微生物限度检查方法适用性试验方案模板药典.doc

微生物限度检查方法适用性试验方案模板药典

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2020年4月19日
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验证文件

类 别：
编 号：
部 门：

XXXX微生
物限度检查方法适
用性试验方案

XXXXX公司

XXXX微生物限度检查方法适用性试验方案审批

起草
起草部门
签 名
日 期
质量管理部

年 月 日

审核
审核部门
签 名
日 期
质量管理部

年 月 日

批准
批准人
签 名
日 期

年 月 日

目 录
1、 适用范围
2、 目的
3、概述
4、适用性所需要的仪器设备及文件
5、可接受的限度范围标准
6、测试方法
7、异常情况处理
8、测试结果
9、结论
10、再适用性周期
11、附表
1、适用范围
本适用性方案适用于XXXX微生物限度检查的方法适用性试验。
2、目的
因《中华人民共和国药典》（ ）颁布实施，为确保该产品的微生物限度检查方法的可靠性和可操作性，故对其检验方法进行适用性试验，以符合《中华人民共和国药典》规定。
3、概述
3.1根据《中华人民共和国药典》 四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法，对XXXX进行需氧菌、霉菌和酵母菌、大肠埃希菌检查方法的适用性试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。
3.2适用性试验时间及批号： 年 月 日开始分别对 、 、 三批XXXX进行独立的方法适用性试验。
3.3验证小组
部门
姓名
职务
职责

4、仪器设备及文件
4.1需用仪器设备
器具名称
规格型号
仪器编号
检定日期
检定单位
有效期

4.2文件及存放地方
资料名称
存放地点

5、可接受的限度范围标准
5.1XXXX微生物限度检查质量标准
项目
标准规定
需氧菌总数

霉菌和酵母菌总数

控制菌
不得检出大肠埃希菌（1g）
5.2需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法采用《中华人民共和国药典》 四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法中叙述的平皿法中的倾注法。控制菌检查方法采用1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法中大肠埃希菌检查方法
6、测试方法
6.1供试品 XXXX 批号：
6.2培养基及菌种
6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，并经过培养基适用性检查。
胰酪大豆胨琼脂培养基 批号： 胰酪大豆胨液体培养基 批号：
沙氏葡萄糖琼脂培养基 批号： 沙氏葡萄糖液体培养基 批号：
麦康凯琼脂培养基 批号： 麦康凯液体培养基 批号：
MUG培养基 批号：
6.2.2菌种均购于：
菌种名称
编号
购入日期
传代日期
传代次数
枯草芽孢杆菌

第 代
金黄色葡萄球菌

第 代
铜绿假单胞菌

第 代
大肠埃希菌

第 代
白色念珠菌

第 代
黑曲霉

第 代
6.3菌液制备
6.3.1需氧菌、霉菌和酵母菌的检查菌液制备
6.3.1.1接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌适量至胰酪大豆胨液体培养基中， 30～35℃培养18～24小时，取上述培养物一定量用PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成制成适宜浓度的菌悬液，备用。
6.3.1.2接种白色念珠菌适量至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，取上述培养物一定量用PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。
6.3.1.3接种黑曲霉适量至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3～5ml的含 0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液，备用。
菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在适用性过程的贮存期内使用。
6.3.2控制菌的检查菌液的制备
接种大肠埃希菌适量至胰酪大豆胨液体培养基中， 30～35℃培养18～24小时，取上述培养物用PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成制成适宜浓度的菌悬液，备用。
菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃可在24小时内使用。
菌落数确认

稀释级别104
稀释级别105
稀释级别106
稀释级别107
枯草芽孢杆菌（cfu/ml）

金黄色葡萄球菌（cfu/ml）

铜绿假单胞菌（cfu/ml）

大肠埃希菌（cfu/ml）

白色念珠菌（cfu/ml）

黑曲霉（cfu/ml）

6.4需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数计数方法适用性试验
6.4.1供试液的制备
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液。
6.4.2实验步骤
6.4.2.1试验组
分别取5份1：10的供试液各10ml分别加入0.1ml试验菌液（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）混匀，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu。取1ml含试验菌液的供试液分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。另取1ml含白色念珠菌和黑曲霉的供试液分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。按平皿法测定其菌落数，胰酪大豆胨琼脂培养基用于需氧菌总数计数，沙氏葡萄糖琼脂培养基用于霉菌、酵母菌总数计数。
6.4.2.2供试品对照组
取制备好的供试液，以稀释液替代菌液同试验组操作。
6.4.2.3菌液组
取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。
6.4.2.4阴性对照
取相应稀释液代替供试液和菌液同试验组操作。
6.4.3培养和计数：
胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30～35℃培养3～5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级别两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
6.4.4计算公式

6.4.5结果判断
试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内，可用所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。若还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检査。
6.5控制菌 大肠埃希菌
6.5.1供试液制备
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液
6.5.2试验分组
6.5.2.1试验组
取制备好的1:10的供试液10ml，加入0.1ml含菌数50～100cfu的大肠埃希菌菌悬液，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h。
6.5.2.2供试品组
取制备好的1:10的供试液10ml，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h。
6.5.2.3阴性对照组
取制备好的PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h。
6.5.2.4阳性对照组
取稀释液10ml代替供试液，加入0.1ml 50～100cfu的大肠埃希菌菌悬液，置100ml灭菌胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35℃培养18～24h。
6.5.3取上述培养物1ml，接种至100ml的麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。大肠埃希菌的鉴定应显MUG与靛基质阳性。
6.5.4结果判断
若试验组检出试验菌，可按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其它方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法适用性试验。
7、异常情况处理
严格按照微生物限度检查法操作，如在检测中出现不符合要求的情况出现，分析问题原因后，决定是否需对本方案中设定的XXXX的微生物限度检查方法进行修改，并重新进行方法适用性试验。
8测试结果
8.1需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验结果见附表1至3。
8.2大肠埃希菌检查方法适用性试验结果见附表4-6。
9结论

10再适用性周期
10.1XXXX因其它因素变更导致XXXX的物料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再适用性试验。
10.2国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行方法再适用性试验。