柱前衍生—反相高效液相色谱法测定N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物含量.doc

柱前衍生反相高效液相色谱法
测定N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物含量

摘要 目的：以2，4—二硝基氟苯（DNFB）作柱前衍生化试剂，在碱性条件下制得2，4—二硝基苯基—（N—甘氨酰—L—谷氨酰胺）（DNP—GGM）。用反相高效液相色谱（RP—HPLC）法测定N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物（GGM）含量。方法：使用日本岛津SCL—10AVP高效液相色谱仪，ODS色谱柱，以乙腈—醋酸盐缓冲液洗脱，检测波长360nm结果：GGM在16—80μg/mL范围内线性良好，r=0.9943，回归方程Y=1.2436*10-4X,RDS= 0.31%(n=5)。结论：本法可用于测定N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物的含量。

关键词：N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物，2，4—二硝基氟苯，柱前衍生，反相高效液相色谱。

N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物（N—Glycyl—L—Glutamine Monohydrate，GGM）为目前大量出口氨基酸输液的原料药，含量测定用常规方法难以解决[1~3]。本文采用DNFB[4]在碱性条件下能定量地与GGM发生置换反应生成DNP—GGM，用紫外检测器检测。在这个方法中DNP—GGM可与衍生剂水解产物（2，4—二硝基苯酚）峰获得基线分离。衍生条件简便，重现性好，对定量测定无干扰。本法可用于测定N—甘氨酰—L—谷氨酰胺一水合物的含量。
1． 仪器、试剂、样品
日本岛津SCL—10AVP高效液相色谱工作站。试剂DNFB、冰乙酸、乙酸钠、无水碳酸钠均为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯，水为二次重蒸水。对照品GGM国外进口，供试品GGM为我市A药厂产品。谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）由中国药品生物制品检测所提供。
2． 色谱条件
色谱柱ODS（4.6mm×250mm）10μm大连依利特科学仪器有限公司产品，流动相0.05mol/L醋酸钠水溶液（用冰醋酸调pH6.4）：乙腈（80：20 V/V）、检测波长360nm、进样量20μl、流速1ml/min。
3． 溶液的配制
3.1衍生液配制，
称取DNFB105mg置25ml棕色量瓶中，加入乙腈溶解并稀释至刻度。
3.2 5%碱液配制：
称取无水碳酸钠10g，加入双蒸水至200ml搅拌溶解。
3.3 对照品与供试品溶液配制：
精密称取对照品、供试品（三批）25mg，甘氨酸8.5mg、谷氨酸16.6mg分别置于6只25ml棕色量瓶中，用5%碳酸钠水溶液溶解并稀释至刻度。
4. 实验方法与结果
4.1线性关系测定：
精密量取对照品液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml于5只25ml棕色瓶中，分别依次加入DNFB液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml置水浴中80℃加热75min，迅速冷却，加入流动相至刻度摇匀，直接取样20ml注入高效应相色谱仪，以DNP-GGM峰面积为横坐标，GGM浓度（ug/ml）为纵坐标，实验结果表明在16-80ug/ml浓度范围内经衍生化后生成的DNP-GGM峰面积与GGM浓度呈线性相关（表1）。48ug/mlGGM对照液记录色谱图（图1-A）。
表1 线性关系测得结果
GGM浓度
ug/ml
DNP-GGM
峰面积
回归方程
相关系数
16
32
48
64
80
111304
237447
368774
508444
650989

Y=1.2436×10-4 X

r=0。9943

4.2样品测定：
精密量取对照品液和供试品液1.2ml分别置25ml棕色量瓶中，并照上述衍生方法分别加入DNFB液1.2ml。按外标法以峰面积计算即得三批供试品测得结果（表2），48ug/ml GGM供试品液记录色谱图（图1-B）。
表2 供试品测定结果

批号
重量mg
峰面积
含量%
对照品

25．30
365166

供试品
200101
25．95
367805
98．19
200102
25．49
357386
97．14
200103
26．26
3666817
96．78

t/min
A B
图1。 DNP-GGM反相高效液相色谱图
A． 对照品DNP-GGM B. 供试品DNP-GGM
4.3重复性实验：
取供试品生产批号200103（约相当于GGM25mg）5份，精密称定，按含量检测方法测定，实验结果表明重复性良好（表3）RSD为0.31%
表3 样品重复性测定结果
份数
重量mg
峰面积
含量%
1
25．20
350356
96．32
2
25．31
351701
96．27
3
25．11
348855
96．25
4
25．24
352941
96．88
5
25．55
354288
96．07
4.4干扰因素考察：
精密量取对照品液、甘氨酸液、谷氨酸液各2ml，置于25ml棕色瓶中，加入DNFB液6ml，在水浴中80℃加热，75min，迅速冷却，加流动相至刻度，摇匀，进样20μl测定。结果N-DNP-Gly、N-DNP-Glu与N-DNP-GGM得到很好的分离（见图2）。

图2 干扰因素考察色谱图
1．N-DNP-GGM第一峰 2．N-DNP-GGM第二峰 3．N-DNP-Glu峰 4．N-DNP-Gly峰
5．DNFB 水解产物（2，4二硝基苯酚）峰

5.讨论
5.1 通过实验测定，结果（见图1）可见供试品与对照品DNP—GGM色谱峰保留时间一致，为同一化合物，且未见其它杂质峰。
5.2实验中选用甘氨酸、谷氨酸作为GGM的杂质进行干扰因素的实验观察（见图2），结果表明本法能有效分离样品与杂质。
5.3 衍生化试剂DNFB适用于仲胺的鉴定[5]和伯胺的衍生化反应。N—甘胺酰—L—谷胺酰胺含氨基和酰亚胺，这两个功能基同时参与衍生化反应，在色谱图中呈现两个衍生峰（见图1）。在样品测定时，选用第二个衍生峰制作标准曲线， 结果GGM在16—80μg/mL范围内线性良好，回归方程Y=1.2436*10-4X, r=0.9943，含量测定结果可靠。
5.4本实验衍生方法稳定，根据文献报道经DNFB衍生化后的样品室温放置6天仍保持稳定[7]。
5.5 DNFB的用量对标准曲线制作和含量测定影响较大。在衍生化反应中，DNFB大量水解（生成2，4—二硝基苯酚）被消耗掉。实验中每个样品与DNFB用量始终控制在1：5摩尔数。
5.6 对照品与供试品应在同一条件下衍生，以免加大误差。
5.7 DNFB使用前137℃/20mmHg减压蒸馏精制[6]。

参考文献
1.中国药典2000年版二部,PP388
2.中国药典2000年版二部,PP88
3.刘玉波,复方赖氨酸颗粒中盐酸赖氨酸的HPLC测定,药物分析杂志,1999,19(6),410-412
4.聂小春，柱前衍生化高效液相色谱法测定复方氨基酸制剂的应用研究,药物分析杂志，1996,16(5),295-298
5.王俊德著:高效液相色谱，中国石化出版社,1992,202-204
6.The Merck index,1987,4101
7.陈亚兰,十八种氨基酸注射液的HPLC2,4—二硝基氟苯柱前衍生化法含量测定，药物分析杂志，1990，10（3），149

Determination of N-Glycyl-L-glutamine monohydrate by precolumn Derivatization RP-HPLC
Abstract: Objective: this paper reports the determination of N-glycyl-L-glutamine monohydrate (GGM) by reverse phase high performance liquid chromatography (Rp-HPLC) with 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB) as a precolumn derivalization regent. In this method,Hydrolysate 2,4-dinitrophenol of the DNFB could be separated from derivative N-2,4-dinitrophenyl-(N-glycyl-L-glutamine monohydrate)(DNP-GGM) on an octadecylsilane column within 10 minutes using acetonitrile:aceticacid-sodium acetate pH6.4(20:80v/v) elution and detected at 360nm. Result: there was a good liner correlation in the range of 16-80μg/ml，r=0.9943,Y=1.2436×10-4X,RSD=0.31% (n=5). Conclusion: this method was best to determine N-glycyl-L-glutamine monohydrate.
key words: N-glycyl-L-glutamine monohydrate, 2,4-dinitrofluorobenzene, precolumn derivalization, Reverse phase high performance liquid chromatography