病毒诱导的基因沉默试验流程.doc

操作方法1：
1. 催芽，播种于含灭菌土的育苗盘中，待4-5叶期为合适苗龄。
2. 将含有pTV00（带目的基因）和pBINTR6的农杆菌从-70℃冰箱取出，在含有Kan50 mg/L、Rif100 mg/L和Tet 5mg/L的LB/YEB固体培养基上划线培养，28℃，48h。挑取单一菌落在含有Kan50 mg/L、Rif100 mg/L 和Tet5mg/L 的LB/YEB液体培养基中转速250 r/min，温度28℃，培养OD值约0.6-0.8。（大于24h？）
3. 取含有pTV00和pBINTR6的农杆菌GV3101 1：1混合，6000 r·min-1离心10min，弃去培养基，加入等体积MMA缓冲液，再将菌液室温下放置3h。
4. 拔出幼苗，剪去根尖，用菌液浸泡根5min。定植。用不带针头的注射器，将步骤3中准备好的混合菌液从嫩叶背面注射进叶片（约5ml/株）。剩余菌液灌根。
将注射后的植株放置在温度16℃的培养箱内，黑暗培养，50%RH，24h。
放置在温度低于24℃的培养箱内（20～22℃），光照16/8，50%RH。
5. 结果观察，14d后正对照（PDS基因沉默）植株新叶会出现光漂白现象，负对照无任何现象发生。
6. 14天后，接种南方根结线虫200条/株。（30天）
7. 接种30天后，观察统计卵块根结数量。

5月23日
处理数：黄瓜、番茄各7个。5个带目的基因的pTV00载体菌株，1个正对照连接PDS基因的pTV00载体菌株，1个负对照空的pTV00载体菌株。
苗数：280株。每个处理20株，每个处理共140株。
处理液：每个处理500ml，其中浸根150ml/30株，注射5ml×30株，误差200ml。其中，目的基因菌液/MMA各250ml。
则，含目的基因的农杆菌GV3101菌液量共250ml×7；含有pBINTR6的农杆菌GV3101菌液量1750ml （250ml×7个处理）。
培养基质：草炭过筛，与蛭石、珍珠岩1：1：1混和。

MMA缓冲液
（10mmol/L MgCl2；150μmol/L 已酰丁香酮；1mmol/L 2-N-吗啉基乙磺酸MES）
储存液配制
500mmol/L MgCl2·6H2O（50×）：10.1g MgCl2·6H2O固体溶于100mL蒸馏水中。
100mmol/L MES（10×）：1.952gMES固体溶于100mL蒸馏水中。
74mmol/L 已酰丁香酮（AS）（500×）：145mg已酰丁香酮溶于10mL无水乙醇。
工作液配制（100mL）
500mmol/L MgCl2·6H2O（50×）2mL
100mmol/L MES（10×）10mL
加入蒸馏水至100mL，过滤灭菌存于4℃冰箱，用之前加入74mmol/L已酰丁香酮（AS）（500×）0.2mL（或直接加AS 29mg/L工作液）

pTV00 Key to sequence annotation; www.ayeaye.tsl.ac.uk
Green plasmid backbone sequence
Blue sequence inserted to the pTV00 or pGR107 vectors
Red CaMV 35S promoter sequence
UPPER-CASE tobravirus cDNA sequence
Violet Nopaline synthase terminator sequence
UPPER-CASE AND BOLD Arabidopsis NIA1-intron 3 sequence
Lower-case and bold CaMV35S terminator sequence
Dark green Tobacco rattle virus genes for coat protein（CP）
nptI

1 TTTTTATCCC CGGAAGCCTG TGGATAGAGG GTAGTTATCC ACGTGAAACC GCTAATGCCC
61 CGCAAAGCCT TGATTCACGG GGCTTTCCGG CCCGCTCCAA AAACTATCCA CGTGAAATCG
121 CTAATCAGGG TACGTGAAAT CGCTAATCGG AGTACGTGAA ATCGCTAATA AGGTCACGTG
181 AAATCGCTAA TCAAAAAGGC ACGTGAGAAC GCTAATAGCC CTTTCAGATC AACAGCTTGC
241 AAACACCCCT CGCTCCGGCA AGTAGTTACA GCAAGTAGTA TGTTCAATTA GCTTTTCAAT
301 TATGAATATA TATATCAATT ATTGGTCGCC CTTGGCTTGT GGACAATGCG CTACGCGCAC
361 CGGCTCCGCC CGTGGACAAC CGCAAGCGGT TGCCCACCGT CGAGCGCCAG CGCCTTTGCC
421 CACAACCCGG CGGCCGGCCG CAACAGATCG TTTTATAAAT TTTTTTTTTT GAAAAAGAAA
481 AAGCCCGAAA GGCGGCAACC TCTCGGGCTT CTGGATTTCC GATCCCCGGA ATTAGATCTC
541 AAACAAACAC ATACAGCGAC TTAGTTTACC CGCCAATATA TCCTGTCAAG GCCTTCATGT
601 TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG
661 ATACCGCTCG CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG
721 AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC
781 ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC
841 TCACTCATTA GGCACCCCAG GCTTTACACT TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA
901 TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATGATTAC GCCAAGCTCG
961 GAATTAACCC TCACTAAAGG GAACAAAAGC TGGAGCTCCA CCGCGGTGGA GCTCCACCGG
1021 GGAAACCTCC TCGGATTCCA TTGCCCAGCT ATCTGTCACT TTATTGAGAA GATAGTGGAA
1081 AAGGAAGGTG GCTCCTACAA ATGCCATCAT TGCGATAAAG GAAAGGCCAT CGTTGAAGAT
1141 GCCTCTGCCG ACAGTGGTCC CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAGCAT CGTGGAAAAA
1201 GAAGACGTTC CAACCACGTC TTCAAAGCAA GTGGATTGAT GTGATATCTC CACTGACGTA
1261 AGGGATGACG CACAATCCCA CTATCCTTCG CAAGACCCTT CCTCTATATA AGGAAGTTCA
1321 TTTCATTTGG AGAGGCTAGA TAAAACATTG CACCTATGGT GTTGCCCTGG CTGGGGTATG
1381 TCAGTGATCG CAGTAGAATG TACTAATTGA CAAGTTGGAG AATACGGTAG AACGTCCTTA
1441 TCCAACACAG CCTTTATCCC TCTCCCTGAC GAGGTTTTTG TCAGTGTAAT ATTTCTTTTT
1501 GAACTATCCA GCTTAGTACC GTACGGGAAA GTGACTGGTG TGCTTATCTT TGAAATGTTA
1561 CTTTGGGTTT CGGTTCTTTA GGTTAGTAAG AAAGCACTTG TCTTCTCATA CAAAGGAAAA
1621 CCTGAGACGT ATCGCTTACG AAAGTAGCAA TGAAAGAAAG GTGGTGGTTT TAATCGCTAC
1681 CGCAAAAACG ATGGGGTCGT TTTAATTAAC TTCTCCTACG CAAGCGTCTA AACGGACGTT
1741 GGGGTTTTGC TAGTTTCTTT AGAGAAAACT AGCTAAGTCT TTAATGTTAT CATTAGAGAT
1801 GGCATAAATA TAATACTTGT GTCTGCTGAT AAGATCATTT TAATTTGGAC GATTAGACTT
1861 GTTGAACTAC AGGTTACTGA ATCACTTGCG CTAATCAACA TGGGAGATAT GTACGATGAA
1921 TCATTTGACA AGTCGGGCGG TCCTGCTGAC TTGATGGACG ATTCTTGGGT GGAATCAGTT
1981 TCGTGGAAAG ATTTGTTGAA GAAGTTACAC AGCATAAAAT TTGCACTACA GTCTGGTAGA
2041 GATGAGATCA CTGGGTTACT AGCGGCACTG AATAGACAGT GTCCTTATTC ACCATATGAG
2101 CAGTTTCCAG ATAAGAAGGT GTATTTCCTT TTAGACTCAC GGGCTAACAG TGCTCTTGGT
2161 GTGATTCAGA ACGCTTCAGC GTTCAAGAGA CGAGCTGATG AGAAGAATGC AGTGGCGGGT
2221 GTTACAAATA TTCCTGCGAA TCCAAACACA ACGGTTACGA CGAACCAAGG GAGTACTACT
2281 ACTACCAAGG CGAACACTGG CTCGACTTTG GAAGAAGACT TGTACACTTA TTACAAATTC
2341 GATGATGCCT CTACAGCTTT CCACAAATCT CTAACTTCGT TAGAGAACAT GGAGTTGAAG
2401 AGTTATTACC GAAGGAACTT TGAGAAAGTA TTCGGGATTA AGTTTGGTGG AGCAGCTGCT
2461 AGTTCATCTG CACCGCCTCC AGCGAGTGGA GGTCCGATAC GTCCTAATCC CTAGGGATTT
2521 AAGGACGTGA ACTCTGTTGA GATCCTAGAA CTAGTGGATC CCCCGGGCTG CAGGAATTCG
2581 ATATCAAGCT TATCGATACC GTCGACCTCG AGGGGGGGCC CGGTACCCAA TTCGCCCTAT
2641 AGTGAGTCGT ATTACGCGCG CTCACTGGCC GTCGTTTTAC AACGTCGTGA CTGGGAAAAC
2701 CCTGGCGTTA CCCAACTTAA TCGCCTTGCA GCACATCCCC CTTTCGCCAG CTGGCGTAAT
2761 AGCGAAGAGG CCCGCACCGA TCGCCCTTCC CAACAGTTGC TAAACTACGG TTCTTTAAGT
2821 AGATCCGTGC CTGAAGTTTT AGGTTCAATT TAAACCTACG AGATTGACAT TCTCGACTGA
2881 TCTTGATTGA TCGGTAAGTC TTTTGTAATT TAATTTTCTT TTTGATTTTA TTTTAAATTG
2941 TTATCTGTTT CTGTGTATAG ACTGTTTGAG ATCGGCGTTT GGCCGACTCA TTGTCTTACC
3001 ATAGGGGAAC GGACTTTGTT TGTGTTGTTA TTTTATTTGT ATTTTATTAA AATTCTCAAC
3061 GATCTGAAAA AGCCTCGCGG CTAAGAGATT GTTGGGGGGT GAGTAAGTAC TTTTAAAGTG
3121 ATGATGGTTA CAAAGGCAAA AGGGGTAAAA CCCCTCGCCT ACGTAAGCGT TATTACGCCC
3181 TCGAGTATCG AATTCCTGCA GGCATGCAAG CGATCCCCGA TCGTTCAAAC ATTTGGCAAT
3241 AAAGTTTCTT AAGATTGAAT CCTGTTGCCG GTCTTGCGAT GATTATCATA TAATTTCTGT
3301 TGAATTACGT TAAGCATGTA ATAATTAACA TGTAATGCAT GACGTTATTT ATGAGATGGG
3361 TTTTTATGAT TAGAGTCCCG CAATTATACA TTTAATACGC GATAGAAAAC AAAATATAGC
3421 GCGCAAACTA GGATAAATTA TCGCGCGCGG TGTCATCTAT GTTACTAGAT CGGGAATTGC
3481 CAAGCTGCTT GGCACTGGCC GTCGTTTTAC AACGTCGTGA CTGGAAAACC CTGGCGTTAC
3541 CCAACTTAAT CGCCTTGCAG CACATCCCCC TTTCGCCAGC TGGCGTAATA GCGAAGAGGC
3601 CCGCACCGAT CGCCCTTCCC AACAGTTGCG CAGCCTGAAT GGCGAATGGC GCGAAATTGT
3661 AAACGTTAAT GTTAACGTTA CACCACAATA TATCCTGCCA AGATCTCATG TGAGCAAAAG
3721 GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC
3781 GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA GAGGTGGCGA AACCCGACAG
3841 GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA
3901 CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC
3961 ATAGCTCACG CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG
4021 TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT
4081 CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA
4141 GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA
4201 CTAGAAGGAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG
4261 TTGGTAGCTC TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA
4321 AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG
4381 GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT TTTGGTCATG GTTACAACCA
4441 ATTAACCAAT TCTGATTAGA AAAACTCATC GAGCATCAAA TGAAACTGCA ATTTATTCAT
4501 ATCAGGATTA TCAATACCAT ATTTTTGAAA AAGCCGTTTC TGTAATGAAG GAGAAAACTC
4561 ACCGAGGCAG TTCCATAGGA TGGCAAGATC CTGGTATCGG TCTGCGATTC CGACTCGTCC
4621 AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC GTCAAAAATA AGGTTATCAA GTGAGAAATC
4681 ACCATGAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA TGGCAAAAGT TTATGCATTT CTTTCCAGAC
4741 TTGTTCAACA GGCCAGCCAT TACGCTCGTC ATCAAAATCA CTCGCATCAA CCAAACCGTT
4801 ATTCATTCGT GATTGCGCCT GAGCGAGACG AAATACGCGA TCGCTGTTAA AAGGACAATT
4861 ACAAACAGGA ATCGAATGCA ACCGGCGCAG GAACACTGCC AGCGCATCAA CAATATTTTC
4921 ACCTGAATCA GGATATTCTT CTAATACCTG GAATGCTGTT TTCCCTGGGA TCGCAGTGGT
4981 GAGTAACCAT GCATCATCAG GAGTACGGAT AAAATGCTTG ATGGTCGGAA GAGGCATAAA
5041 TTCCGTCAGC CAGTTTAGTC TGACCATCTC ATCTGTAACA TCATTGGCAA CGCTACCTTT
5101 GCCATGTTTC AGAAACAACT CTGGCGCATC GGGCTTCCCA TACAATCCAT AGATTGTCGC
5161 ACCTGATTGC CCGACATTAT CGCGAGCCCA TTTATACCCA TATAAATCAG CATCCATGTT
5221 GGAATTTAAT CGCGGCCTGG AGCAAGACGT TTCCCGTTGA ATATGGCTCA TAACACCCCT
5281 TGTATTACTG TTTATGTAAG CAGACAGTTT TATTGTTCAT GATGATATAT TTTTATCTTG
5341 TGCAATGTAA CATCAGAGAT TTTGAGACAC AACGTGGCTT TGTTGAATAA ATCGAACTTT
5401 TGCTGAGTTG AAGGATCAGA TCACGCATCT TCCCGACAAC GCAGACCGTT CCGTGGCAAA
5461 GCAAAAGTTC AAAATCACCA ACTGGTCCAC CTACAACAAA GCTCTCATCA ACCGTGCTCC
5521 CTCACTTTCT GGCTGGATGA TGGGGCGATT CAGGCGATCC CCATCCAACA GCCCGCCGTC
5581 GAGCGGGCT

PTV00里的35s启动子序列与PBI121里的35s启动子序列不完全一致？

(5' to 3') SpeI, BamHI, SmaI, XmaI, HindIII, BspDI, ClaI, AccI, ApaI and KpnI.

内切酶图谱分析：

List by Site Order
42 PmaCI 1005 BstXI 2564 SmaI 3248 AflII
42 Eco72I 1011 EcoICRI 2572 PstI 3339 NsiI
94 BstD102I 1011 Ecl136II 2574 EcoRI 3419 BssHII
111 Eco72I 1013 SstI 2582 EcoRV 3443 BssHII
111 PmaCI 1013 SacI 2586 HindIII 3579 PvuII
177 Eco72I 1179 BsiI 2593 ClaI 3610 XorII
177 PmaCI 1205 XmnI 2601 SalI 3610 PvuI
202 Eco72I 1208 BbvII 2607 XhoI 3629 MstI
202 PmaCI 1208 Bsc91I 2609 SciI 3639 BglI
431 EagI 1211 Bsc91I 2620 ApaI 3663 AclI
431 Eco52I 1211 BbvII 2622 Acc65I 3673 HpaI
431 XmaIII 1245 EcoRV 2622 Asp718I 3675 AclI
433 Eco56I 1490 SspI 2626 KpnI 3701 BglII
435 XmaIII 1520 SunI 2656 BssHII 3814 DrdI
435 NaeI 1520 SplI 2750 PvuII 3879 BsiI
435 EagI 1593 Bsc91I 2781 XorII 4020 Alw44I
435 Eco52I 1593 BbvII 2781 PvuI 4020 ApaLI
436 RleAI 1706 PacI 2851 AhaIII 4122 AlwNI
437 FseI 2078 Tth111I 2851 DraI 4254 Eco57I
489 BglI 2094 NdeI 2852 Eco57I 4579 PflMI
534 BglII 2159 Eco57I 2934 AhaIII 4638 VspI
591 StuI 2211 BsmI 2934 DraI 4727 NsiI
666 BstD102I 2229 SspI 2990 Eam1105I 4841 XorII
712 SapI 2274 ScaI 3108 ScaI 4841 PvuI
767 VspI 2321 Bsc91I 3114 AhaIII 4880 BsmI
775 PvuII 2321 BbvII 3114 DraI 4914 SspI
826 VspI 2321 Bsp1407I 3162 SnaBI 4926 EcoNI
907 BstD102I 2428 XmnI 3180 XhoI 4957 BsmI
995 EcoICRI 2455 PvuII 3182 SciI 4993 NsiI
995 Ecl136II 2485 PflMI 3190 EcoRI 5182 NruI
997 SstI 2510 AvrII 3200 PstI 5182 SpoI
997 SacI 2550 SpeI 3206 SphI 5317 BspHI
1002 Mlu113I 2556 BamHI 3221 PvuI 5373 DraIII
1004 SacII 2562 XmaI 3221 XorII 5583 BstD102I
1004 SstII

Restriction analysis on DNAMAN1

BamHI 1 G/GATCC 2556
SalI 1 G/TCGAC 2601

Fragments generated by digestion (bp):
Circular DNA:
Cut by BamHI : 5589
Cut by SalI : 5589
Double digestion: 45, 5544
Linear DNA:
Cut by BamHI : 2556, 3033
Cut by SalI : 2601, 2988
Double digestion: 45, 2556, 2988