新版管理方法与艺术平时作业.doc

PAGE胶电泳、转膜试验技术专辑
电泳
带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不一样而达成分离技术称为电泳技术。1937 年瑞典学者 A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪 ，分离了马血清白蛋白3种球蛋白，创建了电泳技术。

PAGE配胶试剂和配方百分比对电泳结果质量当然有决定性影响,配胶百分比，在《分子克隆》上有详细阐述。也可选择已经凝好预制胶，各种配方各种百分比各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，试验结果更漂亮，分辨率高，尤其是重复性好，条带完美。{ 拜力生物为您准备了全部电泳试剂，包含上样buffer，SDS-PAGE配胶试剂盒，电泳buffer、蛋白Marker和蛋白染色试剂盒。第一步：依照目标蛋白分子量大小选择适宜凝胶浓度进行凝胶配制，能够使用SDS－PAGE凝胶配制试剂盒。第二步：进行蛋白变性，样品先置95℃水浴加热5分钟，接着置冰浴中5分钟，10000g离心20分钟，取上清液（样品可立刻使用也能够分装冻存，-20℃可稳定保持数月）。蛋白上样缓冲液能够使用5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。第三步依次加入预染蛋白分子量标准和待分析样品。）}
基本操作流程：
提取细胞或组织蛋白、测定大致含量
↓
制备SDS-PAGE胶
↓
蛋白样品变性、电泳
↓
电泳转膜
↓
封闭（1小时）
↓
一抗(3小时左右或4度过夜) 
↓
TBST洗涤（洗三遍）
↓
HRP标识二抗（1小时）
↓
TBST洗涤（洗四遍）
↓
ECL试剂作用
↓
X-光片曝光、显影
↓
结果分析
详细操作流程 
1.试剂配制与订购
1.1 .SDS-PAGE蛋白上样缓冲液
1.2 SDS-PAGE凝胶配制
1M Tris-HCl （pH6.8）:称取24.23g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调整pH值至6.8（约14ml），定容至200ml，121oC 20min灭菌，室温保留。
1M Tris-HCl （pH8.0）:称取24.23g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调整pH值至8.0（约8.4ml），定容至200ml，121℃20min灭菌，室温保留。
1.5M Tris-HCl （pH8.8）:称取36.34g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调整pH值至8.8（约5ml），定容至200ml，121℃20min灭菌，室温保留。
10%（W/V）SDS:称取50gSDS，加400ml dd H2O，68℃加热溶解。滴加浓HCl调整pH值至7.2，定容至500ml，室温保留。
30%（W/V）Acrylamide:称取29g Acrylamide，1g N，N’-至甲双丙烯酰胺（BIS），加dd H2O溶解，定容至100ml，用0.45m滤膜滤去杂质，4℃避光保留。
0.02M PH 7.2 PBS：称取Na2HPO4·12H2O 5.8g，NaH2PO4·2H2O 0.59g，NaCl 8.5g，定溶至1000ml蒸馏水中。
10%（W/V）过硫酸铵:称取0.1g过硫酸铵，加1ml dd H2O 充分溶解，4℃保留（使用期约为两周）。
1.3 SDS-PAGE电泳液
5×Tris-Glycine Buffer （SDS-PAGE电泳缓冲液）:称取15.1g Tris，94g Glycine，5gSDS，加ddH2O 充分溶解，定容至1L，室温保留。
1×Tris-Glycine Buffer （SDS-PAGE电泳缓冲液）:量取200ml 5×Tris-Glycine Buffer，定溶至1L，混匀，室温保留。
1.4 NC膜（硝酸纤维素膜）PVDF膜
1.5 Western转膜液
称取2.9g Glycine，5.8g Tris，0.37g SDS，加ddH2O 充分溶解，定容至800ml，加入200ml甲醇，混匀，室温保留。
1.6 洗涤液
20×TBS:称取88g NaCl，加dd H2O充分溶解，加入100ml 1M Tris·HCl（pH8.0），定容至500ml，室温保留。
TBST Buffer:量取50ml 20×TBS，0.5ml Tween 20，加dd H2O定容至1L，混匀，室温保留。
1.7 封闭液
称取5g脱脂奶粉，加入100ml TBST Buffer中，充分溶解，4 oC保留。
1.8 一抗，二抗
1.9 EasySee Western Blot Kit
1.10 marker
1.11 BCA蛋白定量试剂盒

2. 蛋白样品制备
2.1蛋白粗提
在人体中IgG占总抗体80%，成人血清中含量为12.5%/ml左右，IgG粗纯通惯用饱和(NH4)2SO4(SAS)进行，通常操作以下：
1）8ml血清中加入8ml PBS（0.02 PH7.0），混匀后滴加4ml SAS,使其终浓度为20%（目标是除去纤维蛋白原）。
2）4℃，1h后7000rpm离心10min。
3）留上清，补加12ml SAS，边振荡另滴加。（终浓度为50%，可除去AIb）
4）4℃，1h后，7000rmp离心10min。
5）留沉淀溶于10ml PBS中，滴加5ml SAS，然后4℃，1h后，7000rmp离心10min。
6）弃上清，沉淀溶于10ml PBS，滴加5ml SAS。
7） 5）至6）重复三次
8）弃上清，沉淀溶于4ml PBS中，PBS透析过夜（400ml）
结果：①整个试验需7h，注意在离心前离心机应降温。
②粗提IgG抗体免疫反应可达成70%-80%。
③此浓度只针对IgG抗体，若分子量不一样使用SAS浓度也不一样。
④操作中应尽可能让蛋白少起泡，预防变性降低蛋白损失。

2.2 试剂盒提取（RIPA lysis buffer为例
2.2.1 对于培养细胞样品：1）融解RIPA裂解液，混匀。取适当量裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF最终浓度为1mM。2）对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS或无血清培养液洗一遍(假如血清中蛋白没有干扰，能够不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液百分比加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。 对于悬浮细胞：离心搜集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液百分比加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有显著细胞沉淀。假如细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续PAGE、Western和免疫沉淀等操作。裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够，但假如细胞密度非常高能够适当加大裂解液用量到200微升或250微升。

2.2.2 对于组织样品：1）把组织剪切成细小碎片。2）融解RIPA裂解液，混匀。取适当量裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF最终浓度为1mM。3）按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液百分比加入裂解液。假如裂解不充分能够适当添加更多裂解液，假如需要高浓度蛋白样品，能够适当降低裂解液用量。4）用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。5）充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续PAGE、Western和免疫沉淀等操作。6）假如组织样品本身非常细小，能够适当剪切后直接加入裂解液裂解，经过强烈vortex使样品裂解充分。然后一样离心取上清，用于后续试验。直接裂解优点是比较方便，无须使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。 

注：RIPA裂解液裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等复合物。在不检测和基因组DNA结合尤其紧密蛋白情况下，能够直接离心取上清用于后续试验；假如需要检测和基因组结合尤其紧密蛋白，则能够经过超声处理打坏打散该透明胶状物，随即离心取上清用于后续试验。假如检测一些常见转录因子，比如NF-kappaB、p53等时，通常无须进行超声处理，就能够检测到这些转录因子。 

3 蛋白样品初步定量（详细步骤见BCA试剂盒说明书） 
蛋白质定量方法比较多，现在用得比较多是 BCA 法，其基本原理为要分析蛋白在碱性溶液里与 Cu2+反应产生 Cu+，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562nm波长。此化合物与蛋白浓度线性关系极强，反应后形成化合物非常稳定。经过标准曲线能够确定对应样品蛋白浓度，详细操作步骤能够参考试剂盒说明书。Western Blot 对蛋白浓度检测要求通常>1ug/ul，大部分培养细胞或者组织都是能够满足，注意因为测定是总蛋白浓度，而非特异性蛋白量，有时可能会出现测量总蛋白含量很高，做WB时却求检测到目标蛋白条带，就是因为特异性蛋白质表示很低。所以这步只具备参考意义。在后面检测中，都平行做内参检测，以确定电泳系统质控。 

4 SDS-PAGE电泳 
（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗涤灵轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗洁净后立在架子上晾干后，确保玻璃板上无污性方可使用。 
（2）灌胶与上样 
① 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶，整个操作应轻柔，夹子平行按下，以免玻璃板破碎） 
②制备分离胶（pH 8.8）（试剂配方详见最终附表）

灌胶时，可用1ml枪吸收1ml胶沿玻璃放出，溶液迟缓加入到装配好板中至凝胶高度为6 cm左右，预留1.5 cm高度配制浓缩胶。然后胶上加一层水，液封后胶凝得更加快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这么胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，不然胶会被冲变型。）室温放置0.5－1小时左右至聚合完全。 
③ 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干（注意吸水纸不可触及分离胶）。
④ 制备浓缩胶（PH6.8）：

将剩下空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。因为胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔上样体积减小，所以在浓缩胶凝固过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子两边竖直向上轻轻将其拔出。凝胶聚合约0.5－1小时左右。 
⑤将其放入电泳槽中，可用200ul枪吸收电泳液将胶里各个孔轻轻吹吸几下，可将孔内气泡及碎胶赶出。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块WB专用玻璃板） 
⑥ 取提取好蛋白，约10－15ul与5×SDS上样缓冲液按5：1百分比混合，加到1.5ml离心管中，然后沸水中煮3－5min使蛋白完全变性。 
⑦ 电泳：电泳电压为100V很好，也可用120－150V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，时间长短依照检测蛋白质大小确定，然后进行转膜。
注意：1）10%APS需现用现配，或配好分装后放入-20度以下冻存，通常4度保留APS使用时间最好不好超出一个星期。不然易造成胶不凝。
2）丙烯酰胺、TEMED均为毒性物质，使用时禁止与皮肤接触。
3）配制Tris-Cl时，严格控制好其PH值，这对于蛋白分离至关主要。

5 转膜 
试验前准备工作 
1）、制备足够转移缓冲液以充满转移槽，另外准备200 ml用于平衡凝胶和膜以及润湿滤纸。 
2）、从玻璃板上取下凝胶，去除全部浓缩胶。 
3）、将凝胶浸入转移缓冲液中15-30分钟。 
4）、滤纸在转移缓冲液中最少浸泡30秒。 
5）、准备膜： 
a、硝酸纤维素膜：将膜进入转移缓冲液中15-30分钟 
b、PVDF膜（PVDF膜具备愈加好蛋白吸附、物理强度以及具备愈加好化学兼容性，依照目标蛋白大小选择膜孔径大小，有0.45um和0.22um）
在甲醇中润湿膜15秒，确保膜由不透明变成半透明。 
小心将膜放入双蒸水水中浸泡 2 分钟。 
小心将膜放入转移缓冲液中平衡最少 5 分钟。 
① 将夹子打开使黑一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒单个方向（往返赶轻易使胶破裂）赶几遍以赶走里面气泡（一手赶另一手要压住垫子使其不能随便移动）。在垫子上垫三层滤纸（可边滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套， 试验室要开门以使空气流通。） 
③ 将夹子放入转移槽槽中，要使夹黑面对槽黑面，夹红面对槽红面。电转移时会产热，在槽一边放一块冰来降温。转膜装置置于冰水中，打开电源30 mA过夜或200mA 2小时。 
④ 转完后在膜上做个记号，以判断膜正反面，转膜结束后，若看见预染Marker条带，说明转膜成功。三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中气泡 
② 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬时候动作要轻，要在两个边上轻轻重复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要防止把分离胶刮破，同时在胶右上角做个记号。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最终盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不停擀去气泡。

6免疫反应 
（1）将膜用TBST从下向上浸湿后，移至含有封闭液平皿中，室温下,用封闭液在脱色摇床上摇动封闭2h或者４度过夜，假如预试验做完后，发

床上摇动封闭2h或者４度过夜，假如预试验做完后，发觉背景比较高，能够适当延长封闭时间。 
（2）将一抗用封闭液稀释液（如回收，请用专用稀释液稀释）稀释至适当浓度；通惯用自封袋装溶液（在平皿中反应也能够），溶液体积大约1-5ml，从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后（无须洗涤），将膜蛋白面朝上放于抗体液面上，脱色摇床上37℃孵育3h 后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min，假如预试验发觉背景比较高，可适当增加洗涤和洗涤时间；假如预试验发觉条带较淡，能够一抗４℃过夜孵育。 
（3）同上方法准备二抗稀释液（可用封闭液）并与膜接触，37℃孵育1h 后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min；假如预试验发觉背景比较高，可适当增加洗涤和洗涤时间；假如预试验发觉条带较淡，能够二抗能够适当增加孵育时间。

7 ECL化学发光，显影、定影（可购置显影定影试剂盒） 
（1）将A和B两种试剂在离心管中等体积混合；1min后，将溶液平铺在膜蛋白面，暗室反应2min后去尽残液，包好，放入X-光片夹中。 
（2）在暗室中，将影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；依照信号强弱适当调整曝光时间，通常为1min到5min，也可选择不一样时间数次压片，以达最好效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，快速浸入显影液中显影，待出现显著条带后，即刻终止显影。显影时间通常为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间通常为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留定影液后，室温下晾干。 

8 凝胶图象分析 
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标条带和内参条带净光密度值以及它们比值。