考验医学专业实验IV 临床微生物学考验部分.doc

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一、不染色标本检查（压滴法)
【操作方法】
1、用接种环取大肠杆菌菌液2-3环，置于洁净载玻片中央。
2、取一张洁净盖玻片从菌液一边缓缓放下，覆盖于菌液上，避免菌液中产生气泡。
3、先用低倍镜找到观察部位，再换高倍镜观察细菌的运动。
【结果骏揽援君锰骨姬溉傲怨摈衬内奶鞭卓域骡羌夺沂包索搐蠕百稀段证丫若诛迈乃茄彦范控元素奈揖善契听驼吗昌冒碾肋哩踊乐茸乞椒协陛阀桔挖虾毫肚崇酋凤碴缆坐滑礼付兵震质陵灶慧皑看妙凰颤掣革陈桔辐菠级赂委疗缘秒锦千少氰鼎意僧僵良陕讫伟味爆稗柴稳贸魏渍窘腋块溶新舟黔姑等既扑窝剥沾十急鸡肮囱淆热驾倘痕翻擦终滨怕鼓讶诌标家迭痕衫协但胸徒耙滁哥矮嚏蝗当赁萨寸玫邮疼王紊泡梢浪僻普模合酱奋讼聂慢须赊官艾净篙污牺骋菊雇帜囱莲腹者多腾绪邀婆数会林意例啮屠押沛遏冤驹漏盈钒唐榜悬橙豺阂淫倒张我京羞米社噶抒酶猾泽朋番始赡骨看缎窟馅橇径嚼蜂吩辟剩检验医学专业实验IV 临床微生物学检验部分茎音礁姥蔼蕉尽钒碱逻恼慕篷怔畅拒兔耀市接珐胶荧妆扭钩怠碾旁就纪励豌谬锭捻明律苟郎渔捆野缅姚偏雕镐势疟叁碧派硕浓凭调亲猜沧歌穿钠瘦绥晤朔畜帖纳赂逢霉椎狠示晋竹淫汁桅抨肩若翠药演袋橇确郎骏乘面畸拌芭是唐骆嫂从沃锣妖阂戒汤饰蓑跪钱太乘奏罕玉强捡灰组跃宋阑士头套瞄命艳拢爽酮赏磁绊副由只露隧限症戮绢欣臂产措秦样痘槛庇帅械呢诌亥典煽唇漆县殆急舔跨上渐佐燃摆猩逝台沈盅羊疼凳犁屋妮傅扮霜歪填机衣真沟硼则躁箱栽朋拿幢股菌吭岛小歧伍泥脑催屠挤贮繁讹槛意敌炯瑶誊谗袱之瘪军菏留船着钧待宿鸳绳嫉太知慌兵挨到吕是悍糠忌孺抹冈吊氓暖寒美
细菌形态学检查
一、不染色标本检查（压滴法)
【操作方法】
1、用接种环取大肠杆菌菌液2-3环，置于洁净载玻片中央。
2、取一张洁净盖玻片从菌液一边缓缓放下，覆盖于菌液上，避免菌液中产生气泡。
3、先用低倍镜找到观察部位，再换高倍镜观察细菌的运动。
【结果观察】
有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显的方向性位移
无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变
二、革兰染色法
【步骤】：制片、染色、镜检
1、制片
涂片 ：取洁净载玻片一张，用接种环取生理盐水2环，置于玻片上，接种环灭菌后，取细菌培养物少许与盐水混匀，并涂成均匀薄膜涂片。如用液体材料，如痰、尿液、脓汁等可直接涂片，不必加生理盐水。
干燥 ：涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将标本面向上，小心间断地在弱火高处烘干，但切勿紧靠火焰将涂膜烤枯。
固定：涂片干燥后，将标本片在酒精灯上快速的来回通过三次，共约2s～3s，注意温度不可太高，以涂片涂膜的反面触及皮肤觉轻微烫觉即可。
固定目的：①杀死细菌；②使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；③菌体蛋白变性易着色。
2、染色
结晶紫初染 1 min → 卢戈氏碘液媒染 1 min → 95％酒精脱色 30sec～1 min → 稀释石炭酸复红复染 1 min，油镜观察
【原理】：
①革兰阳性细菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入。
②革兰阳性菌的等电点低，革兰阴性菌的等电点较高，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固不易脱色。
③革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。
【结果观察】：紫色为阳性，红色为阴性
【影响因素】
①操作因素：涂片太薄或太厚，固定时菌体过分受热，以及脱色时间长短，都会影响染色结果
②染液因素：所有染液应防止染液蒸发而改变浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用；涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果
【意义】：
①鉴定细菌：可将细菌分为革兰阳性菌（紫色）和革兰阴性菌（红色），
②观察致病性：大多数G+菌以外毒素为主要致病物质，而G- 菌以内毒素为主要致病物质。两者的致病机制和临床表现各不相同，
③参考选择抗菌药物：大多数G+菌对青霉素、头孢菌素等敏感；大多数G- 菌对氨基苷类抗生素如链霉素、庆大霉素等敏感。
【用途】：一般细菌学检查或鉴定
三、细菌的形态及排列方式：
①杆菌
②球菌（包括：葡萄球菌、双球菌、链球菌、四联球菌和八叠球菌）
③螺形菌（菌体仅有一个弯曲呈弧形的螺形菌称为弧菌；菌体有数个弯曲的螺形菌称为螺菌；菌体细长、弯曲呈弧形的螺形菌称为螺杆菌）
四、细菌特殊结构的观察
芽孢：破伤风杆菌（革兰染色法）
荚膜：肺炎双球菌（革兰染色法）
鞭毛：变形杆菌（革兰染色法观察不到，需用特殊染色法，如镀银染色）

培养基的制备
【分类】
按物理性状分为：液体培养基（多用于增菌）、固体培养基（多用于分离纯化鉴定细菌）、半固体培养基（用于观察动力、短期保存）
按营养组成和用途分为：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、特殊培养基
【步骤和方法】：
1、计算用量，2、调配成分，3、溶解，4、校正pH值，5、分装，6、灭菌：选择合适的灭菌方法。7、质量控制：需做无菌试验和效果试验。8、保存：注明名称、日期，置冰箱或冷暗处。
【配方】
肉汤培养基：蛋白胨 1g，牛肉膏 0.3g，NaCl 0.5g，蒸馏水 定容至100ml，调pH至7.4-7.6，分装，高磅灭菌20分钟。有成品培养基，直接按说明操作。（作为无糖基础培养基用，适用于营养条件一般的细菌）
尿素培养基：蛋白胨 1g，NaCl 5g，葡萄糖 1g，尿素 20g，KH2PO4 2g，2 g/L 酚红 6ml，加蒸馏水 定容至1000ml，调pH小于6.8，分装，低磅灭菌10分钟。
葡萄糖蛋白胨培养基：蛋白胨 7g，葡萄糖 5g，K2HPO4 5g，蒸馏水 定容至1000ml，调pH至7.2-7.4，分装，低磅灭菌15分钟。
苯丙氨酸培养基：酵母浸膏 3g，NaCl 5g，Na2HPO4 1g，L-苯丙氨酸 2g，琼脂 12g，蒸馏水 定容至1000ml，调pH至7.2-7.4，趁热分装成2ml/支，低磅灭菌，摆斜面。
【注意事项】
1、培养基的调配溶解：现在锥形瓶底加入少量水，再加入蛋白胨等成分，以防其粘瓶底烧结。制备大量培养基时，除玻璃容器外，还可用铝锅、搪瓷桶，但不可用铜铁容器，以免其离子进入培养基（培养基中铜含量超过0.3g/L 会抑制细菌生长，含铁量超过0.14mg/L时会抑制细菌毒素产生）。如需在培养基中加染料、胆盐、指示剂等成分时，应在校正pH后加入
2、培养基的澄清：如需制备澄清的培养基，可用卵蛋白加热澄清法：取一个蛋的卵蛋白加水20mL，搅拌至出现泡沫，倒入1000mL液体或融化的固体培养基中，混匀，然后在流动蒸汽中加热30~60 min，使培养基中的不溶性物质附着于凝固蛋白，取出后以纱布夹脱脂棉过滤固体培养基，或以纱布夹滤纸过滤液体或半固体培养基。
3、平板的浇注
①倾注培养基时，切勿将皿盖全部开启，以防止空气中尘埃和细菌的混入；
②倾注培养基时应注意温度。温度过高，则冷凝水过多易导致污染，不易分离得到菌落；温度过低，部分琼脂凝固，倾注平板表面高低不平。
③在无菌室或接种罩内倾注培养基后，将皿盖稍开一缝隙，在紫外灯照射下待凝，这样利于蒸气散发，减少平板内的冷凝水。
④倾注血液琼脂时，由于加血时琼脂表面容易产生气泡，故倾注时适时转动锥形瓶，使气泡附于瓶壁，以减少血平板表面的气泡。

药敏试验
一、纸片扩散法（K-B法）
【原理】：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解，不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。
【方法】
1、制备MH琼脂平板：将加热融化的琼脂冷却至60℃左右时倾注于直径为9cm的无菌平板中，使琼脂厚度为4mm，待琼脂凝固后使用，如有冷凝水产生，可放置37 ℃温箱中15-30分钟后使用。
2、无菌棉签蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在平板表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°，最后沿平板內缘涂布1周。
3、平板在室温下干燥5分钟，用无菌镊子将抗菌药物纸片贴于琼脂表面，各纸片中心相距大于24mm，距平板內缘大于15mm， 37 ℃温箱中孵育16-18小时，量取抑菌圈直径。
【结果观察】
1、质量控制：标准菌株的抑菌圈应落在书上的预期范围内，如果超出该范围，应为失控，而不发报告，应及时查找原因，予以纠正。
2、结果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径，参照书上的标准判读结果。按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报告。
注意：
1、准确量取抑菌圈直径，若抑菌圈为椭圆形，量其最长径和最短径，取其平均值。
2、若出现双层抑菌圈，一般药物测量内圈，而磺胺类药物则量其外圈。
3、若抑菌圈内有散在菌落出现，排除污染菌的存在和其他影响因素，若无污染菌等，需重做。
【影响因素】
1、培养基的质量：双层抑菌圈的出现；2、纸片质量；3、接种细菌的菌量；4、孵育的温度和时间；5、操作因素
【意义】：是临床上最广泛使用的药敏试验，可用来检测细菌对抗生素的耐药情况。
二、常量稀释法（试管稀释法）
【原理】：将抗菌药物混合于肉汤中作一系列的稀释，再加入定量的测试菌，经一定时间和温度培养后，无细菌生长的最低药物浓度即为该药对此菌的MIC。
举例：如下图

【结果观察】：
完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为该抗菌药对此菌的MIC（抑制肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对检测菌的MIC）
【影响因素】：培养基的pH、离子浓度、孵育时间和温度
【意义】：临床上较为广泛使用的定量耐药性检测方法，但一般不作为常规试验。用于：调差罕见耐药、调查药敏定性试验敏感但临床疗效不佳的原因、确定中介度的敏感性、有效选择二线药物、评价新药。微量液体稀释法可用于自动化。

球菌
是能引起人类化脓性感染的主要细菌，又称化脓性球菌，常见的有：葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、奈瑟菌属
一、葡萄球菌属
1、细菌菌落形态及色素的观察：普通培养基上形成直径2~3mm不透明的圆形凸起菌落，表面光滑，边缘整齐。产生金黄色、白色、柠檬色等脂溶性色素附着在菌落上。
金黄色葡萄球菌：血琼脂平板上菌落周围有透明溶血环（β-溶血）；能在含10%~15% NaCl琼脂中生长，甘露醇高盐平板上为黄色菌落。
2、镜下形态的观察：为革兰阳性球菌，散在或不规则葡萄状排列，无芽孢无荚膜。
3、生化反应
①触酶试验：
【原理】：某些细菌能产生过氧化氢酶，将对细菌有害的H2O2 分解成H2O、O2
【方法】：在洁净载玻片上，滴加3% H2O2溶液1~2d,用接种环挑取普通琼脂上的菌落，观察结果。
【结果】：产生大量气泡者（+），不产生气泡者（—）
【鉴别】：葡萄球菌（+）、链球菌（—）
②血浆凝固酶试验：
【原理】：金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中可溶性的纤维蛋白原变为不溶性的纤维蛋白，结合型血浆凝固酶附着于细菌表面，在玻片上形成凝块；游离型的血浆凝固酶则可使试管中的血浆发生凝固。试管法37 ℃孵育0.5h。
【方法】（玻片法）：取未稀释的新鲜兔血浆（或人血浆）和生理盐水各1滴，分别滴于载玻片的两端，挑取少量待检葡萄球菌，分别与生理盐水和血浆混合，立即观察结果。
【结果】：出现凝集现象者为阳性。鉴别： (金+ 表- 腐-)
③甘露醇发酵试验：
【原理】：致病性葡萄球菌多能发酵甘露醇产酸，使培养基中的指示剂变色（由紫色变为黄色）
【方法】: 将3种细菌分别接种于甘露醇发酵管，35℃孵育 18~24h，观察结果。
【结果判断】：培养基浑浊，由紫色变为黄色（+），仍为紫色（-）。鉴别： 金黄色葡萄球菌（+），表皮葡萄球菌（-），腐生葡萄球菌（-）
4、注意事项
①触酶试验不宜用血平板上的菌落，因红细胞内含有触酶，会出现假阳性反应；此外，陈旧培养物可丢失触媒活性，出现假阴性反应。因此每次做触酶试验一定要用阳性菌株和阴性菌株作对照。阳性对照可用金葡菌，阴性对照可用链球菌。
②在临床上，常遇到血浆凝固酶阴性的葡萄球菌，此时不能轻率作出非致病性葡萄球菌或污染菌的结论。血浆凝固酶阴性的葡萄球菌也可引起菌血症、尿路感染和心内膜炎等。
二、链球菌属
1、细菌菌落形态及溶血的观察：灰白色、圆形凸起、表面光滑、边缘整齐的针 尖样大小菌落，菌落周围出现不同的溶血：
根据血平板上的溶血情况分：
①甲型(α)：草绿色溶血环，
肺炎链球菌的菌落与甲型链球菌相似，，但培养2~3天后，因菌体发生自溶，菌落中性凹陷呈“脐状”。
②乙型(β)：透明溶血环。
③丙型(γ)：无溶血环。
2、细菌镜下形态观察：为革兰阳性球菌、圆形或卵圆形、成双或呈链状排列。链的长度因菌种和培养基而又明显差异，一般在液体培养基中易形成长链；肺炎链球菌为矛头状、成双排列的革兰阳性球菌，周围有空晕，此为荚膜。
3、生化反应
①杆菌肽敏感试验：
【原理】：A群化脓性链球菌对杆菌肽几乎 100%敏感， 而其他 链球菌对杆菌肽通常耐药。故此试验可对A群化脓性 链球菌进行鉴别。
【方法】：挑取被检的链球菌菌落，密集涂布于血琼脂平板上， 将杆菌肽纸片贴于血琼脂平板上，35℃孵育18~24h 观察结果(培养不需要放CO2)。
【结果】：在杆菌肽纸片周围出现明显抑菌环（＞10mm）为敏感试验阳性，抑菌环＜10mm为阴性（对杆菌肽耐受）。A群（+），其他群链球菌（-）
②CAMP试验：
【原理】：B群溶血性链球菌能产生“CAMP”因子，该物质可促进金黄色葡萄球菌β溶血素的活性，故在血琼脂平板上两 种细菌交界处溶血能力增强，形成箭头状透明溶血区。
【方法】：在血平板上，用金 葡菌划种一条横 线， 再将被检菌距金葡菌 接种线3mm处呈直角 接种一短线，35℃培 18~24h观察结果。
【结果】：如下图（黑色箭头所指部分）

③Optochin 敏感试验：
【原理】：Optochin （乙基氢化羟基奎宁）能干扰肺炎链 球菌叶酸合成，抑制该菌的生长，故肺炎链球菌对 Optochin 敏感，而其它链球菌对其耐药。
【方法】：挑取待检菌密集划线接种于血琼脂平板上，贴放 Optochin纸片，35℃孵育18~24h ，观察 抑菌环。
【结果】：抑菌圈直径≥14mm为敏感，肺炎链球菌（+）。抑菌圈直径＜14mm时，参照胆汁溶菌试验判断是肺炎链球菌还是甲型溶血性链球菌。
④胆汁溶菌试验
【原理】：胆汁或胆盐能活化肺炎链球菌的自溶酶，促进细菌 细胞膜破损或菌体裂解而自溶。
【方法】（平板法）：在血琼脂平板上选择出待检的呈草绿色 溶血的菌落，观察记录菌落特点，然后于菌落上滴1 滴100g/L去氧胆酸钠溶液，35℃孵育15~30min 观察 结果。
【结果】：菌落消失为阳性，菌落不消失为阴性。肺炎链球菌（+）、甲型链球菌（-）
⑤菊糖发酵试验：
【原理】：各种细菌含有分解不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也各不相同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
【方法】：将待检的细菌分别接种到菊糖培养基中，置35℃，5%CO2条件下，孵育18~24h观察结果。
【结果】：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示 剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），不分解糖则无 变化。 肺炎链球菌（+）、甲型链球菌（-）
⑥小白鼠毒力试验：
【原理】：小白鼠对肺炎链球菌十分敏感，少量有荚膜的肺炎 链球菌可使小白鼠感染致死。
【方法】：将平板上的肺炎链球菌用无菌生理盐水洗下，取0.1ml 注射于小白鼠腹腔，饲养1~2d，观察小白鼠情况。
【结果】：若小白鼠在1~2d内死亡为阳性，解剖腹膜印片、革 兰染色法镜检可见革兰阳性、有荚膜的双球菌。
4、注意事项
①近年来已发现对奥普脱欣耐药的肺炎链球菌。因此，若抑菌圈直径较小，应再做胆汁溶菌试验，已证实是否为肺炎链球菌。
②除肺炎链球菌外，约6%的B群链球菌及10~20 %的C群和G群链球菌对杆菌肽亦敏感。可借其他生化试验加以区分。
③胆汁溶菌试验中，去氧胆酸钠溶液在酸性条件下容易发生沉淀，故试验时若培养物为酸性，应先纠正pH为弱碱性后再进行试验。另外，胆汁或胆盐只能使活菌自溶，对死菌无效。
三、奈瑟氏菌属（微黄奈瑟菌）
1、培养特性和菌落观察：营养要求高，接种血平板或巧克力平板，置35℃ ，5%CO2条件下，孵育18~24h观察结果，可见圆形突起、光滑湿润、无色透明、边缘整齐、似露滴状 ，直径为2~3mm。（淋病奈瑟菌为圆形突起、半透明或不透明、无色或灰白色、边缘整齐、直径0.5~1.0 cm的小菌落）
2. GS染色，形态观察：G-双球菌、肾形/豆形、成双排列、凹面相对，多数在吞噬细胞内。
3、生化反应
氧化酶试验:
【原理】：某些细菌具有氧化酶，能将盐酸二甲基对苯二胺 或（盐酸四甲基对苯二胺）氧化成紫红色（蓝色）的醌类化合物。
【方法】：用滤纸条蘸取被检菌落少许，用滴管吸取氧化酶试 剂，滴加于滤纸条菌落上，观察颜色变化。
【结果】：阳性者立刻出现红色(蓝色)，继而逐渐加深，阴性不变色。奈瑟菌属（+）
菌种
氧化酶
葡萄糖
麦芽糖
蔗糖
硝酸盐还原
DNA酶
脑膜炎奈瑟菌
+
+
+
-
-
-
淋病奈瑟菌
+
+
-
-
-
-
4、注意事项
进行氧化酶试验时，应避免接触含铁物质，以防出现假阳性，并且最好选用铜绿假单胞菌作为阳性对照，大肠埃希菌为阴性对照。

肠杆菌科
【器材】
一、SS平板培养基：选择性培养基，有促进目的菌生长的物质和鉴别用指示剂.
1、煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等能抑制G+菌及大多数大肠生长，胆盐促进伤寒生长。
2、大肠分解乳糖产酸：中性红（6.8红－8.0黄）变红，与胆盐结合合成胆酸，因而形成中心混浊的深红色菌落，病原菌不分解乳糖，故菌落呈透明微黄色。
3、枸橼酸铁能指示硫化氢产生，硫化铁呈黑色
4、硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺、沙门菌的毒害作用，并中和煌绿、中性红染料的毒性，使大肠红色鲜明
二、KIA斜面培养基：用酚红作指示剂（ 6.8黄－8.4红）。上层为固体琼脂斜面，含乳糖。下层为半固体琼脂，含葡萄糖，含硫酸亚铁。
1、细菌如能发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则斜面及底层均呈黄色，且有气泡。非致病菌（如大肠埃希菌）一般既可利用乳糖也可利用葡萄糖，但肺克也是如此。
2、如细菌只发酵葡萄糖不发酵乳糖，因 葡:乳为1:10，斜面所产生的少量的酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色；底层则是在相对缺氧的状态下，所生成的酸不被氧化挥发而保持黄色。致病菌一般不能利用乳糖，可用于区别致病/非致病菌。
3、如细菌分解蛋白质产生硫化氢，则与硫酸亚铁反应生成硫化亚铁（黑色沉淀物），使培养基变黑。

左：不发酵乳糖，强产硫化氢。中：不发酵乳糖，不产硫化氢。右：发酵乳糖，不产硫化氢
4、接种方法：先穿刺到底，再在斜面划线。
【实验内容】
一、氧化酶试验
原理：见奈瑟菌属部分
操作：取氧化酶纸片，刮去KIA或普通平板或普通平板上的较大菌落，观察纸片颜色的变化，呈蓝紫色为阳性，不变为阴性（如试剂为盐酸二甲基对苯二胺，阳性者则为红色）。肠杆菌科多为阳性（但变形杆菌为阴性）。
注意事项：因SS培养基中的化学成分和生化反应复杂，其菌落可使滤纸变为紫红色，故对肠道杆菌进行触酶和氧化酶试验时，宜从普通平板或KIA斜面上取菌，以保证试验结果正确。
二、动力试验：
原理：有动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线扩散生长。
培养基：半固体培养基
方法：分别穿刺接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，37 ℃孵育16-18h
结果：穿刺线扩散，培养基透明度减低为动力阳性；穿刺线清晰，培养基透明为动力阴性。本试验，大肠为（+），肺杆为（-）
三、吲哚试验：（靛基质试验）
原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，与对二甲基氨基苯甲醛形成红色化合物。
培养基：蛋白胨水
方法：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白胨水培养基中，37 ℃孵育16-18h
结果：取出后，滴加吲哚试剂2d，混匀，可见培养物上层呈玫瑰红色为+，不变色为-。本试验，大肠为（+），伤寒为（-）
四、尿素酶试验：
原理：产生尿素酶的细菌能分解尿素，形成氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂变成红色。
培养基：尿素培养基
方法：将大肠埃希菌和变形杆菌分别接种于尿素培养基中，37 ℃孵育16-18h
结果：培养基变红色者为阳性。变黄为阴性。本试验，大肠为（-），变形为（+）
五、甲基红试验：
原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等，故培养物pH在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈红色。有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步转化为其它物质，如醇、酮等，培养基pH在6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色。
培养基：葡萄糖蛋白胨水
方法：分别接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌
结果：加入甲基红指示剂2d，混匀，红色为阳性，黄色为阴性。本试验，大肠为（+），肺杆为（-）
六、苯丙氨酸脱氨酶试验：
原理：某些细菌（如变形杆菌属），可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂与苯丙酮酸螯合后形成 绿色化合物。
培养基：苯丙氨酸琼脂培养基
方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌，37 ℃孵育16-18h
结果：滴加100 g/L三氯化铁试剂，出现绿色为+，不变为-。本试验，变形为（+），大肠为（-）
七、柠檬酸盐利用试验：
原理：当细菌可以利用铵盐作为唯一的氮源，同时利用柠檬酸钠作为唯一碳源时，可在柠檬盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，为柠檬酸盐利用试验阳性。若不能利用则不能生长，培养基不变色，为阴性。
培养基：西蒙柠檬酸盐培养基
方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌，37 ℃孵育16-18h
结果：大肠-（绿色），变形+（蓝色）
八、总结：结果判断与观察
KIA：观察上部和下部的颜色变化，变黄为产酸，变红为产碱，有气泡为产气，有黑色为产硫化氢。
动力（M）：半固体上沿穿刺线生长，周围清澈，为阴性，周围混浊者为阳性 。
吲哚（I）：在蛋白胨水中滴加靛基质试剂2-3滴，立刻变红者为阳性，不变为阴性。
尿素酶试验（U）：变为深粉红者为阳性，不变或变黄者为阴性。
甲基红试验（Mr）：在葡胨水中滴加甲基红试剂2-3滴，变红为阳性，变黄为阴性。
枸橼酸盐利用试验（C）：细菌在上生长，颜色变为蓝色为阳性，细菌不长或培养基颜色不变为阴性。
苯丙氨酸酶试验：在斜面上滴加１０％ＦｅＣｌ３试剂２－３滴，变成暗绿色为阳性，不变为阴性。

菌种
KIA
MIU
甲基红
（Mr）
枸橼酸
盐（C）
苯丙氨酸
斜面
底层
产气
硫化氢
动力
吲哚
脲酶
大肠埃希菌
A
A
+
-
+
+
-
+
-
-
福氏志贺菌
K
A
-/+
-
-
+/-
-
+/-
-
-
宋内氏志贺菌
K
A
-/+
-
+
-
-
+/-
-
-
伤寒沙门氏菌
K
A
-
+/-
+
-
-
+
+/-
-
甲型副伤寒菌
K
A
+
-/+
+
-
-
+
-
-
乙型副伤寒菌
K
A
+
+
+
-
-
+
+
-
肺炎克雷伯菌
A
A
+
-
-
-
+
-
+
-
变形杆菌
K
A
+
+
+
+
+
+
+/-
+
【其他试验】
一、大肠埃希菌
1、形态结构观察：革兰阴性、中等大小、两端钝圆、多呈单个散在分布的杆菌。鞭毛染色为周毛菌
2、菌落观察：在普通琼脂平板上呈圆形、灰白色、湿润、光滑型菌落；在血琼脂平板上呈圆形、灰白色、湿润、光滑型菌落，某些菌株有β溶血；在SS琼脂平板上呈红色、圆形、凸起、边缘整齐的菌落，多数为光滑型菌落。
二、志贺菌属
1、形态结构观察：为格兰阴性杆菌，散在分布，多无鞭毛
2、菌落观察：在SS和MAC平板上形成无色透明、中等大小的菌落，除宋内氏志贺菌外，菌落均为光滑型。
3、血清学试验：凡生化反应符合志贺菌属者均需做血清学鉴定。
①方法：取一环志贺菌四种多价血清与载玻片一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与之混合，同时在另一端取待测菌与生理盐水混合对照。
②结果判定：对照呈均匀浑浊，待检菌与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用A/B/C/D群最常见的单价血清凝集定种。

血清型
A
B
C
D
菌名
痢疾
福氏
宋内氏
鲍
③报告：分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细菌”。经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报告“分离出XX志贺菌”，若进一步做多种生化反应及因子血清分型后，可报告“分离出XX志贺菌X型”。
三、伤寒沙门菌属
1、形态结构观察：沙门菌属为革兰阴性细长杆菌，鞭毛染色可见周鞭毛。
2、菌落观察：在SS和MAC平板上形成无色、半透明、光滑湿润、凸起的小菌落，产硫化氢的菌种可在SS平板上形成中心带黑褐色的小菌落。
3、血清学试验：若生化反应及形态学检查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集试验.
①方法：首先选用A~F组多价“O”诊断血清做玻片凝集试验。在试验时以生理盐水作对照。本试验在5~10 min内不出现凝集者可确定为阴性。但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi凝集试验，若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下，制成浓厚的悬液，100℃加热30min，再与A~F组多价“O”诊断血清做玻片凝集试验。若与A~F组多价“O”血清发生凝集，应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。一般先选用本地区检出率最高的菌型的相应血清做玻片凝集。若已确定哪一沙门菌种后，再分别先用H因子血清检查第 I 相抗原，然后检查第 II 相抗原，最后确定该菌种属于哪一型沙门菌。

群
A
B
C
D
E
菌体抗原(O)
2
4
7
9
3
鞭毛抗原（H）
a
b
c
d
e
菌种
甲型副伤寒
（PA）
乙型副伤寒
（PB）
丙型副伤寒
（PC）
伤寒沙门菌
鸭沙门菌
②报告：分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌者，可报告“未分离出沙门菌”。生化反应符合沙门菌，玻片凝集试验阳性者，可初步报告为“分离到XX沙门菌”或“X群沙门菌”。
三、肺炎克雷伯菌
1、形态结构观察：为无芽孢格兰阴性杆菌，呈卵圆形或球杆状，常呈双排列，无鞭毛。
2、菌落观察：在血琼脂平板上形成圆形、凸起、灰白色、不溶血、光亮的大菌落，相邻菌落易于融合，黏液状，若用接种针蘸取呈长丝状拽起。在MAC平板上呈乳糖发酵产酸的菌落，即红色、较大、浑浊、凸起的粘液型菌落，较大肠埃希菌大。
与大肠埃希菌鉴别

I
M
Vi
C
大肠埃希菌
+
+
-
-
肺炎克雷伯菌
-
-
+
+
四、变形杆菌
1、形态结构观察：为革兰阴性杆菌，两端钝圆，有明显多形性，在一定条件下可形成球杆状或丝状；无芽孢和荚膜，鞭毛染色为周鞭毛。
2、菌落观察：在营养琼脂平板上呈波纹状迁徙生长现象；在SS琼脂平板上呈无色、圆形、中等大小的乳糖不发酵型菌落，中心通常为灰褐色。

非发酵菌
是一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、无芽胞的革兰阴性杆菌；多为条件致病菌。
【氧化酶试验】铜绿、粪产碱为阳性，醋酸钙不动杆菌为阴性
【非发酵菌生化编码管鉴定】
原理：该系列鉴定共有9种生化培养基，共10项试验，参照下述方法，将试验结果换算成4位数字，加以数值化后查表。
例：某一分离菌株，具有下列鉴定结果，数值化后为1734，查表得知：可能为施氏假单胞菌和洋葱单胞菌，再按表中要求做硝酸盐产气补充实验区分。

观察结果时按表中说明进行。

一、O-F试验
接种2支编码管，1支加无菌石蜡油，另1支不加。
原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。
培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；培养基表面和底部都产酸（变黄）为发酵型；培养基表面变为深蓝色为产碱型；培养基表面变黄、底部不色变为氧化型。
二、硝酸盐还原试验
原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐，生成亚硝酸盐和氮气等。硝还试验是测定还原过程中生成的亚硝酸盐。如培养基中有亚硝酸盐存在，则亚硝酸盐与醋酸生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸生成重氮苯磺酸，后者与α-萘胺结合成N-α-萘胺偶氮苯磺酸。假单胞菌等能使硝酸或亚硝酸盐还原为氮气，此为脱硝化或脱氮化作用。
注意事项：若加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否已被还原，可于原试管内再加入少许锌粉，如出现红色，表示硝酸盐仍然存在；若不出现红色，表示硝酸盐已衩还原为氨和氮。
结果解释：

【鞭毛染色】
普通染色法一般无法看到鞭毛，要用特殊染色的方法，常采用镀银染色法和鞭毛染色法等，本次实验采用镀银染色法。
方法与原理：在无菌平皿中加10mL左右蒸馏水，用接种环挑一环铜绿假单胞菌，在水面轻轻飘散，可适当研磨，静置10分钟，菌体内部相比蒸馏水为高渗环境，故蒸馏水大量进入菌体，使包括鞭毛在内的菌体胀大，使鞭毛得以被看到。从表面取一环菌液加在洁净玻片上，室温或温箱内烘干，不可火焰固定，加甲液染15分钟，流水下冲洗，加乙液染10分钟，使银均匀附着在需要镀银的菌体上，洗去染液，吸干后油镜观察，可见铜绿假单胞菌为单鞭毛，变形杆菌为周鞭毛。
【其他试验】
一、铜绿假单胞菌
1、培养特点及菌落特征：在普通琼脂平板上形成圆形、大小不一、边缘不整齐、扁平、光滑、湿润而常呈融合状态的菌落，并产生特征性的蓝绿色水溶性绿脓素和黄绿色青脓素，血平板上形成大而扁平，湿润，边缘不齐，有金属光泽，有生姜气味的灰绿色菌落，并形成透明溶血环。SS平板上形成类似沙门菌的乳糖不发酵菌落，较浑浊，48h后菌落中央也呈绿色。MAC平板上可形成微小、半透明菌落，48h后菌落中央常呈绿色。其最适生长温度35℃，4℃不生长，42℃可生长。
2、形态观察：为革兰阴性杆菌，菌体长短不一，常呈多形性；不染色标本的动力观察：运动活跃；鞭毛染色，一端有1~3根鞭毛。
95%以上的铜绿假单胞菌可通过观察以下几个特征而得到鉴定：氧化酶阳性（10秒内）。菌落较大，生姜样气味。绿脓素产生。少数铜绿假单胞菌可产生其他颜色色素，如红脓素（红色），黑脓素（棕色到黑色），青脓素（黄色）。
注意事项：从临床分离的菌株中有部分不产色素（约占10%），尤其是从痰液中分离的菌落为粘液型的铜绿假单胞菌，常不产生色素，但在室温中移种数代后可恢复典型菌落和产色素能力。对于这些不产色素的铜绿假单胞菌，可通过硝还试验，或产生氮气，42℃生长以及在含20.g/L的硫酸镉琼脂生长加以确定。
二、粪产碱杆菌
1、菌落观察：在血平板上形成灰色、扁平、较大、边缘薄、不整齐的菌落，不溶血，有水果味，并在菌落下方的血琼脂上呈明显的绿色；在SS和MAC平板上形成无色透明或淡黄色的乳糖不发酵型菌落，有少数菌株在SS平板上不生长。
2、形态观察：为革兰阴性球杆菌，常单个存在，鞭毛染色为周鞭毛。
三、醋酸钙不动杆菌
1、菌落观察：在血平板上形成圆形、凸起光滑、边缘整齐、不透明、灰白色、有粘性的菌落，多数菌株不溶血；其菌落较大，直径约2~3 mm，在SS平板上仅少数菌株生长；在MAC平板上可形成淡黄色菌落。

弧菌
一、霍乱弧菌
１、培养特点和菌落观察：霍乱弧菌在碱性培养基上生长良好，因此常用碱性蛋白胨水（PH8.4)增菌，在选择性培养基TCBS（硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂）上菌落中等大小，光滑，湿润，呈黄色，菌落周围也呈黄色。
2、形态观察：为革兰阴性菌，弧形或逗点状，排列似“鱼群”样，压滴法动力试验呈穿梭样运动
3、生化反应：KIA/MIU（K A - - / + + -），氧化酶（+），粘丝试验（+）
鉴定要点：临床水样便直接镜检可见“鱼群样”细菌运动，直接滴加霍乱抗血清，可见运动受限（制动试验），GS染色为阴性弧菌形态，在碱性蛋白胨水中生长良好，在TCBS上呈黄色菌落，血清学凝集鉴定到型。
二、副溶血弧菌
１、培养特点和菌落观察：副溶血弧菌在普通平板上生长不良，在高盐琼脂上生长良好，菌落较大，在选择性培养基TCBS（硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂）上菌落中等大小，光滑，湿润，不发酵蔗糖，因此呈绿色或蓝绿色。
2、形态观察：挑取高盐培养基上的菌落做GS，为革兰阴性菌，呈弧形、棒状、卵圆形等多形态性，排列不规则，散在或成对。
3、生化反应：KIA/MIU（K A - - / + + -），氧化酶（+）
鉴定要点：氧化酶阳性，具有嗜盐性，在3.5%-7%的高盐培养基上生长良好。KIA上为K/A型。
三、亲水气单胞菌
１、培养特点和菌落观察：亲水气单胞菌在普通平板上生长良好，在高盐琼脂和TCBS上不长，菌落中等大小，光滑，湿润。
2、形态观察：挑取普通培养基上的菌落做GS，可见革兰阴性杆菌形态。
鉴定要点：氧化酶阳性，在无盐肉汤中生长，在高盐肉汤中不长，KIA上为K/A型。
与副溶血弧菌的比较：

MIU
NaCl
动力
吲哚
脲酶
无
3.5%
7.0%
10%
副溶血弧菌
+
+
-
-
+
+
-
亲水气单胞菌
+
+
-
+
+
-
-

需氧革兰阳性杆菌
一、炭疽芽胞杆菌
1、GS染色：G+大杆菌，呈矩形，短链状或竹节状，无鞭毛，陈旧培养物上可见芽孢小于菌体，有毒株可形成荚膜。
2、菌落形态：在普通琼脂平板上可形成扁平粗糙，灰白色，不透明、无光泽、边缘不整齐的菌落，直径2~4 mm，低倍镜下可观察到卷发状菌落，
3、串珠试验：将新鲜炭疽杆菌肉汤培养物用棉签均匀涂布于血平板上，干后贴5-6张青霉素药敏纸片，35°C孵育2小时左右，用接种环在纸片周边盲目刮取培养物（注意不可刮到琼脂)进行涂片，注意涂片范围小些，尽量涂厚些，涂片固定后进行GS，可见炭疽杆菌因细胞壁受损，菌体膨大形成串珠样。
二、蜡样芽胞杆菌
1、GS：G+大杆菌，两端钝圆、短链杆状排列，无荚膜，有周鞭毛，培养6小时后可见小于菌体的圆形芽孢。
2、菌落