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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢。本资料仅供参考，不能作为科学依据。,6,蛋白质分子结构,多肽链氨基酸序列决定了蛋白质高级结构，决定了,蛋白质生物学功效。,组成蛋白质22种氨基酸，侧链基团理化性质和空间排布各不相同，当它们按照不一样序列关系组合时，形成各种多样空间结构和生物学活性蛋白质分子。,1/104,蛋白质结构分为：,一级结构、二级结构、三级结构、四级结构。,在二、三级结构间划分出超二级结构和结构域。,2/104,3/104,蛋白质一、二、三、四级结构,4/104,6.,1 蛋白质一级结构,蛋白质一级结构是指蛋白质中氨基酸排列次序。,5/104,1953年英国Sanger等人，完成了牛胰岛素(Isulin)一级结构测定工作，分子量为5700D，有A链(21AA)和B链(30AA)两条肽链，两个链间有二硫键和一个链内二硫键(A链)。,6/104,1960年Stanford Moore等完成了牛胰核糖核酸酶(RNase)分析。,RNase由一条含124个氨基酸残基多肽链组成，,分子内含有4个链内二硫键，分子量为12600。,RNase是水解核糖核酸磷酸二酯键酶。,7/104,8/104,蛋白质一级结构测定,1、,测定其分子量，拆开二硫键，确定肽链数目；,2、,氨基酸组成份析；,3、,肽链末端氨基酸测定,4、,专一性部分裂解；,5、,肽片段分离纯化；,6、,各片段氨基酸次序测定；,7、,片段重合，拼出完整肽链氨基酸次序；,8、,确定二硫键和酰胺基位置。,9/104,6.2,蛋白质二级结构,(secondary structure),蛋白质二级结构：肽链主链不一样肽段经过,本身相互作用、形成氢键，沿某一主轴,盘旋折叠而形成局部空间结构，是蛋白,质结构构象单元。,蛋白质二级结构包含：,-螺旋、,-折叠、,-转角、无规则卷曲,10/104,6.2.1,多肽链折叠空间限制,肽平面(peptide plane),肽键 形式上是单键,含有部分双键性质，因而不能旋转。,肽键C及N周围三个键角之和均为360，使肽键四个原子和与之相连两个,碳原子(C,)都处于同一个刚性平面肽平面。,11/104,肽链中只有碳原子形成单键能够旋转，决定两个肽键平面位置关系。,肽键平面成为肽链盘波折叠基本单位。,12/104,6.2.2,二级结构基本类型,13/104,-螺旋结构（,-helix）,1950年Pauling和Corey对-角蛋白(-keratin)进行X线衍射分析，从衍射图中看到有0.50.55nm重复单位，故推测蛋白质分子中有重复性结构，认为这种重复性结构为-螺旋。,天然蛋白质绝大多数为右手,-,螺旋。,6.2.2,二级结构基本类型,14/104,蛋白质-螺旋结构特点,是蛋白质一个二级结构,其,骨架,：为,N-C-C,重复单位组成一条,右旋,肽链,直径：5,（0.5nm）,螺圈：每3.6个氨基酸螺旋上升一圈,螺距：5.4,（0.54 nm),氨基酸间相距5.4,/3.6=1.5,（0.15nm）,，,且沿中轴旋转,100,靠主链内氢键维持其结构稳定性,-螺旋中氨基酸侧链,R分布,在螺旋外侧，其形状、大小及,电荷影响-螺旋形成。,15/104,多个肽平面经过-碳,原子旋转，相互紧密盘曲成规则周期性构象，即右手螺旋。,主链呈螺旋上升，每,3.6,个氨基酸残基上升一圈，螺,距,0.54nm,，每个,Aa残基,沿轴上升,0.15nm,。,16/104,17/104,右手型-螺旋,18/104,影响-螺旋形成原因：,酸性或碱性氨基酸集中区域，同电荷相斥;,较大,R(如Phe、Trp、Ile,)集中区域;,Pro,亚氨基酸,不易形成氢键;,C,位于五元环上,不易扭转;,Gly,R基为H，空间占位很小，也会影响该处螺旋稳定,。,19/104,折叠结构（,pleated）,Astbury等人曾对-角蛋白进行X线衍射分析，发觉含有0.7nm重复单位。,如将毛发-角蛋白在湿热条件下拉伸，可拉长到原长二倍，这种-螺旋X线衍射图可改变为与-角蛋白类似衍射图。说明-角蛋白中结构和-螺旋拉长伸展后结构相同。,20/104,折叠也称-片层（,pleated sheet）,conformation)是由两条或多条几乎完全伸展多肽链侧向经过氢键连接在一起，相邻两肽链以,相同,或,相反,方向平行排列成片状。,21/104,肽链处于相当伸展结构，肽链平面之间折叠成锯齿状，相邻肽键平面间呈110角。每个Aa残基伸展长度为,0.3,5,，AA残基R侧链伸出在锯齿上方或下方。,依靠两条肽链或一条肽链内两段肽链间C=O与另一条-NH基之间形成氢键，使构象稳定。,两段肽链能够是平行或是反平行。,平行-片层结构中，,重复距离为,0.65nm；,反平行-片层结构，则间距为,0.7nm。,-片层结构特点：,22/104,转角（,turn）,也称,弯曲(,bend)、回折(reverse turn)。是指,肽链出现180回折，由弯曲处,第一个,AA,残基,-C=O,与,第四个,AA,残基,-NH,间形成氢键,(4,1氢键),产生一个不很稳定环形结构。,XNH ：OC,(,X3,),23/104,24/104,无规卷曲,没有确定规律性部分肽链构象，肽链中肽键平面不规则排列,属于涣散无规卷曲(random coil).,25/104,已知某分子量为 240000 蛋白质多肽链一些节段是-螺旋，而另一些节段是-折叠，其分子长度为 5.06 10,-5,cm，求分子-螺旋和-折叠百分率。,例题：,26/104,普通来讲氨基酸残基平均相对分子质量为 120，此蛋白质相对分子量为 240000，所以氨基酸残基数为 240000/120=个。,已知-螺旋中，每个氨基酸残基上升高度为 0.15nm，-折叠构象中，每个氨基酸残基上升高度为 0.3,5,nm，设此链中-螺旋氨基酸残基数为 x，而-折叠氨基酸残基数为-x，则有：,0.15x+0.3,5,(-x)=5.06 10,-5,10,7,0.15x+7,0,0-0.3,5,x=50,6,求得 x=,970,所以-螺旋占百分数为,：970,100%,48.5%,则-折叠百分率为,51.5,%。,27/104,6.2.3,超二级结构和结构域,超二级结构和结构域都是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间一个层次。,超二级结构(super-secondary structure),超二级结构是多肽链内次序上相互邻近若干二级结构单元常在空间折叠中靠近，相互作用形成规则结构组合体(combination)，充当三级结构构件。,28/104,由二段或三段右手,-螺旋彼此缠绕而成左手,超螺旋(superhelix)，存在于,-角蛋白、肌球,蛋白和纤维蛋白中。,由两段或三段平行,折叠链（单股链）和一段连结链组成，连结链为,-螺旋或无规则卷曲。,最常见,组合是由三段平行式,折叠链和二段,-螺旋链组成，称为Rossmann折叠。,是由几段平行,折叠链连结而成。,己知超二级结构有3种基本组合形式：,29/104,30/104,结构域(domain),在较大球状蛋白质分子中，因为多肽链上相邻超二级结构紧密联络，形成几个紧密球状构象.彼此以涣散肽链相连球状构象。,每个结构域普通约由100-200个,AA,残基组成，各有独特构象，并负担不一样生物学功效。,结构域是多肽链折叠单位，多肽链折叠最终一步是结构域缔合。,31/104,免疫球蛋白(IgG)由12个结构域组成，其中两个轻链上各有2个，两个重链上各有4个；补体结合部位与抗原结合部位处于不一样结构域。,32/104,6.2.4,蛋白质三级结构（tertiary structure),蛋白质三级结构是多肽链在各种二级结构基础上，经过侧链基团相互作用，借助次级键维系，深入盘绕折叠形成含有一定规律三维空间结构.,33/104,稳定蛋白质三级结构主要是次级键:,氢键、疏水键、盐键、范德华力,这些次级键存在于一级结构序号相隔很远氨基酸残基R基团之间，所以蛋白质三级结构主要指氨基酸残基侧链间结合。,三级结构是由多肽链,AA,次序决定。,34/104,35/104,次级键都是,非共价键,易受环境中pH、温度、离子强度等影响，有变动可能性。,二硫键不属于次级键,，但在一些肽链中能使远隔二个肽段联络在一起，对于蛋白质三级结构稳定上起着主要作用。,36/104,蛋白质三级结构,是指蛋白质分子主链折叠盘曲形成构象基础上，分子中各个侧链所形成一定构象.,侧链构象主要是形成,结构域,。球状蛋白质很多亲水侧链形成,亲水区,，主要分布在蛋白质分子表面；,由疏水侧链集中组成,疏水区,，多在分子内部，疏水区常形成一些“洞穴”或“口袋”，一些辅基就镶嵌其中,成为,活性部位,。,37/104,6.2.5,蛋白质四级结构(quaternary structure),含有三级结构几条多肽链经过次级键相互组合而形成特定构象称为蛋白质四级结构。,(寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上相互关系或结合方式)。,38/104,亚基,(subunit、单体)：四级结构蛋白质中每一个含有独立三级结构多肽链称为亚基(subunit)或亚单位、,单体,(monomer),。,四级结构是指亚基立体排布、相互作用及接触部位布局。亚基之间,不含共价键,，在一定条件下，四级结构蛋白质可分离为其组成亚基，而亚基本身构象仍可不变。,亚基单独存在时,无,生物活性，只有聚合成特定四级结构才含有完整生物活性。,39/104,蛋白质中亚基结构可相同，也可不一样。,烟草斑纹病毒外壳蛋白是由2200个相同亚基形成多聚体；正常人血红蛋白A是2个亚基与2个亚基形成四聚体。,单体蛋白质,（monomer protein）：无四级结构蛋白质称单体蛋白，如：溶菌酶、肌红蛋白等。,寡聚蛋白质,（multimeric protein）：由两个或多个亚基组成蛋白质称寡聚蛋白（多体蛋白），如：血红蛋白。,40/104,原体,（protomer）：寡聚蛋白质中同等结组成份。,如,血红蛋白,是由两个原体组成对称二体，其中每个原体是由,亚基(一条,珠蛋白链)和,亚基(一条,珠蛋白链)所组成聚集体(,)。,假如把原体看成单体，血红蛋白为二体。假如亚基为单体，血红蛋白则为四体。,41/104,42/104,一些蛋白质分子可深入聚合成聚合体(polymer)。聚合体中重复单位称为亚基或单体(monomer)。,聚合体可按其中所含单体数量不一样而分为二聚体、三聚体寡聚体(oligomer)和多聚体(polymer).,胰岛素(insulin)在体内可形成二聚体及六聚体。,43/104,球状蛋白质三维结构形成：,多肽链主链首先折叠成一系列二级结构，相邻构象单元随即组合成规则超二级结构，若干超二级结构深入盘旋产生结构域，两个或多个结构域形成含有独立三级结构亚基，若干亚基组装成含有特定四级结构寡聚体。,多肽链,二级结构,超二级结构,结构域,亚基,寡聚体,44/104,氨基酸次序异构现象是蛋白质生物功效多样性和种属特异性结构基础。一个由20种氨基酸组成20肽，有210,18,种次序异构体。,蛋白质一级结构是空间结构基础，特定构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成次级键来维持，蛋白质多肽链在体内被合成后，可依据一级结构特点自然折叠和盘曲，形成一定构象。,7.,1 蛋白质一级结构与生物功效关系,7,蛋白质结构与功效关系,45/104,一级结构相同蛋白质，其基本构象及功效也相同。,胰岛素分子中氨基酸残基差异部分,46/104,同源蛋白质(homologous protein)种属差异与生物进化,同源蛋白质氨基酸次序中有许多位置氨基酸对全部种属是相同，被称为不变残基(invariant residue);,而其它位置氨基酸对不一样种属却有相当大改变，则被称为可变残基(variable residue)；,同源蛋白质氨基酸次序中这么相同性称为次序同源(sequence homology)。,7.1.,1 一级结构种属差异与分子进化,同源蛋白质是指在不一样有机体中实现同一功效蛋白质。,47/104,不一样种属起源细胞色素c(cytochrome c)中，能够变换氨基酸残基数目与这些种属在系统发生上位置有亲密关系。,在进化位置上相距愈远,则氨基酸次序之间差异愈大。,48/104,CytC分子中Aa残基差异数目及分歧时间,49/104,7.,1.2 一级结构变异与分子病,在蛋白质一级结构中，参加功效活性部位,AA,残基或处于特定构象关键部位,AA,残基，即使在整个分子中发生一个残基异常，该蛋白质功效也会受到显著影响。,镰刀状红细胞性贫血被称之为“分子病”,仅仅是因为574个,AA,残基中，1个,AA,残基改变造成。,50/104,51/104,血红蛋白亚基N端第6号氨基酸残基发生了变异，它变异起源于基因上遗传信息突变。,52/104,核糖核酸酶S有124个,AA,残基,多肽链中有4对S-S维持其三级结构，用大量巯基乙醇和适量尿素还原4对S-S，酶活力全部丧失。,若将尿素和巯基乙醇除去,在有氧条件下使S-S迟缓氧化成二硫键，酶活力水平可靠近于天然酶。,蛋白质功效取决于特定天然构象,决定构象所需信息包含在其,AA,序列中。,蛋白质一级结构决定了二、三级结构，一级结构可自动地发展到二、三级结构。,7.,2 蛋白质空间结构与功效关系,1.以核糖核酸酶S为例来说明构象与功效关系,53/104,54/104,2.,以肌红蛋白和血红蛋白为例说明蛋白质空间结构和功效关系,肌红蛋白（Mb）和血红蛋白(Hb),结构相同性,决定了功效相同性,。,肌红蛋白与血红蛋白都能与氧结合，因为它们以血红素为辅基，而且在血红素周围以疏水性氨基酸残基为主，形成空穴，为铁原子与氧结合创造了结构环境。,肌红蛋白（Mb）和血红蛋白(Hb),结构差异性,决定了功效不一样,；,肌红蛋白为,单肽链,蛋白质，而血红蛋白是由,四个亚基组成寡聚蛋白,，这么空间结构差异决定了它们之间功效各自特征。,55/104,56/104,肌红蛋白,主要功效是,储存氧,。其三级结构折叠方式使辅基血红素对环境中O2浓度改变非常敏感，当环境中O2分压高时，Mb与O2结合能力极高，起到对O2储存功效；当环境中O2分压低时，Mb与O2结合能力大大降低，对外释放O2，为环境提供O2供机体所需。,血红蛋白,主要功,能,是,在循环中转运氧,。Hb由4个亚基组成四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧，共结合4分子氧。Hb各亚基三级结构与Mb极为相同，也有可逆结合氧分子能力，但Hb各亚基与氧结合存在着,正协同效应。,57/104,血红蛋白构象改变与运氧功效,变构效应（allosteric effect）：,当血红蛋白一个亚基与氧分子结合以后，可引发其它亚基构象发生改变，对氧亲和力增加，从而造成整个分子氧结协力快速增高，使血红蛋白氧饱和曲线呈“S”形(图2-11 )。这种因为蛋白质分子构象改变而造成蛋白质分子功效发生改变现象称为,变构效应。,引发变构效应小分子称变构效应剂。变构效应在细胞蛋白与酶功效调整中有普遍意义。,协同效应(cooperativity)：,一个亚基与其配体（Hb中配体为O2）结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体结合能力，称为协同效应。假如是促进作用则称为正协同效应（positive cooperativity）；反之则为负协同效应（negative cooperativity）。,58/104,蛋白构象疾病：,错误构象相互聚集，形成抗蛋白水解酶淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。,老年痴呆,疯牛病,亨汀顿舞蹈病,59/104,（二级结构及其它改变）,正常动物PrP,c,（,二级结构多为螺旋、对蛋白酶敏感、水溶性,）,致病蛋白PrP,sc,（一级结构相同，但二级结构全为折叠，抗蛋白酶、水溶性差、蛋白聚集成淀粉样沉淀）,未知蛋白,60/104,正常蛋白PrPc,和可致疯牛病蛋白,PrPsc,一级结构相同，只存在空间构象差异,61/104,8.,蛋白质主要性质,蛋白质是由氨基酸组成大分子化合物，其部分理化性质与氨基酸相同：,两性电离,、,等电点,、,呈色反应,、,成盐反应,；,蛋白质同时又含有,胶体性,和,变性,与,复性,等性质。,62/104,8.,1 蛋白质相对分子质量和测定方法,蛋白,相对分子质量普通在10,4,-10,6,.其相对分子质量可依据其化学组成测定或者利用蛋白质一些理化性质来测定.,63/104,沉降速度法,将蛋白质溶液放在超速离心机中进行超速离心。因为超出重力几十万倍离心力作用，而使蛋白质分子沉降下来。大小和形状都相同蛋白质分子下沉速度相同，在离心管中产生一个显著界面，利用光学系统能够观察到此界面移动，从而测得蛋白沉降速度。,一个颗粒在单位离心力场中沉降速率为恒定值,称为沉降系数(sedimentation coefficient),用s表示.,64/104,凝胶过滤法,在层析柱中装入葡聚糖凝胶颗粒。这种凝胶颗粒含有多孔网状结构。这些网孔只允许较小分子进入颗粒内，而大于网孔分子则被排阻。,当用洗脱液洗脱时，被排阻相对分子质量大分子先被洗脱下来,相对分子质量小分子后下来。,65/104,66/104,67/104,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳速度，决定于蛋白分子大小,形状和电荷数量。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳速度，则决定于蛋白质分子大小。,SDS(十二烷基硫酸钠)是一个去垢剂,可与蛋白质结合,使其变性并带上大量负电荷，解离成亚基，同时变成棒状,从而掩盖了蛋白质原有电荷和形状差异.蛋白质电泳速度只决定于蛋白质相对分子质量大小.,68/104,LPA,重组蛋白纯化及,Western-blot,检测,1,2,3,4,1:LPA,包涵体重组蛋白表示产物,2:,低分子量标准蛋白,3:,对照,4:,纯化后蛋白,27.1kDa,1:LPA,重组蛋白,Western-blot,检测,69/104,SDS-凝胶电泳时，蛋白质分子,相对迁移率,与蛋白质,相对分子质量,对数成直线关系。,用几个标准蛋白质相对分子质量对数对对应相对迁移率作图,得到,标准曲线,。依据测得样品相对迁移率,从标准曲线上能够查出样品相对分子质量.,70/104,71/104,8.,2 蛋白质胶体性质,蛋白质分子量很大，普通在10000-1000000之间，在水溶液中分子直径在1-100nm之间，含有胶体溶液性质，如不能经过半透膜、有电泳现象等。,所以可用,透析和电泳,方法来分离、纯化蛋白质。,72/104,维特蛋白质胶体稳定性原因,水化层：,球状蛋白质表面多亲水基团(-COOH、-OH、-SH、-CONH,2,等）,含有强烈地吸引水分子作用,在水溶液中蛋白质颗粒表面形成一层很厚水化膜，从而阻止蛋白质颗粒相互聚集。,同性电荷:,在非等电点时蛋白颗粒带有同性电荷,相互排斥。,73/104,蛋白质含有许多游离氨基,羧基,咪唑基,胍基,巯基、酚基等,所以与,AA,一样，也是两性电解质。,当溶液在某一pH值时,蛋白质所带正负电荷相等,净电荷为零,此时溶液pH称,该蛋白质等电点pI,。,8,.3 蛋白质两性电离及等电点,74/104,75/104,蛋白质在等电点时,因没有同性电荷排斥,最不稳定，,溶解度最小,极易借静电引力结合成较在聚集体,沉淀出来（分离提纯蛋白质方法）。,电泳:,带电质点在电场中向电荷相反电极泳动现象。,电泳方法是试验室、生产、临床诊疗等惯用来分离,蛋白质和判定蛋白质纯度伎俩。,76/104,8.,4 蛋白质变性作用,天然蛋白质因受物理及化学原因影响，使其分子原有天然构象发生改变（次级键破坏）,造成理化性质和生物活性发生改变,称为,变性(denaturation)。,变性蛋白质只有空间构象破坏，蛋白质变性本质是,次级键，二硫键破坏，并不包括一级结构改变。,77/104,蛋白质变性与复性,去除部分变性剂,温和复性,温和复性,天然蛋白,（含有正确一级结构和高级结构，所以含有生物活性）,变性蛋白,（含有正确一级结构但无高级结构，无生物活性）,变性环境,非天然蛋白,（含有正确一级结构和错误高级结构，无生物活性）,【经典举例】Rnase,78/104,引发蛋白质发生变性原因,化学原因：,强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)、苦味酸、浓乙醇等。,物理原因：,加热(70-100)、加压、脱水、猛烈振荡或搅拌,紫外线,X-射线照射,超声波,高压处理等。,变性原因常被应用于消毒及灭菌；保留蛋白质制剂时应注意预防蛋白质变性。,79/104,生物活性丧失；,包藏在分子内部侧链基团暴露；,理化性质改变:变性后疏水基外露,溶解度降低形成沉淀。但在碱性溶液中或有变性剂存在时不沉淀，除去变性剂后则沉淀。球状蛋白质在变性后，分子伸展不对称程度增加，粘度加大，扩散系数降低；,生化性质改变:蛋白质变性后分子结构伸展涣散，所以变性蛋白质比天然蛋白质更易受蛋白酶作用，这就是熟食易于消化道理。,变性蛋白质特点：,80/104,复性,(renaturation),：,当变性原因去除后，有些,变性蛋白质又可迟缓重新回复到天然构象。,核糖核酸酶S在,-巯基乙醇,和,8M尿素,作用下发生变性，经过透析去除尿素和-巯基乙醇，酶蛋白又可恢复其原来构象，生物学活性也几乎全部恢复。,许多蛋白质变性时被破坏严重，天然构象不能恢复，,称为,不可逆性变性。,81/104,8,.5 蛋白质沉淀反应,破坏蛋白质溶液稳定性，蛋白质就会凝聚成大质点,而从溶液中析出现象,称为蛋白质沉淀(precipitation)。,稳定蛋白质亲水胶体原因是颗粒表面,水化层,和,电荷。,若除掉这两个稳定原因（如调整溶液pH至等电点和加入脱水剂），蛋白质便轻易凝集析出。,高浓度中性盐、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂等都可引发蛋白质沉淀。,82/104,中性盐,加入高浓度中性盐（NH,4,2,SO,4,Na,2,SO,3,NaCl等），,可有效破坏蛋白质颗粒水化层,同时又中和了,蛋白质电荷,使蛋白质产生沉淀。,加盐使蛋白质沉淀析出现象称为,盐析,(salting out).,盐析法是最惯用分离蛋白质方法。,83/104,盐溶（salting in）,：低浓度中性盐可增加蛋白质溶解度。因为蛋白质分子吸附一些盐类离子后，带电表层使蛋白质分子相互排斥，而蛋白质分子与水分子相互作用加强，所以溶解度提升。,盐析（salting out）,：在蛋白质溶液中加入大量中性盐以破坏蛋白质胶体稳定性而使其析出。,盐溶与盐析,84/104,加入大量中性盐,使水活度降低,原来溶液中大部分自由水转变为盐离子水化水,从而降低蛋白质极性基团与水分子间相互作用,破坏了蛋白质分子表面水化层,同时又中和了蛋白质电荷,使蛋白质沉淀.,85/104,惯用中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需盐浓度及pH不一样，故可用于对混和蛋白质组分分离。,用半饱和硫酸铵来沉淀出血清中球蛋白，饱和硫酸铵能够使血清中白蛋白,球蛋白都沉淀出来.,盐析沉淀蛋白质，经透析除盐，仍确保蛋白质活性。可调整蛋白质溶液pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀效果更加好。,86/104,有机溶剂沉淀蛋白质,可与水混合有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒水化膜，使蛋白质颗粒轻易凝集而沉淀。,调整蛋白质溶液至等电点时，加入有机溶剂可加速蛋白质沉淀。,常温下有机溶剂沉淀蛋白质往往引发变性。在低温条件下,则变性进行较迟缓,可用于分离制备蛋白质.,87/104,重金属盐沉淀蛋白质,当溶液pH值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它易与重金属离子（Hg,2+,、Pb,2+,、Cu,2+,、Ag,+,）结合成不溶性盐而沉淀。,重金属沉淀蛋白质常是变性，误食重金属盐后可大量饮用,牛奶或豆浆,等蛋白质，然后用催吐剂将结合重金属盐呕吐出来解毒。,若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性蛋白质。,88/104,生物碱试剂和一些酸类沉淀蛋白质,pHpI 时蛋白质带正电荷,易与带负电(酸根阴离子)生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及一些酸(如三氯醋酸,过氯酸,硝酸)生成不溶性盐而沉淀.,血液化学分析时常利用此原理除去血液中蛋白质,这类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。,89/104,加热凝固(coagulation),将靠近于等电点蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。,加热使蛋白质变性，有规则肽链结构被打开呈涣散状不规则结构，分子不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状蛋白块。,煮熟鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。,90/104,蛋白质变性,沉淀,凝固相互之间有很亲密关系。但蛋白质变性后并不一定沉淀,变性蛋白质只在等电点附近才沉淀,沉淀变性蛋白质也不一定凝固.,蛋白质被强酸、强碱变性后因为蛋白质颗粒带着大量电荷，故仍可溶于强酸或强碱之中。但若将强碱和强酸溶液pH调整到等电点，则变性蛋白质凝集成絮状沉淀物,若将此絮状物加热,则分子间相互盘缠而变成较为坚固凝块。,91/104,8.,6 蛋白质颜色反应,茚三酮反应,双缩脲反应,米伦反应,蛋白质黄色反应,Folin-酚反应,醋酸铅反应,坂口反应,乙醛酸反应,92/104,茚三酮反应,氨基酸脱羧脱氨被氧化，水合茚三酮被还原，氧化型和还原型水合茚三酮与,氨反应生成二酮茚-二酮茚胺取代盐等,蓝紫色,化合物。,脯氨酸,(Pro)或,羟脯氨酸,(Hyp)与茚三酮反应，生成,黄色,化合物。惯用于AA定性和定量分析。,93/104,(,2,)双缩脲反应(Biuret Reaction),蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用展现,紫红色(在540nm,有最大,光吸收峰),称双缩脲反应,。,凡分子中含有两个以上,-CO-NH-,键化合物都呈此反应,蛋白质分子中氨基酸是以肽键相连,所以,全部蛋白质都能与双缩脲试剂发生反应,。,(,3,)米伦反应(Millon Reaction),蛋白质溶液中加入米伦试剂(亚硝酸汞,硝酸汞及硝酸混和液),蛋白质首先沉淀,加热则变为,红色沉淀,此为酪氨酸酚核所特有反应,所以含有酪氨酸蛋白质均呈米伦反应.,94/104,(,4,),黄蛋白反应,蛋白质遇,浓硝酸,会,变黄,这一反应为,苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸,等含苯环氨基酸所特有,。,(,5,),酚试剂法,该反应是比色法测定蛋白质惯用方法，即蛋白,质以碱性铜溶液处理后,加用酚试剂,呈,蓝色(在650nm,有最大光吸收峰)。,(,6,),考马斯亮蓝法,即蛋白质与一个蛋白质染料,考马斯亮蓝G250,反应形成复合物，该复合物在,595nm,有最大光吸收峰。,蛋白质遇硝酸也显色为黄色，不过这么蛋白质就变性了。,95/104,(,7,),坂口反应,在次溴酸钠或次氯酸钠存在条件下，许多含有胍基化合物(如胍乙酸、甲胍、胍基丁胺等)能与-萘酚发生反应生成,红色,物质。,（8）,乙醛酸反应,在浓硫酸存在下，,色氨酸,与乙醛酸反应生成,紫色,物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相同物质。,96/104,97/104,9,蛋白质分离提纯和应用,每种细胞都含有成千上万种不一样蛋白质。为研究蛋白质结构与功效，需将其分离、纯化，尽可能除去不需要和变性蛋白质，提升单位质量蛋白质中所要蛋白质含量或活性。必须依据所分离蛋白质性质、含量、分离目标选择一套适当程序。,98/104,9.,1 蛋白质分离纯化普通标准,分离提纯普通程序分为前处理、粗分级和细分级3步。,前处理,以适当方式将组织细胞破碎，使蛋白质以溶解状态释放出来，并保持其天然构象和原有生物活性。,动植物组织普通可用组织捣碎机,匀浆器和超声波破碎法;植物组织用研磨或用纤维素酶处理；微生物细胞多用超声波法、高压挤压或溶菌酶处理。,99/104,组织破碎需加入适当缓冲液并在低温下进行，必要时加入蛋白酶抑制剂、巯基试剂等。,对膜蛋白需加入去垢剂使膜结构瓦解，再用适当介质提取。,若所要蛋白质主要存在于某一细胞组分,如线粒体,叶绿体、细胞核等，可先用差速离心法将其分开，再以该细胞组分作为下一步分离提纯材料。,100/104,101/104,粗分级,通惯用盐析,等电点沉淀,超滤,有机溶剂分级等简便、处理量大方法从蛋白质混合液中除去大量杂质，得到浓缩蛋白质溶液。,102/104,细分级,选取分辨率高方法深入提纯，如经过凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、反相高效液相层析、,亲和层析以及凝胶电泳、等电聚焦等。,103/104,亲和层析法以其非常高效纯化能力尤其受到重视。亲和层析依据要纯化某蛋白对另一物质(统称为,配基)特殊生物亲和性，如酶对其底物、抑制剂，抗体与其抗原，激素与其受体，凝集素与其专一结合糖和糖蛋白等都有很高亲和性。,将配基连接在载体上制备成亲和层析柱，加入待纯化蛋白质混合液，杂蛋白不能与配基结合而随溶剂流出，需要蛋白质与配基形成络合物留在柱上，再用洗脱液将其洗脱。,104/104,
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