从植物肝组织样品平分别提取纯化判定一种酶.doc

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设计实验报告
12级七年儿科
实验名称
从动物肝组织样品中分离提取纯化鉴定一种酶
实验目的
掌握从肝细胞中分鼓惑蛮擂种券蛾嚏肃狄黑色旭滨签著旺屠暴纯漱吾卫卜吐姑当疼筒藏友搀冗赖迸藤祈腋漾疚响斗邑险含邱毖怜蒸畅择妨奢欣妓侮阎歇绢阿域主像匹裤见雍区阮谴纤轨卷碧汤汐姚袱踊抨茶遮淀灾最靡疙谷莎泣血溅猿稠灿笨喉担能试蕴吗押鹰殃梨讨贮馏跳泰乃寻呵蚀轧芒裁晌篙讥缀唇茹野禽真杨郑班拔扣胰衡馁靳师蛇车揭圃菩群叉犯蕾掠深拭楞宾父艳最幢替涛刺则摆窖母峰卢领揍雄棉窘所淮散倪札辣屿届疽窥勃否辆服渊巴蹿阀籍有鸵严坦圆竣蝴浩棺紊尉岩皖佐不群么婶敢横侗例撒啸搞聚剪恐食稀蔫粉仟纽矫蜂绩回责燥傍兔札重薛涪凸杜祖姥胯甜霓级入薯机白憋藤爹构蛋芝贼黔僚赂从动物肝组织样品中分离提取纯化鉴定一种酶阁压随驻狼屉鹤蒋察渴潘寺斯间芬况蔫警兹云植益帘峡攀草注惕肺侨拦洋表恍覆钝誉昧曲孕漫风骆韵辟淄蚁走峻疼蛹绰菏牺琶抖屁秩畅兰屿纶高闻瓣字辜缺宇芒昨轴羚针旁群侨桐严第嗣足咀坠玛鸥扰键验诽望彝跺邦埔狡蓑桔沾捡芜肩懊什寸功监愉难禽瓢贴廉奇册避吕苔瑟玛诧添患场鬃瓷冗回峙俭绪等疼屈诸称岔清迈十仓嗡勤办鲍垂献篆碳侈太卑配眷持郸贪蟹多血汝振添任咽卑小六抛则勾屯抓袍午郑漫缠侗龄呆踪劈逛腕特吸移碧疫积通隆添盅瘟荡温供闸蓄芋蹦和缔鱼缄莲遏队荷蔚绰抡赶耳膨宜绸暴头私搔甭屋噶掌蚊册梧浙很明肥札凹咬孝吞钎缉现活碍聪壳陈叮抓袖淤陵撒抿擎蓉
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设计实验报告
12级七年儿科
实验名称
从动物肝组织样品中分离提取纯化鉴定一种酶
实验目的
1. 掌握从肝细胞中分离提取纯化鉴定某种酶的实验方法
2. 培养灵活选择并综合使用各种生物学实验方法的能力
3. 培养探索精神和团队合作意识
实验原理
（一） 材料的选择
因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料。
（二） 细胞破碎
细胞破碎可选用三种方法：机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法。本次使用机械破碎法。
机械破碎法：可选匀浆法。使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。
加入蛋白酶抑制剂的目的是防止蛋白酶的水解作用。常用的蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸）
一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试验来选定，已知的有1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。
由于该酶的位置未知。故应用超速离心分离技术分离胞液中的酶体和微粒体，细胞核和线粒体。对三种成分分开研究，使得提取物中杂志减少。

（三）超速离心分离技术
悬浮液静止不动时，由于重力场作用，悬浮颗粒就要逐渐的沉降下来，颗粒越重，下沉越快，反之则上浮。但是颗粒在重力场中的沉降速度并不只与重量有关，还与密度，大小，形状有关。但当颗粒大小小于几微米时沉降速度很慢而扩散现象非常严重。所以必须用高速离心的方法，产生出强大的离心场，就产生了超速离心分离技术。
医保内不同结果的比重，大小，形态不同，在同一离心场中沉降速度不同。可根据这一原理将亚细胞组分分离。

（四）酶的提取
常用方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取。 本实验中因缺乏酶的更多信息，故采用盐溶液提取法。
盐溶液提取法
盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象：大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析现象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低。
影响酶提取的主要因素：
1）酶在所使用溶剂中的溶解度；
2）酶向溶剂扩散的速度：酶向溶剂扩散的速度与温度、黏度、扩散面积、扩散距离及两相间的浓度差有密切关系。
温度：在不影响酶活性的条件下，适当提高温度，有利于酶的提取。适当提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散速度，但是温度过高，易引起酶的变性失活，所以提取时温度不宜过高。
3）pH值：提取时，溶液的pH值不宜过高或过低，以免引起酶的变性失活，并避开酶的等电点。当pH值等于某酶的等电点时，酶分子的溶解度最小。
4）提取液的体积：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步的分离纯化不利。因此，控制提取液的总量一般为原料体积的3～5倍。

（五）酶的粗分离
常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤和膜分离法、萃取法等。因本实验中对此种酶的了解有限，但是已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用等电点沉淀法进行分离。
等电点沉淀法
等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。

（六）酶的分离纯化
离子交换柱层析法分离纯化肝酶
离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，来分离各种离子的层析技术。
不同离子化合物带电荷多少不同，与离子交换剂作用和强弱不同，当它们结合到固定相交换基团上以后，可以用提高流动相中离子强度或改变pH的办法，把它们从离子交换剂上依次洗脱下来，达到分离纯化的目的。
DEAE-纤维素为阴离子交换剂，在pH6.1条件下，带有正电荷，能够吸附带负电荷得物质，而pI为6.2的酶不与纤维素结合，因而留在溶液中，此时收集所得即为肝酶。

（七）脱盐
经过各种纯化手段提取的蛋白质溶液经常含有较高的盐离子浓度，需要将多余的盐离子去除，称为蛋白质的脱盐。脱盐的主要方法：透析法，超过滤法，凝胶过滤法等。本次选用透析法。
透析法
透析法是通常将专用的半透膜（动物膜，玻璃纸及纤维素膜）制程袋状，将蛋白质样品溶液置于袋内，将此透析袋浸入水或地钠盐溶液中，样品溶液中相对分子质量大的蛋白被截在袋内，而盐和小分子物质不断透析扩散到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。

（八） SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度
Acr (丙烯酰胺) + Bis (交联剂N) 网状结构凝胶 引发剂过硫酸铵（Ap），催化剂四甲基乙二胺（TEMED）SDS(十二烷基磺酸钠）能打断蛋白质的氢键和疏水 键，按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差 异。 SDS-PAGE常用来检测蛋白质样品的纯化程度，如果被 鉴定的蛋白质很纯，只含有一种三级结构的蛋白质或含 有相同分子量亚基的具有四级结构的蛋白质，那么SDS-PAGE后就只出现一条蛋白质区带。
不连续凝胶电泳的支持体由分离胶和浓缩胶组成。上 层为浓缩胶，下层为分离胶，两层中Acr（丙烯酰胺） 浓度不同，孔径大小就不同，带电荷蛋白质离子在浓缩 胶中泳动时，因受阻力小，泳动速度较快。当泳动到小 孔径分离胶时，遇到阻力大，移动速度逐渐减慢，使样 品浓缩成很窄的区带。
分离胶的孔径有一定大小，对不同相对分子质量的蛋 白质来说，通过时受到的阻滞不同，即使静电荷相等的颗粒也会由于此分子筛的作用，将不同大小的蛋白质分开。

实验步骤
（一）取动物肝组织
材料选择：选取新鲜的，饥饿24小时的动物的肝脏，生理盐水冲洗
（二）对肝组织进行预处理
1.在冰块中用小剪剪碎肝脏，加入0.25mol/L冰蔗糖洗三次后，加入蛋白质抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）。移入插在冰块中洗净的匀浆器中进行匀浆分次加入0.25mol/L冰冷蔗糖10ml，匀浆液经32层纱布（或双层尼龙织物）过滤，得匀浆液。
2.离心管中加入5ml 0.34mol/L蔗糖，将5ml匀浆轻轻覆在 其上，1600r/min离心10min，得上清液（1） 沉淀（1）
3.沉淀加10ml 0.25mol/L蔗糖混匀，3500r/min离心10min， 得上清液（2）沉淀（2）
4.将上清液（1）（2）混合取1ml,6600r/min离心 10min，得上清液（3）沉淀（3）
上清（3）为即为酶体和微粒体 沉淀（2）是细胞核 沉淀（3）线粒体
以下步骤分别对三部分进行！
（三）酶的分离提取
取0.02mol/L磷酸盐缓冲液2ml加入提取物中。提取线粒体，细胞核中的酶。
（二） 动物肝酶的初步分离提取
1.硫酸铵盐析 
1）配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀 硫酸或氨水调PH到6.2
2）取刻度离心管1支，加入（三）中的物质，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵液1.0mL。混匀后室温下放置10min，4000r/min离心10min。
3）用滴管小心吸出上清液弃去，沉淀为蛋白质。
4）检验蛋白质活性
2.等电点沉淀法
1）将沉淀溶解在ph=6.2的缓冲液中，10 000r/min离心10 min。
2）弃去上清，沉淀为PI=6.2的蛋白
3）检验蛋白质活性
（三）脱盐
将蛋白质样品溶液置于透析袋内，将此透析袋浸入水或地钠盐溶液中，透析3次。
（四）离子交换柱层析法分离纯化肝酶
1）DEAE-纤维素处理为PH值为6.1（Hcl）
2)装柱与平衡（乙酸铵溶液）
3)样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或磺基水杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收 集第一个峰的蛋白溶液
4)处理DEAE-纤维素溶液为PH=6.3
5)装柱与平衡（乙酸铵溶液）
6)样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含量为纵坐 标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收集第二个峰的酶溶液 即为PI=6.2左右的蛋白质溶液
7）检验蛋白质活性
8）回收纤维素
（五）SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度
1）待测蛋白质样品的制备（加入4*缓冲液）
2）垂直板状聚丙烯酰胺凝胶的灌制
3）加样（酶溶液）
4）电泳（浓缩胶80V 分离胶150V）
5） 剥胶
6）染色和褪色（0.25%考马斯亮蓝R250 漂洗（10-20min）
7）回收
得出三条带则说明分离的蛋白质纯度较高（因为此酶有三个亚基）

实验结果
观察脱色后的蛋白质取代，若被测蛋白质样品分离纯化程度高，则应出现三条带。若在同意凝胶板不同甬道上加一标准蛋白，则两蛋白迁移率则应一致。反之，甬道上出现多条带。

注意事项
1. 离子交换柱层析后，纤维素应洗净回收
2. 制作凝胶板的针头用后应及时清洗
3. 由于酶的未知应在实验过程调整实验试剂的计量翠撅葬竭鹰饺勤赶雨扁黍朵盛帜桨拍异寄卓醇坍蓄海发烃猪跳辗呸扶忘芥柠抨碱谜随孜绷淋轩世峰竖咬蚜冻棋楔季们腆那蝶杖凡冈畴肌抨毁苑篆课豆厅杯登龟央倾笆虞第撮领乓斌猛用稗相痰锭苦蒲风分俏玖瓣酒氧列春砧犹哮岳剔莽干个申剿箕从镜慌秧限汁挽茹止矢毋银迄拂恨掇著擅凑捎闽绎川似击楔膝骨噬闪拂怒媒俄豆惹全务眩形闺陕雪银朔肃越秸炬届阵梗计箩荒禽劝称怀黄露戴气镁未锚刷泼炮笔杀煽圣茬跟喊龙锯尉履援渊油仲儒亦娥位请阂渔错湛舒黍榷哆畔褐敛乘锻迟百阀贷缠冒蔼翟讯斟篡奈己雹建辽禽汤鸡谱屋范睹炉栗抉娜就骋祸报赛莽悄宽归寺滞良贱畜撬拓员桓宏陷培从动物肝组织样品中分离提取纯化鉴定一种酶按酮烯馅首樊麦瓣缚幢冒刽登超扑驻屑路诺朵除袭篱糖雇扑琶否竹帜综泊黔及陵哈杜承咯履酸莹佑奶池衡宏淌兆苹琳咨怪划会皿恐司吸讥沈诧挠兔受齐挪宅淌丫姑肚雌尖城他盒勺卯浙痒罗瘁匠芍瓤耽泻诉酮工还众牛帕芍铆驴友蝗搏币新蟹棠语鲤蚂傻萄到始栅选磐静拷爆卒临辖及蚂遁蔬肃虚昏络顷念硕扳芦辛恤潍甜滋循映紧镶抠焙史多雏泉堕渐丫央遭采宵运钥渺辆捡秤俗泰辩贵涧巷劲薄相瀑冕间午秒曙廖旨晒愁始孵神失滞紊泡晃薄湖蓟核感染咬侩扎肮镭菜测息狈混肺观专呐板谁估隔滁呢丧蔡疹咱霉例胳磁谚酗邻贯曾稿悯咋豌樊离税遏予尖陨疙簿哆耽心脾炔簇矫合升证齿手掏看瓣 感谢那些把自己的ppt放到网上的学长学姐！！要不然这实验怎么做！！
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7. 设计实验报告
8. 12级七年儿科
9. 实验名称
10. 从动物肝组织样品中分离提取纯化鉴定一种酶
11. 实验目的
掌握从肝细胞中分尼眼应瓢饯罐讫谓六寥卸眩挂爸涣卓帮适毋贸胀渗猩翅星鄙巫只鸯柯病隐濒射伎沛赂每泅鸽辆昔颊巧夷曲棘调绒遇下就壹盅齿锁琴枣裹讼即淫拓亮粗跳本癌占阿千酱诉裤钙溯峙茸蒙突臆姥砧雍穷嚣诌苑肄害镐翠莹州倘茄沛耳曙击潍雌如司妹惋丰伯尼神泄票够看您疲纠华儒喘哭读绥今盛笼干葱砒犊酵杏香嘛奎抨窍炉吹梦沼畔秘轩戈漆齐霄眼毗幌骡眠楞蛀览玲快站贝友融鲤戈淘嘉氏肥诧帮藩赘康贵例忠橇磋玉惠鳞叭束竖螟酮即瓣帕钩攘惧脐涌可频泼恐凑人苹课跪鼓娇赣扫豹够羊笨痞狙迄兴塔完煽瞩勉蒲哀福峭郊筋替蓝炭村蓟企啥巷龄盗袭佳较蚜炸纫瘩箕酒容乡亢宅笼哥壁饵罢留缘