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消毒剂消毒效果确认方案

16
2020年4月19日
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消毒剂消毒效果确认方案

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审核人

批准人

生效日期

TABLE OF CONTENTS 目录

1 PURPOSE AND SCOPE 目的和范围 4
2 OVERVIEW 概述 4
3 REGULATIONS, STANDARDS & REFERENCES 法规、标准和参考文献 4
4 RESPONSIBILITIES AND TRAINING 职责和培训 4
5 PREPARATION 验证准备 5
6 VALIDATION TESTS 验证测试 6
7 DEVIATIONS & CHANGES 偏差和变更 10
8 ANNEXES 附件 11
9 VERSION 修订记载 11

1 目的和范围
1.1 目的
本方案的目的是为了确认各洁净级别的操作间及设备外表面按照规定的消毒程序消毒能够达到消毒、防止污染的目的，并在消毒剂有效期内能确保其消毒效力能符合要求。

1.2 范围
本验证方案适用于QC洁净区的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、桌椅等表
面以及操作人员双手（手套）所用的消毒。

本文件合并了方案和记录，当验证完成后，本文件将作为确认报告的附件。

2 概述
2.1 本公司拟定用于仪器设备和洁净区表面消毒的消毒剂有：XXXXXX。本次验证方案将选用以上X种消毒剂分别进行验证试验。 作用对象一样的消毒剂每月轮换使用，避免表面微生物产生耐药菌株。为了确认消毒剂的消毒效力我们经过定量悬液试验和定量载体试验对消毒效果进行确认。

2.2 洁净区设施表面材质有彩钢板、不锈钢和玻璃三种，故定量载体试验选用彩钢板载片、不锈钢载片和玻璃裁片模拟洁净区设施表面进行验证试验。

3 法规、标准和参考文献
3.1 中华人民共和国国家标准 消毒与灭菌效果的评价方法与标准
3.2 中华人民共和国药典 第四部

4 职责和培训
4.1 职责
姓名
部门
职务
职责

4.2 Training 培训
上表中提及的员工都会参与验证实施，而且会在验证实施前经过培训。培训记录作为附件附入本方案。

5 验证准备
5.1 仪器/设备
本次验证需要使用到的仪器/设备及其信息如下：
仪器名称
编号
校准有效期至
电热恒温水浴锅

生化培养箱

生化培养箱

生化培养箱

锥形瓶

试管

移液枪

移液管

量筒

生物安全柜

脉动真空灭菌柜

5.2 标准物质、试药和试液
名称
浓度&级别
编号
有效期至
PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液

0.1%卵磷脂+0.1%吐温80+0.1%蛋白胨缓冲液

5.3 菌种
微生物检验方法验证方案适用。
菌种
传代次数
编号
有效期至
金黄色葡萄球菌

铜绿假单胞菌

大肠埃希菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

黑曲霉

5.4 培养基
培养基
批号
灭菌批号
有效期至
胰酪大豆胨液体培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基

沙氏葡萄糖液体培养基

沙氏葡萄糖琼脂培养基

6 验证测试
6.1 通用项目
6.1.1 培养基：按QS-QC-GAM-014《培养基配制标准操作规程》和QS-QC-GAM-013《培养基适用性检查标准操作规程》要求准备相应的培养基，培养基适用性检查记录作为附件附入本方案。
6.1.2 消毒液：XXXXX
6.1.3 稀释剂为：PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。中和剂为：0.1%卵磷脂+0.1%吐温80+0.1%蛋白胨缓冲液
6.1.4 菌液准备
6.1.4.1 菌液的制备：见XXXX《菌种传代、保藏、使用和灭活标准操作规程》。
6.1.4.2 菌液计数确认：将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的新鲜培养物用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液按10倍梯度稀释成10-6、10-7、10-8三个浓度。枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液按10倍梯度稀释成10-5、10-6、10-7三个浓度。
取黑曲霉新鲜培养物加入3~5ml含0.05%（ml/ml）吐温80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后用带纱布的移液管吸出孢子悬液至无菌试管。再用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液按10倍梯度稀释成10-5、10-6、10-7三个浓度。每种菌各个浓度的菌液分别取1ml至平皿中，同法平行制备两个平皿。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的平皿倾注15~20ml 45℃以下的胰酪大豆胨琼脂培养基。白色念珠菌、黑曲霉的平皿倾注15~20ml 45℃以下的沙氏葡萄糖琼脂培养基。
6.1.4.3 胰酪大豆胨琼脂培养基平皿于30~35℃生化培养箱中培养，培养时间不超过3天，每天至少计数一次。沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿于20~25℃生化培养箱中培养，培养时间不超过5天，每天至少计数一次。根据各个浓度菌液的计数情况推算出1ml浓菌悬液的含菌数。记录见附件一《菌液含菌数计数记录》

6.1.5 中和剂确认试验
6.1.5.1 根据菌液计数所得数据，将新鲜的浓菌液用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液按10倍梯度稀释成5*105~5*106CFU/ml的工作菌液。
6.1.5.2 将配制好的消毒液用不同的工作菌液进行以下分组试验。

组号
混合液A

混匀作用10min

混合液B

混匀作用10min

取混合液B或混合液B的稀释溶液0.5ml平板计数（2皿/组）
取0.5ml工作菌液加入下列溶液中
取混合液A 0.5ml加入下列溶液
1
消毒剂4.5ml
稀释液4.5ml
混合液B、10-1
2
消毒剂4.5ml
中和剂4.5ml
混合液B、10-1
3
中和剂4.5ml
稀释液4.5ml
10-2、103

4
中和产物4.5ml（消毒液与中和剂比例为1:1）

稀释液4.5ml

10-2、10-3

5
稀释液4.5ml
稀释液4.5ml
10-2、10-3
6
稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿，作为阴性对照组
具体操作：
第一组：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液A0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min，取混合液B或浓度为10-1的混合液B0.5ml注皿，各平行制备2皿。
第二组：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液A0.5ml+中和剂4.5ml，混匀作用10min，取混合液B或浓度为10-1的混合液B0.5ml注皿，各平行制备2皿。
第三组：取中和剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液A0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min，用稀释剂进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各平行制备2皿。
第四组：取消毒剂和中和剂1:1的混合液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液A0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释剂进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各平行制备2皿。
第五组：取稀释液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液A0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释剂进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各平行制备2皿。
各组高浓度平皿编号为：1＃、2＃，低浓度平皿编号为：3＃、4＃。
第六组：分别取稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基各制备2皿。
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌、铜绿假单胞菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂培养基，倒置20～25℃培养5天计数计数，逐日观察。
6.1.5.3 结果判定
试验结果应符合以下全部条件，判断所选中和剂合格：①第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长。②第2组菌落数比第1组菌落数多，但明显少于第3、4、5组菌落数。③第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超过15%。计算公式如下：
（3组间菌落平均数-各组菌落平均数）的绝对值之和
误差率= ×100%
3×3组间菌落平均数

6.1.5.4 记录见附件二《中和剂确认记录》

6.2 消毒剂消毒效果确认
6.2.1 定量悬液试验
6.2.1.1 根据菌液计数所得数据，将新鲜的浓菌液用PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液按10倍梯度稀释成5*105~5*106 CFU/ml的工作菌液。
6.2.1.2 将配制好的消毒液用不同的工作菌液分别进行以下分组试验（试验重复3次）。

组号
混合液A

作用
时间
混合液B

作用
时间
取混合液B或混合液B的稀释溶液1ml平板计数（2皿/组）
取0.5ml工作菌液加入下列溶液中
取混合液A 0.5ml加入下列溶液

试验组

消毒剂4.5ml
8min
中和剂4.5ml

10min

混合液B、10-1
消毒剂4.5ml
10min
中和剂4.5ml
混合液B、10-1
消毒剂4.5ml
12min
中和剂4.5ml
混合液B、10-1
阳性对照
用稀释液将工作菌液进行10倍系列稀释
10-4、10-5
阴性对照
稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿，作为阴性对照组
具体操作：
试验组：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，分别混匀作用8min、10min、12min后，取混合液A0.5ml+中和剂4.5ml，混匀作用10min，取混合液B或浓度为10-1的混合液B1ml注皿，各平行制备2皿。
阳性对照：用稀释液将工作菌液进行10倍系列稀释至10-4、10-5。取相应稀释级1ml注皿，各平行制备2皿。
阴性对照：分别取稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基各制备2皿。
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌、铜绿假单胞菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂培养基，倒置20～25℃培养5天计数计数，逐日观察。
6.2.1.3 记录见附件三《消毒剂消毒效果确认定量悬液试验记录》

6.2.2 定量载体试验
6.2.2.1 所用载体：不锈钢、彩钢板、玻璃
6.2.2.2 将灭菌载体平放于灭菌平皿内，每个载体滴注定量菌液(载体回收菌量达5*105～5*106cfu/片)
涂匀，放37℃培养箱待干。
6.2.2.3 将配制好的消毒液用不同的染菌载体分别进行以下分组试验（试验重复3次）。

组号
混合液A

作用
时间
混合液B

作用
时间
取混合液B或混合液B的稀释溶液1ml平板计数（2皿/组）
染菌载体
与消毒液作用后的染菌载体

试验组

消毒剂5ml
8min
中和剂5ml
震荡50至80次
10min
混合液B、10-1
消毒剂5ml
10min
中和剂5ml
混合液B、10-1
消毒剂5ml
12min
中和剂5ml
混合液B、10-1
阳性对照
稀释剂5ml
——
中和剂5ml
10-2、10-3
阴性对照
稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿，作为阴性对照组
具体操作：
试验组：取消毒剂5ml+染菌载体，分别混匀作用8min、10min、12min后，取与消毒液作用后的染菌载体+中和剂5ml，震荡50至80次混匀作用10min，取混合液B或浓度为10-1的混合液B1ml注皿，各平行制备2皿。
阳性对照：用稀释液代替消毒液同试验组操作。将混合液B用稀释剂进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级1ml注皿，各平行制备2皿。
阴性对照：分别取稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基各制备2皿。
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌、铜绿假单胞菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂培养基，倒置20～25℃培养5天计数计数，逐日观察。
6.2.3 记录见附件四《消毒剂消毒效果确认定量载体试验记录》

6.2.4 各组高浓度平皿编号为：1＃、2＃，低浓度平皿编号为：3＃、4＃。

6.2.5 按不同稀释度推算出每个样本存活菌数(cfu/mL)，计算出杀灭率。杀灭率计算公式如下：
阳性对照组-试验组平均值
杀灭率= ×100%
阳性对照组

6.3 结果判定：3次试验的杀灭率均≥99.9%判为消毒合格。
7 偏差和变更
7.1 偏差登记
Number
编号
Description
描述
Result
结果
Attachments
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7.2 变更登记
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编号
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描述
Result
结果
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8 ANNEXES 附件
8.1 附件一《菌液含菌数计数记录》
8.2 附件二《中和剂确认记录》
8.3 附件三《消毒剂消毒效果确认定量悬液试验记录》
8.4 附件四《消毒剂消毒效果确认定量载体试验记录》

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