反应器和超滤装置组合而成反应器。,其它反应器,酶工程制药专题知识,第69页,各种反应器示意图,a,、间歇式搅拌罐；,b,、连续流动搅拌罐；,c,、,b+,超滤膜；,d,、填充床；,e,、循环；,f,、流化床,酶工程制药专题知识,第70页,二、反应器选择依据,依据固定化酶形状,依据底物物理性质,依据反应动力学特征,依据外界环境对酶稳定性影响,依据操作要求及反应器费用,酶工程制药专题知识,第71页,第五节 酶工程在医药工业中应用,酶促反应专一性强,反应条件温和。,酶工程优点：,工艺简单、效率高、生产成本低、,环境污染小、产品收率高、纯度好。还可制造出化学法无法生产产品。,酶工程制药专题知识,第72页,1,、固定化细胞法生产,6-,氨基青霉烷酸,(6-APA),技术路线,E.,Coli,斜面 细胞 固定化细胞,青霉素,G,转化液 滤液,6-APA,粗品,2,、固定化酶法生产,5,-,复合单核苷酸,3,、固定化酶法生产,L-,氨基酸,培养,固定,转化,过滤,抽提,酶工程制药专题知识,第73页,青霉素酰化酶转化流程图,酶工程制药专题知识,第74页,第六节 酶工程研究进展,一、酶化学修饰,二、酶人工模拟,三、有机相酶反应,四、基因工程酶构建,酶工程制药专题知识,第75页,一、酶化学修饰,酶化学修饰目标和意义,提升酶稳定性、消除酶抗原性、改变酶学性质,(,最适,pH,、最适温度、,K,M,值、催化活性和专一性等,),、扩充酶应用范围等研究越来越引发大家重视。,酶工程制药专题知识,第76页,常见化学修饰剂,对化学修饰剂要求,普通情况下，要求修饰剂含有较大相对分子质量，良好生物相容性和水溶性，分子表面有较多反应活性基团及修饰后酶活半衰期较长。,常见化学修饰剂,糖及糖衍生物：主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚搪凝胶、聚乳糖等。,高分子多聚物：主要是聚乙二醇,(PEG),、聚乙烯醇（,PVA,）、聚,N,乙烯吡咯烷酮,(PVP,）等。,生物大分子：常见有肝素、血浆蛋白质、聚氨基酸类等。,双功效试剂：主要有戊二醛、二异硫氰酸、二胺类等。,其它：常见修饰剂还有一些固定化酶载体、糖基化试剂、甲基化试剂、乙基化试剂及一些小分子有机物等。,酶工程制药专题知识,第77页,化学修饰办法,酶化学修饰方法有很多，但基础标准都是充分利用修饰剂所含有各类化学基团特征，直接或经过一定活化过程与酶分子中一些基团或辅因子产生化学反应对酶分子结构进行改造。,修饰酶功效基团,酶分子内或分子间进行交联,修饰酶辅因子,酶与高分子化合物相结合,酶工程制药专题知识,第78页,修饰酶特征,酶分子经过化学修饰后，其特征在一定程度上发生改变，天然酶一些不足之处能够得到改进。,热稳定性提升,抗各类失活因子能力提升,抗原性消除,酶工程制药专题知识,第79页,体内半衰期延长,最适,pH,改变,酶学性质改变,K,m,，底物专一性,对组织分布能力改变,-,葡萄糖苷酶经白蛋白修饰后，有利于肝细胞对其摄入，使更多酶抵达靶器官发挥作用。辣根过氧化物酶用聚赖氨酸修饰后，细胞摄入量增加，对细胞穿透能力能增加,100,倍。,酶工程制药专题知识,第80页,酶化学修饰前景,化学修饰能够改变天然酶各种活,性，扩充酶应用范围。化学修饰,法是改造酶分子有效方法，而,且已经有了一定规律性和普遍性，,含有广泛应用前景。,酶工程制药专题知识,第81页,二、酶人工模拟,依据酶作用原理，用人工方法合成含有活性中心和催化作用,非蛋白质结构,化合物叫,人工模拟酶,(Enzyme of artificial imitation),，简称,人工酶,或,模拟酶,。,1,模拟酶分类,（,1,）依据,Kirby,分类法,，模拟酶可分为：单纯酶模型，即以化学方法经过天然酶活性模拟来重建和改造酶活性。机制酶模型，即经过对酶作用机制诸如识别、结合和过分态稳定化认识，来指导酶模型设计和生产。单纯合成酶样化合物，即一些化学合成含有催化活性简单分子。,酶工程制药专题知识,第82页,（,2,）按照模拟酶属性分类,按照,模拟酶属性,可分为：,主,-,客体酶模型，包含环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等。,胶束模拟酶（模拟水解酶胶束酶模型、辅酶胶束酶模型、金属胶束酶模型）。,肽酶。,模拟天然酶活性部位而人工合成含有催化活性多肽。,半合成酶。,以天然酶为母体，用化学方法或基因工程方法引进适当活性部位或催化基团，从而形成一个新人工酶。,分子印迹酶。,酶工程制药专题知识,第83页,主要人工模拟酶介绍,1,模拟酶,环糊精,模拟酶工作研究较多是环糊精,(cyclodextrin),。它是一个优良模拟酶，可提供一个疏水结合部位并能与一些无机和有机分子形成包接络合物，以此影响和催化一些反应。,酶工程制药专题知识,第84页,-,环糊精分子结构,酶工程制药专题知识,第85页,2,分子印迹,分子印迹,(molecular imprinting),是指制备对某一特定分子含有选择性聚合物过程，该特定分子称为印迹分子或模板。,制备过程：,选定印迹分子和功效单体，让它们之间发生互补作用，形成印迹,功效单体复合物；,用交联剂在印迹分子,功效单体复合物周围发生聚合反应，形成交联聚合物；,从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子含有选择性聚合物,(,下列图,),。,酶工程制药专题知识,第86页,分子印迹示意图,酶工程制药专题知识,第87页,分子印迹应用范围,分子印迹聚合物可作为裁剪分离物质材料，也能够分离大分子物质,(,生物印迹,),。,在酶技术和有机合成中，分子印迹聚合物可作为模拟抗体、模拟酶或含有催化活性聚合物。,分子印迹聚合物还可在生物传感器构建中作为传感器，这种聚合物可作为通常使用生物材料替换物。,酶工程制药专题知识,第88页,三、有机相酶反应,传统观念认为，生物体内含有催化作用蛋白质,酶只能在水溶液中发挥作用，而一旦和有机溶剂接触则失去催化活性。直到,20,世纪,80,年代中期，,A,M,Klibanov,等人将酶引人到非水介质中进行催化反应，为酶在医药、精细化工、材料科学等领域应用开辟了辽阔前景。,有机相酶反应,是指酶在含有有机溶剂存在介质中所进行催化反应。,酶工程制药专题知识,第89页,1,、有机相酶反应优点,有机相中酶催化反应除了含有酶在水中反应所含有特点外，还含有其独特优点：,增加疏水性底物或产物溶解度；,热力学平衡向合成方向移动；,可抑制有水参加副反应发生；,酶不溶于有机介质，易于回收再利用；,轻易从低沸点溶剂中分离纯化产物；,酶热稳定性提升，,pH,适应性扩充；,无微生物污染；,能测定一些在水介质中不能测定常数；,固定化酶方法简单，能够只沉积在载体表面。,酶工程制药专题知识,第90页,2,、有机相酶反应溶剂体系,按照溶剂体系组成和特点，当前有机相酶反应主要有,4,种溶剂体系。,(1),水,水溶性溶剂均相体系,常见水溶性有机溶剂有乙醇、丙酮、二氧六环、甘油等。,(2),水,水不溶性溶剂两相体系,常见有机溶剂有三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚等。,酶工程制药专题知识,第91页,(3),反相胶团,(,束,),体系,它使酶维持在类似细胞环境中，酶构象有利于其活性表示，所以酶在反相胶团中活力普通都有所提升。,(4),单相有机溶剂体系,在该体系中，只含极微量水，以维持催化反应所必需构象。所用有机溶剂有正已烷、苯、环已烷等。,酶工程制药专题知识,第92页,3,、有机相酶工程,(1),酶固定化,(2),酶化学修饰和表面活性剂包埋,有机相酶反应应用范围很广，如脂肪酶催化不对称合成反应，制备含有光学活性醇、脂肪酸及其酯、内酯等医药、农药和人体代谢过程中间体；利用脂肪酶催化合成和酯交换等反应，合成抗生素和香料等大环内酯，改良油脂，合成有医用价值糖酯、固醇酯和多肽等。,酶工程制药专题知识,第93页,四、基因工程酶构建,基因工程酶是酶学和以基因重组技术为主当代分子生物学相结合产物。,主要包含,3,个方面,：,酶基因克隆和表示，用基因工程菌大量生产酶；,修饰酶基因和产生遗传修饰酶,(,突变酶,),；,酶遗传设计，合成自然界没有新酶。,酶工程制药专题知识,第94页,第五章 酶工程制药思索题,1,、酶概念、特点及酶工程所包含内容是什么？,2,、酶起源和主要生产方法有哪些？,3,、当前使用商品酶大多数都是利用微生物生产，为何？,4,、对产酶菌种特定要求是什么？,5,、固定化酶特点是什么？,6,、酶和细胞固定化方法有哪些？,酶工程制药专题知识,第95页,7,、,固定化酶性质是什么？,8,、固定化细胞优点是什么？,9,、,列出固定化细胞法生产,6-,氨基青霉烷酸技术路线,10,、,叙述分子印迹制作过程,11,、,有机相酶反应优点是什么？,酶工程制药专题知识,第96页,